鄭雪群 李文怡 蘭麗芳

(柳州市人民醫(yī)院婦科,廣西 柳州 545000)

子宮內(nèi)膜癌是常見的女性惡性腫瘤疾病,具有較高的發(fā)病率,預(yù)后較差〔1,2〕。子宮內(nèi)膜癌患者復(fù)發(fā)率高和預(yù)后差主要是由于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔3〕。近期,高遷移率族核小體結(jié)合域(HMGN)5成為研究熱點(diǎn),研究發(fā)現(xiàn)HMGN5蛋白在前列腺癌、膀胱癌及乳腺癌中均有較高的表達(dá),而且與神經(jīng)膠質(zhì)瘤及胃腸道腫瘤大發(fā)生發(fā)展相關(guān),但是針對(duì)HMGN5與子宮內(nèi)膜癌患者的相關(guān)性及與癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)性研究較少〔4,5〕。本研究分析HMGN5基因在不同臨床特征下表達(dá)差異及其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 資料與方法

1.1基本資料 選擇柳州市人民醫(yī)院2020年1月到2021年6月收治的子宮內(nèi)膜癌患者79例,均進(jìn)行根治性切除術(shù),患者年齡平均(54.8±9.2)歲,其中存在淋巴轉(zhuǎn)移患者14例,高、中、低分化患者分別有40、25、14例,國際婦產(chǎn)科學(xué)聯(lián)合會(huì)(FIGO)分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別有45、16、12、6例。

患者納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均經(jīng)過組織病理診斷;(2)術(shù)前均沒有接受過放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)重要器官嚴(yán)重障礙;(2)精神障礙;(3)同時(shí)患有其他類型腫瘤;(4)臨床資料不全。本研究已獲得倫理審批;患者或其家屬均已自愿簽訂知情同意書。

1.2試劑和儀器 胎牛血清(批號(hào):1907128)、胰蛋白酶(批號(hào):1978483)、DMEM培養(yǎng)基(批號(hào):8119335)由美國Sigma公司提供,人子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞由科院上海生物細(xì)胞庫提供,Trizol試劑盒(批號(hào),20191108)購自美國Invitrogen公司,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒(批號(hào):20181106)和反轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒(批號(hào):18021803)購自日本TaKaRa公司,β-actin(批號(hào):18120736)和HMGN5(批號(hào):19208371)由上海生工生物工程股份有限公司提供,HMGN5對(duì)照序列(批號(hào):19-W-190932)和干擾序列(19-W-191023)由上海瑞賽生物技術(shù)公司提供,CCK-8試劑盒(批號(hào):19111863)由美國Promega公司提供,基質(zhì)膠(批號(hào):19091284)和Transwell小室(批號(hào):12319042)由美國BD公司提供。

1.3HMGN5 mRNA表達(dá)量檢測 取子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織,勻漿、裂解、離心處理后,提取總RNA,而后按照試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄cDNA,應(yīng)用RT-PCR法測定HMGN5 mRNA的表達(dá)情況(相對(duì)量)。反應(yīng)體系配制:10 mmol/L的上下游引物0.5 μl(HMGN5上游引物:5′-TACAACAATGCC-CAAAAGAAAGGCT-3′,下游5′-TGTAACTGGCACAAGCATAGCAGA-3′;β-actin上游引物:5′-CCACACCTTCTACAATGAGC-3′,下游5′-TGAGGTAGTC-AGTCAGGTCC-3′)。加入含SYBR Green Ⅰ (12.5 μl),cDNA(0.5 μl),RoxⅡ(0.5 μl)及滅菌水(11.0 μl)的混合溶液中。擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)設(shè)置:3 min 95 ℃,15 s 95 ℃,30 s 58 ℃,30 s 73 ℃,共進(jìn)行38個(gè)循環(huán),10 min 72 ℃。應(yīng)用2-△△Ct法計(jì)算HMGN5 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) HEC-1A細(xì)胞復(fù)蘇后在10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)集中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃,5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱,待細(xì)胞長至80%～90%時(shí)用胰酶消化進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞隨機(jī)將其分為HMGN5促進(jìn)組〔轉(zhuǎn)染NMGN5干擾序列(正義鏈:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGACAATT-3′)〕、HMGN5正常組〔轉(zhuǎn)染HMGN5干擾對(duì)照序列(正義鏈5′-CACAGCCTTTCTTTAGCATTT-3′,反義鏈5′-GTGTCGGAAAGAAATCGTATT-3′)〕和空白對(duì)照組(不做處理),轉(zhuǎn)染48 h。

1.5HEC-1A細(xì)胞中HMGN5 mRNA表達(dá) 將細(xì)胞裂解液分別加入3組細(xì)胞中,總RNA提取、cDNA反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR及HMGN5 mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測方法同1.4。

1.6細(xì)胞增殖檢測 將3組細(xì)胞(100 μl)接種于96孔板中,細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后轉(zhuǎn)染48和96 h,然后加入CCK-8液進(jìn)行阻斷,應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處OD值。

1.7細(xì)胞遷移檢測 將HEC-1A細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化后接種于6孔板,垂直板底畫一條直線,沖洗掉滑落細(xì)胞,然后加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)0、12和24 h后,用倒置顯微鏡拍照并用ImageJ軟件計(jì)算劃痕愈合率(基線劃痕寬度與檢測時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度差值/基線劃痕寬度)。

1.8細(xì)胞侵襲檢測 應(yīng)用無血清培養(yǎng)液對(duì)基質(zhì)膠進(jìn)行稀釋,鋪于Transwell小室,備用。將轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Transwell小室上室,下室中加入20%胎牛血清的培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h,沖洗后進(jìn)行固定,加入結(jié)晶紫孵育30 min進(jìn)行染色,高倍顯微鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野,計(jì)算細(xì)胞數(shù)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同組織HMGN5 mRNA相對(duì)表達(dá)比較 子宮內(nèi)膜癌組織HMGN5 mRNA相對(duì)表達(dá)量(4.56±0.32)顯著高于癌旁組織(1.34±0.26,n=79;t=37.21,P<0.01)。

2.2HMGN5在不同臨床特征下表達(dá)情況比較 不同年齡、FIGO分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及基層浸潤程度組間的HMGN5的相對(duì)表達(dá)量均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 HMGN5表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征關(guān)系

2.3HEC-1A細(xì)胞HMGN5 mRNA相對(duì)表達(dá)量及增殖活力比較 轉(zhuǎn)染后,與空白對(duì)照組和HMGN5正常表達(dá)組相比,HMGN5 促進(jìn)組具有較高的HMGN5 mRNA的表達(dá)量及增殖活力OD值,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 HEC-1A細(xì)胞不同HMGN5 mRNA相對(duì)表達(dá)量及細(xì)胞增殖活力

2.4HEC-1A細(xì)胞遷移及侵襲能力對(duì)比 與空白對(duì)照組和HMGN5正常表達(dá)組相比,HMGN5促進(jìn)組轉(zhuǎn)染培養(yǎng)12和24 h劃痕愈合率和侵襲細(xì)胞數(shù)量均顯著較高(P<0.05)。見表3,圖1。

表3 HEC-1A細(xì)胞遷移及侵襲能力

圖1 各組HEC-1A細(xì)胞遷移、侵襲

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌在絕經(jīng)后女性中發(fā)病率較高,伴隨著診療技術(shù)的不斷提高,子宮內(nèi)膜癌患者的5 年生存率也逐漸升高,但是也有部分低分化及轉(zhuǎn)移患者會(huì)出現(xiàn)預(yù)后不佳的情況〔6,7〕。前期研究表明,患者絕經(jīng)時(shí)間、月經(jīng)初潮時(shí)間及雌激素水平等均是子宮內(nèi)膜癌的危險(xiǎn)因素〔8〕。臨床上子宮內(nèi)膜癌的主要治療方式是手術(shù)治療,化療和放療等治療方式常作為輔助治療,但是治療效果一般〔9〕。

前期研究顯示,HMGN5基因在多種人類腫瘤中均呈現(xiàn)異常高表達(dá);另有文獻(xiàn)顯示抑制HMGN5基因的表達(dá)可以明顯抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖〔10,11〕;激活HMGN5基因后,會(huì)顯著促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖及侵襲〔12,13〕;抑制HMGN5基因的表達(dá)后,腎癌細(xì)胞及肺癌細(xì)胞的增長和侵襲顯著降低〔14,15〕;另有研究顯示,HMGN5基因在乳腺癌患者的癌癥組織中呈現(xiàn)高表達(dá),且可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和增殖〔16,17〕;骨肉瘤研究發(fā)現(xiàn),抑制HMGN5基因的表達(dá)后對(duì)細(xì)胞周期具有阻滯作用,且對(duì)阿霉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性具有一定的抑制作用〔18,19〕。但是HMGN5基因在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)和作用還未有明確研究〔20〕。本研究提示,HMGN5表達(dá)上調(diào)與子宮內(nèi)膜癌的病情進(jìn)展相關(guān),前期研究也表明,HMGN5所誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化和細(xì)胞核小體的相互作用相關(guān),該蛋白的異常表達(dá)和致瘤性增加相關(guān),是一種強(qiáng)有力的原癌基因〔21〕。

本研究結(jié)果表明,提高HMGN5基因表達(dá)會(huì)促進(jìn)人子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞增殖;HMGN5基因能夠促進(jìn)人子宮內(nèi)膜癌的侵襲和遷移能力;HMGN5基因在人子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展過程中具有關(guān)鍵作用,HMGN5與細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)纖維完整性有相關(guān)性,其表達(dá)異常會(huì)損害細(xì)胞,參與腫瘤發(fā)生與發(fā)展。前期研究〔22〕與本研究結(jié)果相吻合,在正常肺組織中HMGN5低表達(dá),而在肺癌細(xì)胞中相對(duì)高表達(dá)。對(duì)細(xì)胞中HMGN5基因進(jìn)行抑制后,對(duì)肺癌LRNAI(-)aP細(xì)胞系生長有著明顯抑制作用,其能夠降低G2/M+S期細(xì)胞數(shù)量。

綜上,人子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織中HMGN5呈現(xiàn)較高表達(dá),對(duì)HMGN5基因進(jìn)行促進(jìn)對(duì)人子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有明顯促進(jìn)作用。HMGN5能夠作為促癌基因在人子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著舉足輕重的作用,其可能成為治療子宮內(nèi)膜癌靶向的靶點(diǎn),但是仍需要深入研究HMGN5對(duì)人子宮內(nèi)膜癌的具體作用機(jī)制。