劉薩仁 佟玉清 玉曉 張春花

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙醫(yī)內(nèi)分泌科,內(nèi)蒙古 通遼 028000)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥,導(dǎo)致終末期腎衰竭和糖尿病病死率增加的重要因素,該病治療費(fèi)用高且難度大。因此采取有效措施治療DN,具有重要的臨床意義。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣,炎癥因子在DN發(fā)病機(jī)制中起至關(guān)重要作用〔1〕。協(xié)日嘎-4湯是具有抗炎作用的傳統(tǒng)蒙藥制劑,本研究旨在觀察蒙藥協(xié)日嘎-4湯對(duì)DN大鼠血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、C反應(yīng)蛋白(CRP)含量及腎組織單核細(xì)胞趨化因子(MCP)-1表達(dá)的影響,探討蒙藥協(xié)日嘎-4湯對(duì)DN腎保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠雄性,體質(zhì)量(200±10)g,8周齡,購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXX(遼)2015-0001。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 BS-200邁瑞全自動(dòng)生化分析儀(深圳市永利鑫科技有限公司),羅氏卓越型血糖儀(上海三葳醫(yī)療設(shè)備有限公司),DW-GL218低溫冰箱,電子天平(AUY120日本島津),PCRYD-202AIII型冷凍切片機(jī)(河南鄭州南北儀器有限公司),DW-GL218低溫冰箱(上海能共實(shí)業(yè)有限公司),CKX-RFA熒光顯微鏡(上海普赫光電科技有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)藥物 鏈脲佐菌素(S17049-5 g,上海源葉生物技術(shù)有限公司)。蒙藥協(xié)日嘎-4湯(準(zhǔn)字號(hào):20180704,由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室)。依那普利片(準(zhǔn)字號(hào):H20083534,上海新亞藥業(yè)閔行有限公司)。0.05 ml/L pH4.4枸櫞酸鹽緩沖液(批準(zhǔn)字號(hào):R22479-500 ml,上海源葉生物技術(shù)有限公司)。尿蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海仁捷生物科技有限公司)。大鼠腎功能ELISA試劑盒(南京搏爾塞生物科技有限公司)。炎癥因子ELISA試劑盒(上海滬震實(shí)業(yè)有限公司)。

1.4動(dòng)物模型制備 60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后,隨機(jī)選10只大鼠作為正常對(duì)照組用普通飼料喂養(yǎng),其余50只高脂飼料喂養(yǎng)4 w,在空腹10 h狀態(tài)下腹腔注射鏈脲佐菌素50 mg/kg,72 h后尾靜脈取血,連續(xù)2次檢查血糖均>16.7 mmol/L為糖尿病模型復(fù)制成功,繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)2 w后連續(xù)2次檢查尿微量白蛋白30 mg/24 h以上時(shí)即為DN模型成功。

1.5分組及給藥方法 將造模成功的50只鼠隨機(jī)分為5組:模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、協(xié)日嘎-4湯低、中和高劑量組。陽(yáng)性對(duì)照組給予依那普利1.5 mg/(kg·d)灌胃,蒙藥協(xié)日嘎-4湯低、中、高劑量組分別給予協(xié)日嘎-4湯0.45、0.90、1.80 g/(kg·d)灌胃,正常對(duì)照組和模型組分別給予同等體積生理鹽水灌胃,每日1次,連續(xù)灌胃給藥8 w。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由進(jìn)食和飲水。每日測(cè)量1次大鼠尾靜脈血糖,如果血糖大于24 mmol/L時(shí)給予皮下注射長(zhǎng)效胰島素1～2 U,避免發(fā)生糖尿病急性并發(fā)癥而死亡。

1.6檢測(cè)指標(biāo) 治療8 w末次給藥后用代謝籠收集24 h尿液,記錄總尿量、監(jiān)測(cè)尿蛋白,各組均用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉,取腹主動(dòng)脈血,全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr),ELISA測(cè)定血清TNF-α、IL-6、CRP含量。蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察腎組織病理學(xué)變化。免疫組化(SP)法檢測(cè)MCP-1蛋白表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組24 h尿蛋白、血清BUN、Scr比較 與正常對(duì)照組比較,模型組24 h尿蛋白定量及血清BUN、Scr水平顯著升高(P<0.01);與模型組比較,各治療組24 h尿蛋白及血清BUN、Scr均明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見表1。

2.2各組血糖比較 與正常對(duì)照組比較,模型組空腹血糖(FBS)明顯升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組24 h尿蛋白定量及血清BUN、Scr的比較

2.3各組血清炎癥因子TNF-α、IL-6 、CRP比較 與正常對(duì)照組比較,模型組血清炎癥因子TNF-α、IL-6、CRP含量均明顯升高(P<0.01);與模型組比較,各治療組血清炎癥因子TNF-α、IL-6、CRP含量明顯下降(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 各組血清TNF-α、IL-6、CRP含量比較

2.4各組腎組織病理變化比較 正常對(duì)照組腎小球結(jié)構(gòu)清晰,形態(tài)正常,腎小管結(jié)構(gòu)清晰無(wú)管型;模型組腎小管可見上皮細(xì)胞較多空泡變性,腎小管管腔可見蛋白管型和細(xì)胞管型,腎小球基底膜增厚、系膜增生改變。陽(yáng)性對(duì)照組部分腎小管可見上皮細(xì)胞空泡變性及腎小球基底膜增厚、系膜增生改變。協(xié)日嘎-4湯低劑量組較多腎小管可見上皮細(xì)胞空泡變性及腎小球基底膜增厚,系膜增生改變。協(xié)日嘎-4湯中劑量組部分腎小管可見上皮細(xì)胞空化空泡變性及腎小球基底膜增厚、系膜增生改變。協(xié)日嘎-4湯高劑量組偶見腎小管上皮細(xì)胞空泡變性及腎小球基底膜增厚、系膜增生改變。腎臟損傷程度由重到輕依次為模型>低劑量組>中劑量組>陽(yáng)性對(duì)照組>高劑量組。見圖1。

圖1 各組腎組織病理(HE染色,×400)

2.5各組腎組織MCP-1表達(dá)比較 5組腎組織MCP-1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=5,F=7.632,P<0.01);正常對(duì)照組腎組織MCP-1表達(dá)(0.16±0.01)極少,與模型組(0.46±0.06)比較,陽(yáng)性對(duì)照組、協(xié)日嘎-4湯低、中、高劑量組腎組織MCP-1表達(dá)顯著降低(0.26±0.05、0.28±0.05、0.25±0.05、0.22±0.02,P<0.05,P<0.01)。見圖2。

圖2 各組腎組織MCP-1表達(dá)(SP,×400)

3 討 論

DN的發(fā)生涉及多種因素,如遺傳因子、腎小球超濾、氧化應(yīng)激、晚期糖基化終末產(chǎn)物蓄積、蛋白激酶C活化、多元醇通路激活、細(xì)胞因子及炎癥反應(yīng)等〔2〕。近年來(lái),許多實(shí)驗(yàn)和臨床研究〔3～5〕均證實(shí),炎癥在DN發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用,高血糖、非酶糖化與晚期糖基化終末產(chǎn)物的生成、血管緊張素-Ⅱ、氧化應(yīng)激反應(yīng)等激活腎臟局部的炎癥細(xì)胞,活化的炎癥細(xì)胞及其釋放的各種炎癥因子如TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1等引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化,導(dǎo)致腎血管收縮和腎組織損傷。MCP-1通過(guò)刺激炎癥介質(zhì)IL-1,IL-6、TNF-α釋放,產(chǎn)生氧自由基,發(fā)生炎癥反應(yīng),促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞變性壞死、腎小球系膜細(xì)胞增生增殖,加速腎小球硬化,從而促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展〔6〕。

蒙藥協(xié)日嘎-4湯是古籍文獻(xiàn)所記載的傳統(tǒng)蒙藥方劑,廣泛應(yīng)用于防治腎臟、膀胱和尿路疾病等。具有抑菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、利尿、鎮(zhèn)痛作用〔7〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)協(xié)日嘎-4湯具有降低DN患者24 h尿微量白蛋白及改善腎功能作用〔8〕。協(xié)日嘎-4湯由姜黃、黃柏、蒺藜、梔子四味藥組成。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)黃柏具有降血糖、抗炎、解熱、抗氧化作用〔9〕。姜黃主要成分姜黃素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎抗菌、降血糖等藥理作用。其抗炎作用可能是與抑制NF-κB信號(hào)通路,減少TNF-α的分泌有關(guān)〔10～12〕。劉毅等〔13〕通過(guò)姜黃素對(duì)慢性不可預(yù)知性刺激誘發(fā)小鼠腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究,證實(shí)姜黃素具有降低炎性浸潤(rùn),保護(hù)腎功能作用。梔子苷也具有抗炎、抗氧化、降血脂和降血糖等多種藥理活性,尤其通過(guò)降低IL-1β、TNF-α水平,減少炎癥遞質(zhì)和炎癥因子的產(chǎn)生,調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路發(fā)揮抗感染和免疫調(diào)節(jié)作用〔14〕。

本研究結(jié)果提示,協(xié)日嘎-4味湯能延緩DN大鼠腎臟損傷進(jìn)展,具有腎保護(hù)作用,其機(jī)制可能與協(xié)日嘎-4湯通過(guò)下調(diào)腎組織MCP-1的表達(dá)來(lái)減輕糖尿病腎病的炎癥狀態(tài)有關(guān)。協(xié)日嘎-4湯通過(guò)哪些途徑下調(diào)MCP-1表達(dá)的作用機(jī)制,還有待探索。