鄭雪群 李文怡 蘭麗芳

(柳州市人民醫(yī)院婦科,廣西 柳州 545000)

子宮內(nèi)膜癌是常見的女性惡性腫瘤疾病,具有較高的發(fā)病率,預后較差〔1,2〕。子宮內(nèi)膜癌患者復發(fā)率高和預后差主要是由于腫瘤細胞的侵襲和轉移〔3〕。近期,高遷移率族核小體結合域(HMGN)5成為研究熱點,研究發(fā)現(xiàn)HMGN5蛋白在前列腺癌、膀胱癌及乳腺癌中均有較高的表達,而且與神經(jīng)膠質瘤及胃腸道腫瘤大發(fā)生發(fā)展相關,但是針對HMGN5與子宮內(nèi)膜癌患者的相關性及與癌細胞侵襲轉移相關性研究較少〔4,5〕。本研究分析HMGN5基因在不同臨床特征下表達差異及其對腫瘤細胞生物學行為的影響。

1 資料與方法

1.1基本資料 選擇柳州市人民醫(yī)院2020年1月到2021年6月收治的子宮內(nèi)膜癌患者79例,均進行根治性切除術,患者年齡平均(54.8±9.2)歲,其中存在淋巴轉移患者14例,高、中、低分化患者分別有40、25、14例,國際婦產(chǎn)科學聯(lián)合會(FIGO)分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別有45、16、12、6例。

患者納入標準:(1)均經(jīng)過組織病理診斷;(2)術前均沒有接受過放化療治療。排除標準:(1)重要器官嚴重障礙;(2)精神障礙;(3)同時患有其他類型腫瘤;(4)臨床資料不全。本研究已獲得倫理審批;患者或其家屬均已自愿簽訂知情同意書。

1.2試劑和儀器 胎牛血清(批號:1907128)、胰蛋白酶(批號:1978483)、DMEM培養(yǎng)基(批號:8119335)由美國Sigma公司提供,人子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞由科院上海生物細胞庫提供,Trizol試劑盒(批號,20191108)購自美國Invitrogen公司,聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒(批號:20181106)和反轉錄(RT)試劑盒(批號:18021803)購自日本TaKaRa公司,β-actin(批號:18120736)和HMGN5(批號:19208371)由上海生工生物工程股份有限公司提供,HMGN5對照序列(批號:19-W-190932)和干擾序列(19-W-191023)由上海瑞賽生物技術公司提供,CCK-8試劑盒(批號:19111863)由美國Promega公司提供,基質膠(批號:19091284)和Transwell小室(批號:12319042)由美國BD公司提供。

1.3HMGN5 mRNA表達量檢測 取子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織,勻漿、裂解、離心處理后,提取總RNA,而后按照試劑盒說明反轉錄cDNA,應用RT-PCR法測定HMGN5 mRNA的表達情況(相對量)。反應體系配制:10 mmol/L的上下游引物0.5 μl(HMGN5上游引物:5′-TACAACAATGCC-CAAAAGAAAGGCT-3′,下游5′-TGTAACTGGCACAAGCATAGCAGA-3′;β-actin上游引物:5′-CCACACCTTCTACAATGAGC-3′,下游5′-TGAGGTAGTC-AGTCAGGTCC-3′)。加入含SYBR Green Ⅰ (12.5 μl),cDNA(0.5 μl),RoxⅡ(0.5 μl)及滅菌水(11.0 μl)的混合溶液中。擴增循環(huán)參數(shù)設置:3 min 95 ℃,15 s 95 ℃,30 s 58 ℃,30 s 73 ℃,共進行38個循環(huán),10 min 72 ℃。應用2-△△Ct法計算HMGN5 mRNA相對表達量。

1.4細胞培養(yǎng) HEC-1A細胞復蘇后在10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)集中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃,5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱,待細胞長至80%～90%時用胰酶消化進行傳代。取對數(shù)期細胞隨機將其分為HMGN5促進組〔轉染NMGN5干擾序列(正義鏈:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGACAATT-3′)〕、HMGN5正常組〔轉染HMGN5干擾對照序列(正義鏈5′-CACAGCCTTTCTTTAGCATTT-3′,反義鏈5′-GTGTCGGAAAGAAATCGTATT-3′)〕和空白對照組(不做處理),轉染48 h。

1.5HEC-1A細胞中HMGN5 mRNA表達 將細胞裂解液分別加入3組細胞中,總RNA提取、cDNA反轉錄、RT-PCR及HMGN5 mRNA相對表達量檢測方法同1.4。

1.6細胞增殖檢測 將3組細胞(100 μl)接種于96孔板中,細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后轉染48和96 h,然后加入CCK-8液進行阻斷,應用酶標儀檢測450 nm波長處OD值。

1.7細胞遷移檢測 將HEC-1A細胞進行胰蛋白酶消化后接種于6孔板,垂直板底畫一條直線,沖洗掉滑落細胞,然后加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)0、12和24 h后,用倒置顯微鏡拍照并用ImageJ軟件計算劃痕愈合率(基線劃痕寬度與檢測時間點劃痕寬度差值/基線劃痕寬度)。

1.8細胞侵襲檢測 應用無血清培養(yǎng)液對基質膠進行稀釋,鋪于Transwell小室,備用。將轉染48 h細胞轉移到Transwell小室上室,下室中加入20%胎牛血清的培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h,沖洗后進行固定,加入結晶紫孵育30 min進行染色,高倍顯微鏡下隨機選5個視野,計算細胞數(shù)。

1.9統(tǒng)計學分析 應用SPSS20.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、方差分析和LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1不同組織HMGN5 mRNA相對表達比較 子宮內(nèi)膜癌組織HMGN5 mRNA相對表達量(4.56±0.32)顯著高于癌旁組織(1.34±0.26,n=79;t=37.21,P<0.01)。

2.2HMGN5在不同臨床特征下表達情況比較 不同年齡、FIGO分期、分化程度、淋巴結轉移與否及基層浸潤程度組間的HMGN5的相對表達量均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表1。

表1 HMGN5表達與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征關系

2.3HEC-1A細胞HMGN5 mRNA相對表達量及增殖活力比較 轉染后,與空白對照組和HMGN5正常表達組相比,HMGN5 促進組具有較高的HMGN5 mRNA的表達量及增殖活力OD值,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 HEC-1A細胞不同HMGN5 mRNA相對表達量及細胞增殖活力

2.4HEC-1A細胞遷移及侵襲能力對比 與空白對照組和HMGN5正常表達組相比,HMGN5促進組轉染培養(yǎng)12和24 h劃痕愈合率和侵襲細胞數(shù)量均顯著較高(P<0.05)。見表3,圖1。

表3 HEC-1A細胞遷移及侵襲能力

圖1 各組HEC-1A細胞遷移、侵襲

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌在絕經(jīng)后女性中發(fā)病率較高,伴隨著診療技術的不斷提高,子宮內(nèi)膜癌患者的5 年生存率也逐漸升高,但是也有部分低分化及轉移患者會出現(xiàn)預后不佳的情況〔6,7〕。前期研究表明,患者絕經(jīng)時間、月經(jīng)初潮時間及雌激素水平等均是子宮內(nèi)膜癌的危險因素〔8〕。臨床上子宮內(nèi)膜癌的主要治療方式是手術治療,化療和放療等治療方式常作為輔助治療,但是治療效果一般〔9〕。

前期研究顯示,HMGN5基因在多種人類腫瘤中均呈現(xiàn)異常高表達;另有文獻顯示抑制HMGN5基因的表達可以明顯抑制前列腺癌細胞的增殖〔10,11〕;激活HMGN5基因后,會顯著促進膀胱癌細胞的增殖及侵襲〔12,13〕;抑制HMGN5基因的表達后,腎癌細胞及肺癌細胞的增長和侵襲顯著降低〔14,15〕;另有研究顯示,HMGN5基因在乳腺癌患者的癌癥組織中呈現(xiàn)高表達,且可以促進乳腺癌細胞的侵襲和增殖〔16,17〕;骨肉瘤研究發(fā)現(xiàn),抑制HMGN5基因的表達后對細胞周期具有阻滯作用,且對阿霉素誘導細胞凋亡的敏感性具有一定的抑制作用〔18,19〕。但是HMGN5基因在子宮內(nèi)膜癌中的表達和作用還未有明確研究〔20〕。本研究提示,HMGN5表達上調與子宮內(nèi)膜癌的病情進展相關,前期研究也表明,HMGN5所誘導的轉錄變化和細胞核小體的相互作用相關,該蛋白的異常表達和致瘤性增加相關,是一種強有力的原癌基因〔21〕。

本研究結果表明,提高HMGN5基因表達會促進人子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞增殖;HMGN5基因能夠促進人子宮內(nèi)膜癌的侵襲和遷移能力;HMGN5基因在人子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展過程中具有關鍵作用,HMGN5與細胞內(nèi)染色質纖維完整性有相關性,其表達異常會損害細胞,參與腫瘤發(fā)生與發(fā)展。前期研究〔22〕與本研究結果相吻合,在正常肺組織中HMGN5低表達,而在肺癌細胞中相對高表達。對細胞中HMGN5基因進行抑制后,對肺癌LRNAI(-)aP細胞系生長有著明顯抑制作用,其能夠降低G2/M+S期細胞數(shù)量。

綜上,人子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織中HMGN5呈現(xiàn)較高表達,對HMGN5基因進行促進對人子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞的增殖、遷移和侵襲有明顯促進作用。HMGN5能夠作為促癌基因在人子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著舉足輕重的作用,其可能成為治療子宮內(nèi)膜癌靶向的靶點,但是仍需要深入研究HMGN5對人子宮內(nèi)膜癌的具體作用機制。