郭錦榮,朱立新,彭壘,張鞠華,周芬敏,陸瑞峰

上海健康醫(yī)學院附屬周浦醫(yī)院,上海 201318

高脂血癥是指由于脂肪代謝或功能異常導致血液中的脂質(zhì)或脂蛋白水平異常升高,其病因主要包括飲食失調(diào)、肥胖、遺傳性疾病(如家族性高膽固醇血癥)或其他疾病(如糖尿病)[1]。高脂血癥的主要特征是高密度脂蛋白水平降低,總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)水平升高。臨床研究表明,高脂血癥在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用[2-3]。臨床上,高脂血癥的治療藥物包括他汀類藥物、貝特類藥物、膽酸螯合劑和煙酸等[4-6]。盡管這些降血脂藥物能有效降低血脂水平,但長期使用可能會引起諸多不良反應,如腹脹、腹瀉、肌肉無力、肌肉溶解等[7]。因此,研發(fā)新型降血脂藥物預防和治療高脂血癥迫在眉睫。

研究表明,炎癥反應與早期動脈壁脂質(zhì)沉積密切相關[8],且在高脂血癥進展中扮演著重要角色[9-10]。LDL是體內(nèi)運輸內(nèi)源性膽固醇的主要載體,其水平升高可通過調(diào)節(jié)白細胞活性、干擾細胞因子從而引發(fā)炎癥反應[11]。在這些復雜過程中,炎癥介質(zhì)大量產(chǎn)生,并參與血管內(nèi)皮損傷及斑塊形成[12-13]。研究證實,Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓樣分化因子 88(myeloid differentiation factor 88,MYD88) /核轉(zhuǎn)錄因子-κB (nuclear transcription factor-κB,NF-κB)通路在慢性炎癥、動脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用[14]。Toll樣受體是先天免疫系統(tǒng)中的模式識別受體,負責識別病原體及受損相關的分子模式,從而觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應[15]。TLR4是TLR家族中最早被發(fā)現(xiàn)的成員,與先天性免疫、代謝紊亂(如高脂血癥)密切相關[16]。TLR4 可被眾多外源性和內(nèi)源性危險信號分子激活[17-18],進而通過MYD88依賴性途徑傳遞信號,進一步激活NF-κB,最終促進炎癥因子如白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)釋放[19]。

降脂通脈飲具有補虛祛邪、化解痰濁血瘀之功效[20]。該方治療高脂血癥的臨床療效顯著,目前尚不清楚其作用機制是否與TLR4/MYD88/NF-κB通路有關。本研究擬采用高脂飼料喂養(yǎng)的方式建立高脂血癥大鼠模型,并觀察降脂通脈飲對大鼠血脂及TLR4/MYD88/NF-κB通路的影響,以期為高脂血癥的臨床治療提供基礎依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠15只,6周齡,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號：SCXK(京)2012-0001。動物飼養(yǎng)于上海健康醫(yī)學院分子生物學實驗室 SPF級動物房,環(huán)境溫度25 ℃,相對濕度60%,12 h/12 h晝夜明暗交替。本研究經(jīng)過上海浦東新區(qū)周浦醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(倫理審批號：ZPYYLL-2018-02)。

1.2 藥物與試劑降脂通脈飲(茶樹根、制首烏、山楂、澤瀉、黃精、陳皮、半夏、益母草等,北京康仁堂藥業(yè)有限公司制備顆粒劑,批號：23012031);qPCR試劑盒(諾唯贊,貨號：R223-01);TLR4抗體、MYD88抗體(Abcam,貨號：ab22048、ab219413);NF-κB抗體(Cell Signaling Technology,貨號：8242);GAPDH抗體、ECL化學發(fā)光液(碧云天生物,貨號：AF0006、P0018S);TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、干擾素-γ(interferon gamma,IFN-γ)試劑盒(碧云天生物,貨號：PC125、PT512、PI508)。

1.3 儀器實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司,型號：ABI7900);垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠,型號：DYCZ-24DN、DYCZ-40);離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司,型號：HI650);水平電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司,型號：JY300);電熱恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表有限公司,型號：HW-SY11-KP2);全自動生化儀(邁瑞,型號：BS-350S)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥從15只SD大鼠中隨機選取3只作為空白組,其余大鼠給予高脂飼料2周建立高脂血癥模型,高脂飼料由81.3%普通飼料、10%豬油、5%白糖、3%膽固醇、0.5%膽鹽和0.2%甲硫氧嘧啶組成。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、降脂通脈飲低劑量組(1.56 mg·kg-1)、降脂通脈飲中劑量組(3.13 mg·kg-1)、降脂通脈飲高劑量組(6.25 mg·kg-1),每組各3只,藥物組給予相應劑量降脂通脈飲灌胃,空白組和模型組給予生理鹽水灌胃(10 mL·kg-1),每日1次,持續(xù)8周。灌胃期間,空白組給予普通飼料,其余各組給予高脂飼料。

2.2 樣本制備末次灌胃后,大鼠禁食12 h,腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(45 mg·kg-1)麻醉,頸動脈采血,冰上放置2 h,3 500 r·min-1離心10 min,取上清,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血脂水平檢測全自動生化儀檢測大鼠血清血脂水平,包括TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平。

2.4 ELISA檢測血清炎癥因子含量根據(jù)試劑盒說明書的步驟進行操作,檢測各組大鼠血清MCP-1、TNF-α、IFN-γ含量,每個樣品設3個復孔。

2.5 qPCR檢測頸動脈組織TLR4mRNA、MYD88mRNA、NF-κBmRNA表達情況用Trizol試劑提取頸動脈組織總RNA,紫外分光光度計檢測RNA含量;逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA,反轉(zhuǎn)錄體系：HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ(5×)4 μL、RNA (1 000/CRNA),RNase free ddH2O(16-VRNA)補足體系至 20 μL,反應條件：37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ ∞,4 ℃ 保存;qPCR反應擴增體系：SYBRTMGreen Master Mix 5 μL、上游和下游引物各0.4 μL、cDNA 0.6 μL,RNase free ddH2O 3.6 μL,擴增條件：95 ℃ 2 min、變性95 ℃ 20 s,退火15 s、延伸72 ℃ 30 s,循環(huán)40次。內(nèi)參基因選擇GAPDH,每個樣品設3個復孔,以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。使用Primer 5軟件設計引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物,引物序列見表1。

2.6 Western Blot檢測頸動脈組織TLR4、MYD88、NF-κB蛋白表達水平提取頸動脈組織總蛋白,采用考馬斯亮藍G-250檢測蛋白含量;配置SDS-PAGE 凝膠,上樣10 μg,電泳條件：60 V(30 min)-80 V(20 min)-120 V(10 min);轉(zhuǎn)膜條件：250 mA(90 min);5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,室溫孵育一抗(11 000)2 h,TBST洗膜3次,每次 5 min;室溫孵育二抗(15 000)2 h,TBST洗膜3次,每次5 min;配置ECL化學發(fā)光液,在Amersham Imager 600 曝光機下掃描蛋白條帶并拍照,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH作為內(nèi)參蛋白,計算目的蛋白的相對表達量。

3 結(jié)果

3.1 降脂通脈飲對各組大鼠血脂水平的影響與空白組比較,模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.01);與模型組比較,降脂通脈飲低劑量、中劑量、高劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.05);各組大鼠血清HDL-C水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖1。

注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3.2 降脂通脈飲對各組大鼠血清炎癥因子含量的影響與空白組比較,模型組大鼠血清MCP-1、TNF-α、IFN-γ含量升高(P<0.01);與模型組比較,降脂通脈飲中劑量、高劑量組大鼠血清MCP-1、TNF-α、IFN-γ含量降低(P<0.05),降脂通脈飲低劑量組大鼠血清TNF-α、IFN-γ含量降低(P<0.05),見圖2。

注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3.3 降脂通脈飲對各組大鼠頸動脈組織TLR4mRNA、MYD88mRNA、NF-κBmRNA水平的影響與空白組比較,模型組大鼠TLR4mRNA、MYD88mRNA、NF-κBmRNA表達水平升高(P<0.01);與模型組比較,降脂通脈飲低劑量、中劑量、高劑量組大鼠TLR4mRNA、MYD88mRNA、NF-κBmRNA表達水平降低(P<0.05),見圖3。

注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3.4 降脂通脈飲對各組大鼠頸動脈組織TLR4、MYD88、NF-κB蛋白表達水平的影響與空白組比較,模型組大鼠TLR4、MYD88、NF-κB蛋白表達水平升高(P<0.01);與模型組比較,降脂通脈飲中劑量、高劑量組大鼠TLR4、MYD88、NF-κB蛋白表達水平降低(P<0.05,P<0.01),見圖4。

注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

4 討論

近年來,由于高膽固醇攝入、缺乏鍛煉等原因,高脂血癥患者急劇增加[21]。大量研究表明,高脂血癥的發(fā)病機制包括炎癥反應、氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等[22-23]。過量攝入高脂飲食可能引發(fā)血脂代謝紊亂和慢性炎癥,進而加劇動脈管腔狹窄[24-25]。同時,高脂肪和高膽固醇飲食會導致血清TC和游離脂肪酸水平升高,從而引發(fā)全身氧化應激和炎癥狀態(tài)[26]。臨床研究證實,高脂血癥是引發(fā)冠狀動脈粥樣硬化、心力衰竭、心肌炎的主要危險因素之一[27]。因此,高脂血癥的治療目的不僅是糾正血脂水平異常,還要預防動脈粥樣硬化,最終降低動脈粥樣硬化性疾病的發(fā)病率和病死率。

在中醫(yī)學中,高脂血癥歸屬于“痰濁”“眩暈”等范疇,其發(fā)病主要與肝、腎、脾三臟功能失調(diào)有關。由于日常飲食無所節(jié)制,加之七情傷勞,可能導致正虛痰瘀的病理狀態(tài)。治療時應注意標本兼治,臨床多采用調(diào)理脾胃、滋養(yǎng)肝腎治本,化痰逐瘀、理氣化濁治標的方法。臨床研究表明,降脂通脈飲可有效調(diào)節(jié)患者血脂水平,并改善相關癥狀。本研究采用高脂飲食建立高脂血癥模型,其模擬人類的異常脂質(zhì)代謝狀態(tài),是研究降脂藥物藥理作用的良好模型[28]。實驗結(jié)果表明,降脂通脈飲可降低高脂血癥大鼠血脂水平,其療效與臨床觀察相符。

多項研究表明,TLR4/MYD88/NF-κB通路在慢性炎癥、動脈粥樣硬化以及調(diào)控心肌組織炎癥反應中起重要作用[14,29-30]。Toll樣受體,特別是TLR4,是當前研究最為深入的模式識別受體之一。TLR4在促進動脈粥樣硬化中起關鍵作用,研究表明TLR4的全身缺失可抑制高膽固醇血癥誘導的動脈粥樣硬化[14]。MYD88作為TLR4信號通路的主要適配分子之一[31-32],其功能失活可通過減少巨噬細胞對動脈壁的募集及降低趨化因子水平從而緩解動脈粥樣硬化[15]。在炎癥狀態(tài)下,TLR4/MYD88信號的激活會導致下游NF-κB激活,因此TLR4/MYD88/NF-κB通路是高脂血癥引起炎癥反應的關鍵通路。本研究中,模型組大鼠頸動脈組織TLR4、MYD88、NF-κB蛋白表達水平降低,而降脂通脈飲大鼠TLR4、MYD88、NF-κB蛋白表達水平升高。由此說明,降脂通脈飲可有效抑制TLR4/MYD88/NF-κB通路,從而緩解炎癥反應。

綜上所述,降脂通脈飲可降低高脂血癥大鼠血脂水平,其機制可能與抑制TLR4/MYD88/NF-κB通路,從而減輕炎癥反應有關。