張棽 饒佳濤 王超越 李宏治

(湖北恩施學院 1教務處,湖北 恩施 445000;2醫(yī)學部;3恩施州中心醫(yī)院麻醉科)

血管性癡呆是威脅老年人健康并引發(fā)癡呆的主要原因之一〔1〕。缺血性腦卒中是引發(fā)血管性癡呆的常見病因,神經(jīng)炎癥反應、神經(jīng)元自噬參與調(diào)控血管性癡呆的發(fā)生與發(fā)展〔2〕。相關研究顯示,抑制神經(jīng)炎癥反應、增強神經(jīng)元自噬作用能夠改善血管性癡呆所致的認知障礙〔3〕。銀杏是我國傳統(tǒng)中藥材,總黃酮是其主要活性成分〔4〕。相關研究顯示,山楂總黃酮能夠降低腦缺血大鼠炎性因子表達和神經(jīng)細胞凋亡,保護神經(jīng)系統(tǒng)功能〔5〕;但關于銀杏總黃酮對神經(jīng)細胞和神經(jīng)系統(tǒng)影響的研究仍十分少見。本研究旨在探討銀杏總黃酮對血管性癡呆大鼠神經(jīng)元損傷的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1動物與主要試劑 健康雄性SD大鼠,平均體質(zhì)量(300±10)g,購于湖北省實驗動物研究中心,許可證號:SCXK(鄂)2015-0018。飼養(yǎng)溫度(24±1)℃,自由進食、進水,每日12 h光照。銀杏總黃酮購于武漢普世達生物科技有限公司,貨號20210605,質(zhì)量分數(shù)≥98%。腦組織乙酰膽堿、5-羥色胺檢測試劑盒購于武漢艾美捷科技有限公司;血清白細胞介素(IL)-1β、IL-17、IL-6檢測試劑盒購于武漢賽培生物科技有限公司;鼠抗人Beclin1單克隆抗體,鼠抗人微管相關蛋白1輕鏈(LC)3單克隆抗體,鼠抗人PINK誘導激酶(PINK)1單克隆抗體,鼠抗人帕金蛋白(Parkin)單克隆抗體,鼠抗人β-actin單克隆抗體及二抗均購于武漢菲恩生物科技有限公司。

1.2血管性癡呆大鼠動物模型建立與分組 大鼠禁食、自由飲水12 h,麻醉后分離雙側頸總動脈并結扎。造模7 d后進行穿梭箱實驗進行篩選,與正常大鼠相比步入潛伏期明顯降低,暗室中花費的總時間明顯升高提示血管性癡呆大鼠模型造模成功。隨機分為模型組、50、100、200 mg/kg銀杏總黃酮組,每組12只;另取12只大鼠為假手術組(僅分離雙側頸總動脈、不結扎)。各銀杏總黃酮組灌胃給予相應劑量銀杏總黃酮,另外兩組給予等體積生理鹽水,連續(xù)21 d。

1.3穿梭箱實驗檢測大鼠學習記憶能力 將各組大鼠放入照明狀態(tài)腔室中,引導大鼠自由穿梭2個空腔室約10 min,當大鼠再次進入黑暗腔室時進行電擊刺激(0.5 mA),至大鼠逃離到不通電的照明狀態(tài)腔室中為止,記錄大鼠進入黑暗腔室所需的時間(步入潛伏期)和暗室中花費的總時間。

1.4組織收集與處理 穿梭箱實驗結束后麻醉大鼠,采集各組頸動脈血1.2 ml,3 000 r/min離心10 min,收集血清,-80 ℃保存。之后斷頭處死大鼠,取部分大腦組織加入RIPA裂解液,使用便攜式組織勻漿機勻漿,12 000 r/min 4 ℃恒溫離心20 min,收集上清,-80 ℃保存。另取部分大腦組織,常規(guī)石蠟包埋,切片后放于光學顯微鏡下觀察,收集含有典型海馬結構的腦組織切片,用于自噬相關蛋白和PINK1、Parkin蛋白表達檢測。

1.5大鼠腦組織乙酰膽堿、5-羥色胺水平和血清炎癥因子水平檢測 取各組大鼠腦組織蛋白樣品在冰水浴中解凍,吸取約0.2 ml腦組織蛋白樣品,酶聯(lián)免疫吸附試驗測定腦組織乙酰膽堿、5-羥色胺濃度。取各組大鼠血清樣品在冰水浴中解凍,吸取約0.3 ml血清,酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清IL-1β、IL-17、IL-6濃度。

1.6Western印跡檢測大鼠海馬組織中自噬相關蛋白和PINK1/Parkin信號通路蛋白表達 取各組含有典型海馬組織結構的切片,脫蠟、水化后RIPA細胞裂解液提取總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度,行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電轉(zhuǎn)法將目標蛋白轉(zhuǎn)膜,使用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉1 h,滴加鼠抗人Beclin1單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶1 000),鼠抗人LC3單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶800),兔抗人PINK1單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶500),兔抗人Parkin單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶1 000),鼠抗人β-actin單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶2 000),4 ℃孵培育過夜,次日滴加羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG,稀釋倍數(shù)1∶4 000,室溫下1 h,電化學發(fā)光法(ECL)顯影,使用ImageJ軟件讀取各條帶灰度值。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS25.0統(tǒng)計學軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組海馬組織自噬相關蛋白表達水平比較 模型組海馬組織Beclin1蛋白、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白與假手術組相比升高,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);不同濃度銀杏總黃酮組明顯高于模型組和假手術組(P<0.05);隨著銀杏總黃酮濃度的增加自噬相關蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達水平明顯提升(P<0.05)。見圖1,表1。

2.2各組學習記憶能力比較 模型組步入潛伏期明顯低于假手術組,暗室中花費總時間明顯長于假手術組(P<0.01);與模型組相比,不同濃度銀杏總黃酮組步入潛伏期明顯升高,暗室中花費總時間明顯降低(P<0.05),隨著銀杏總黃酮濃度的增加上述改變逐漸明顯(P<0.05)。見表1。

2.3各組海馬組織PINK1、Parkin蛋白表達水平比較 模型組海馬組織PINK1、Parkin蛋白與假手術組相比升高,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);不同濃度銀杏總黃酮組明顯高于模型組和假手術組(P<0.05);隨著銀杏總黃酮濃度的增加PINK1、Parkin蛋白表達水平明顯提升(P<0.05)。見圖1,表1。

1～5:假手術組、模型組、50、100、200 mg/kg銀杏總黃酮組

表1 各組學習記憶能力及海馬組織自噬相關蛋白、PINK1、Parkin蛋白表達水平比較

2.4各組腦組織乙酰膽堿、5-羥色胺水平比較 模型組腦組織乙酰膽堿、5-羥色胺水平明顯低于假手術組(P<0.01);與模型組相比,不同濃度銀杏總黃酮組明顯升高(P<0.01),隨著銀杏總黃酮濃度的增加腦組織乙酰膽堿、5-羥色胺水平明顯升高(P<0.01)。見表2。

2.5各組血清IL-1β、IL-17、IL-6水平比較 模型組血清IL-1β、IL-17、IL-6水平明顯高于假手術組(P<0.01);與模型組相比,不同濃度銀杏總黃酮組明顯降低(P<0.01),隨著銀杏總黃酮濃度的增加血清IL-1β、IL-17、IL-6水平明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組腦組織乙酰膽堿、5-羥色胺、IL-1β、IL-17、IL-6水平比較

3 討 論

隨著我國人口老齡化進程的發(fā)展,血管性癡呆患病率呈逐年上升趨勢,生活自理能力明顯下降,增加了家庭和社會的經(jīng)濟、醫(yī)療負擔〔6〕。本實驗結果提示,大鼠學習記憶受損,出現(xiàn)認知障礙,血管性癡呆大鼠模型造模成功;銀杏總黃酮能夠改善血管性癡呆大鼠的學習記憶能力,減輕認知障礙程度。血清炎性因子升高所致的神經(jīng)炎癥反應擴大會加重海馬神經(jīng)元損傷,降低5-羥色胺、乙酰膽堿水平,導致學習記憶能力減退〔7〕。

腦灌注不足所致的異常炎癥反應是血管性癡呆的主要病理基礎〔8〕,自噬作用也參與其中,加強自噬作用能夠保護神經(jīng)元,是血管性癡呆治療的主要手段〔9〕。銀杏是我國傳統(tǒng)中藥材,具有活血化瘀、活血通絡等功效〔10〕。研究發(fā)現(xiàn),錦雞兒總黃酮是其主要活性成分,能夠減輕腦缺血再灌注損傷〔11〕。本研究結果提示,模型組大鼠神經(jīng)元自噬代償性升高幅度難以對抗神經(jīng)元損傷,導致血管性癡呆的發(fā)生;另外,提示銀杏總黃酮可通過提高自噬相關蛋白表達來加強神經(jīng)元自噬,減輕海馬神經(jīng)元損傷,達到改善血管性癡呆大鼠學習記憶能力的目的。

PINK1/Parkin信號通路參與調(diào)控阿爾茨海默病的病理過程,其中PINK1、Parkin表達上調(diào)能夠增強神經(jīng)元的自噬代償能力,加速清除受損線粒體,保護神經(jīng)細胞免受氧化應激損傷〔12〕。PINK1表達上調(diào)還能夠激活神經(jīng)元自噬信號,減輕神經(jīng)元損傷,進而發(fā)揮對阿爾茨海默病的治療作用〔13〕。本研究結果提示,銀杏總黃酮可通過激活PINK1/Parkin信號通路,提高自噬作用,減輕神經(jīng)元損傷,最終達到改善血管性癡呆癥狀的作用。