關鍵詞：高通量測序； 樟子松； 土壤微生物； 枯梢??； 真菌多樣性

中圖分類號：S763. 1 文獻標識碼：A DOI：10. 7525/j. issn. 1006-8023. 2024. 06. 005

0引言

樟子松（Pinus sylvestris var. mongolica）是松科、松屬常綠喬木［1］。因其具有耐寒、耐旱、適應性強和生長快等特性，常用作防護林大面積栽植，是我國“三北防護林工程”和“治沙工程”建設的主要造林樹種，在生態(tài)環(huán)境的建設上有著不可或缺的作用［2］。近年來，隨著人工林面積逐步擴大，全球氣候變暖等因素，樟子松林地發(fā)生的病蟲害日趨嚴重，其中松枯梢病對其危害尤為嚴重。樟子松枯梢病是由松球殼孢菌（Sphaeropsis sapinea）引起的寄主主導性病害［3-5］，從樟子松幼苗至成林均可發(fā)病，其癥狀表現(xiàn)為頂芽枯死、枯針、枯梢或叢枝，可引起根莖腐爛，嚴重時可導致整株枯死［6-8］。

多項研究表明，土壤微生物對土壤內(nèi)的生態(tài)環(huán)境高度敏感，在調(diào)控生態(tài)系統(tǒng)功能上有著重要的作用。植物通過影響土壤環(huán)境，進而影響土壤真菌群落。病原菌侵染植物能夠改變植株根際土壤微生物群落結構［9-10］，土壤中某些微生物也可以有效增強植物的抗病性［11］。本研究基于高通量測序技術對章古臺和泰來人工林、紅花爾基自然保護區(qū)天然林內(nèi)的樟子松林下土壤真菌群落結構進行研究，通過對比土壤真菌多樣性，明確不同地區(qū)感病樟子松人工林和健康樟子松天然林的土壤真菌群落差異，為樟子松枯梢病的防治提供支持［13-14］。

1材料與方法

1. 1研究區(qū)概況

紅花爾基自然保護區(qū)地處干旱半干旱地區(qū)的內(nèi)蒙古呼侖貝爾市紅花爾基自然保護區(qū)（47°36′～48°35′N，118°58′～120°32′E），屬于寒溫帶大陸性氣候，春秋季風大，夏季短暫，雨熱同期，冬季漫長。

章古臺人工林位于遼寧省彰武縣章古臺鎮(zhèn)（42°43′～42°51′N，121°53′～122°22′E），屬溫帶半干旱大陸性季風氣候區(qū)。主要氣候特點是干旱多風，年降水量500 mm左右，且多集中于6—8月，年蒸發(fā)量約為降水量的3倍。

泰來人工林位于黑龍江省西南部的齊齊哈爾市泰來縣（46°13′～47°10′N，122°59′～124°E），屬中溫帶大陸性季風氣候，春季干旱多風，夏季高溫少雨，秋季多風溫差大，冬季寒冷少雪。

1. 2樣品采集

在紅花爾基自然保護區(qū)里選取3棵健康樟子松作為對照，在紅花爾基自然保護區(qū)天然林、泰來縣和章古臺人工林中分別選取3棵感枯梢病樟子松。為樣本具有代表性，在3棵不同樹下采集同一深度的土壤（選取表層、0～10cm和10～20cm深土壤），每份樣品3個重復，4組共36份樣品。除去雜物、細根后，將土樣裝入無菌袋后置于干冰中，送到上海派森諾生物科技股份有限公司進行高通量測序。具體樣品編號見表1。

1. 3土壤真菌DNA的提取及數(shù)據(jù)分析

1. 3. 1 DNA的提取、PCR擴增及高通量測序

土壤真菌的DNA提取使用Omega soil DNA Kit試劑盒。為鑒定土壤樣本中真菌種類，選取引物ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對標準真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS-1（a）區(qū)域進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增。采用Illumina平臺對群落DNA片段進行雙端（Paired-end）測序，測序策略為PE250。下機數(shù)據(jù)利用DADA2方法［15］進行去引物、質(zhì)量過濾、去噪（denoise）、拼接和去嵌合體等步驟。進行去重（dereplication）后產(chǎn)生的每個去重的序列為ASVs（amplicon sequence variants）。DNA的提取、PCR擴增及高通量測序工作委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1. 3. 2數(shù)據(jù)分析

將處理后的真菌ASVs 與UNITE 數(shù)據(jù)庫（Release8. 0，https：//unite. ut. ee/）進行比對，根據(jù)比對結果對每個真菌ASV進行界、門、綱、目、科、屬、種各個水平下的物種分類學注釋，統(tǒng)計每個分類單元下的ASV數(shù)量或豐度，進而分析樣本的真菌群落門類組成。通過層次聚類樹圖、樣本與物種豐度circos圖及共有屬在不同樣本中的占比，展示樣本間的異同。生境內(nèi)多樣性（within-habitat diversity，Alpha）是指局部均勻生境下的物種在豐富度（richness）、多樣性（diversity）和均勻度（evenness）等方面的指標。生境間多樣性（between-habitat diversity，Beta）是指生物多樣性在空間或環(huán)境梯度上的變化。利用Alpha多樣性及Beta多樣性完成土壤真菌群落多樣性分析。

基于上海派森諾基因云平臺（https：//www. genescloud.cn）進行生物信息學分析。真菌ASV韋恩圖及Beta 多樣性的PCoA 圖由R 語言工具繪制，Alpha多樣性中各種指數(shù)由QIIME2（2019. 4）分析獲得，利用origin2022繪制實現(xiàn)可視化。真菌生態(tài)功能群劃分采用FUNGuild預測工具將高通量測序獲得的真菌ASV上傳分析。

2結果與分析

2. 1土壤真菌ASV聚類分析

測序結果去噪后，繪制出真菌ASV的Venn圖。由圖1可知，4組樣本中一共獲得5 564真菌ASV，共有真菌ASV 數(shù)為32 個。健康樟子松林下土壤樣本C組特有真菌ASV數(shù)為779個。3組感枯梢病樟子松林下土壤樣本中，G組特有真菌ASV最多，為1658個；而D 組特有真菌ASV 最少，僅有953個。此外，C組、D組、E組、G組總真菌ASV數(shù)分別為1 027、1 393、1 887和2 089個。

2. 2土壤真菌群落門類組成

將不同樣品中相同的真菌進行合并后，制成各水平微生物分類單元數(shù)統(tǒng)計表，見表2。由表2可知，4組樣本中均為表層土壤真菌種類數(shù)量最多，感病人工林與天然林土壤真菌種類數(shù)量高于健康天然林土壤真菌，而感病人工林土壤真菌種類數(shù)量低于感病天然林土壤真菌。

由圖2可知，在3個不同土壤深度下，C組的優(yōu)勢門均為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、毛霉門（Mucoromycota）；D、E、G組的優(yōu)勢門均為子囊菌門、擔子菌門、被孢霉門（Mortierellomycota）。這些結果表明，在門水平下感病的樣品土壤真菌群落基本相同。與健康天然林對比，感病樣本土壤中擔子菌門相對豐度顯著降低，子囊菌門相對豐度顯著升高。

由圖3可知，假裸囊菌屬（Pseudogymnoascus）在G4-6、G7-9、D4-6中為相對豐度最高的屬，分別占43. 13%、44. 02% 和18. 29%；木霉屬（Trichoderma）在E1-3中相對豐度最高，約9. 18%；籃狀菌屬（Tal?aromyces）在E4-6中相對豐度最高，為18. 25%；乳牛肝菌屬（Suillus）在E7-9中相對豐度最高，為10. 64%；Delastria 屬在D1-3 中相對豐度最高，為48. 88%；Sagenomella屬在D7-9中相對豐度最高，為37. 10%；Knufia 屬在G1-3中相對豐度最高，為15. 14%；糙緣腺革菌屬（Amphinema）在C1-3中相對豐度最高，為17. 9%；絲膜菌屬（Cortinarius）在C4-6 和C7-9 中相對豐度最高，分別為16. 98%和26. 82%。

2. 3土壤真菌群落組成差異與相似性

層次聚類樹圖中，樣本根據(jù)彼此之間的相似度聚類，樣本間的分支長度反映樣本間的相似度。由圖4可知，各組樣本中的重復處理均分別聚為一支，證明不同地點各處理組內(nèi)樣本真菌的組成與豐度較相似；C組3個處理組間分支長度短，D1-3、G1-3聚類為一支，與D4-6、D7-9、G4-6、G7-9的聚類間分支長度較長。結合圖中右側堆疊柱狀圖可知，健康天然林不同深度土壤真菌的組成及豐度較相似，感病人工林表層與0～10、10～20cm土壤真菌的組成及豐度具有一定差異，且子囊菌門（Ascomycota）在所有樣本中的相對豐度都較高。

由表3可知，C組和E組的土壤真菌Top20屬中有10個共有屬，這些共有屬在C內(nèi)占比0. 5439，在E內(nèi)占比0. 460 2。對比E、D、G組土壤真菌的Top20屬中有9個共有屬（表4），該共有屬在E、D、G組中分別占比0. 354 3、0. 338 4、0. 532 9。樟子松天然林中，共有屬在感病樟子松土壤內(nèi)占比高于健康樟子松土壤。

基于分類學組成分析并結合圖4、表3和表4，將C、D、E、G這4組Top20屬中的各屬真菌相對豐度進行比較，結果顯示，鐮孢霉屬（Fusarium）為D、E、G組共有屬；C 組的外生菌根菌（Ectomycorrhizalfungi， ECMF）類型有絲膜菌屬、白齒菌屬（Sisto?trema）、糙緣腺革菌屬、棉革菌屬（Tomentella）、紅菇屬（Russula）、絲蓋傘屬（Inocybe）、牛肝菌屬和空團菌屬等，相對豐度約為39%；E組的ECMF種類較C組少，相對豐度為25. 36%；D組只包含3種ECMF，相對豐度為1. 4%，G 組中僅有一種糙緣腺革菌屬（Amphinema）為ECMF，相對豐度0. 28%。這些結果說明，天然林土壤真菌中含有較高的外生菌根菌，而人工林中外生菌根菌較少。

通過Circos圖來表現(xiàn)樣本與物種豐度的相互關系，以屬（genus）水平進行繪圖，可以看出各樣本中不同物種所占的比例及某一物種在不同樣本中的比例關系。由圖5可知，糙緣腺革菌屬在D組不存在，白齒菌屬在G組不存在。由表3和表4可知在屬水平上，各地點真菌組成略有區(qū)別，且相對豐度在各樣本中存在差異。如青霉屬（Penicillium）在C區(qū)15. 0%，在D區(qū)9. 4%，在E區(qū)6. 74%，在G區(qū)10. 1%。

2. 4土壤真菌群落多樣性分析

2. 4. 1 Alpha多樣性

Shannon指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高。Good’s coverage指數(shù)越高，則樣本中未被檢測出的物種所占的比例越少。Chao1指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。4組土樣中真菌覆蓋率（coverage）均超過99. 78%，表明真菌的測序深度已達到較高水平，數(shù)據(jù)可靠，如圖6所示。

由圖6（b）可知，對比同一地點不同深度的Shannon指數(shù)，C組表層指數(shù)最高，10～20cm指數(shù)最低；D組中0～10cm指數(shù)最高，10～20cm指數(shù)最低；E組為表層指數(shù)最高，0～10cm指數(shù)最低；G組為表層指數(shù)最高，0～10cm指數(shù)最低。對比不同地點同一深度的Shannon指數(shù)，表層最高為E組，最低為D組；0～10cm最高為D組，最低為G組；10～20cm最高為E組，最低為D組。

由圖6（c）可知，4組樣本表層Chao1指數(shù)最大為G 組，最小為D 組；0～10 cm 最大為E 組，最小為C組；10～20 cm中最大為E組，最小為C組。C組3個處理中Chao1指數(shù)從大到小依次為C1-3、C7-9、C4-6；D組3個處理中Chao1指數(shù)從大到小依次為D4-6、D1-3、D7-9；E組3個處理中Chao1指數(shù)從大到小依次為E1-3、E7-9、E4-6；G組3個處理中Chao1指數(shù)從大到小依次為G1-3、G7-9、G4-6。

2. 4. 2 Beta多樣性

主坐標分析（Principal Coordinate Analysis，PCoA）可以通過觀察數(shù)據(jù)點在主成分空間中的分布情況，幫助分析理解各樣本之間的關系。數(shù)據(jù)點聚集或分散，表明其之間存在相似性或差異性。

由圖7和圖8可知，E1-3、E4-6、E7-9距離近，真菌群落構成差異較小，其他數(shù)據(jù)點與之距離較遠，真菌群落構成差異較大。D4-6 與D7-9，G4-6與G7-9兩兩之間距離近，真菌群落構成差異小。即同為感病樟子松林，人工林與天然林之間的真菌群落構成差異較大，同一人工林0～10 cm與10～20 cm深土壤真菌群落之間構成差異較小。C1-3、C4-6與C7-9遠離其他數(shù)據(jù)點，健康天然林與其他感病林之間土壤真菌群落構成具有差異性。

2. 5樟子松土壤真菌生態(tài)功能群

基于FUNGuild數(shù)據(jù)庫解析，除去未鑒定類群和復合型類群，4組土樣中土壤真菌可分為3種營養(yǎng)模式和10個生態(tài)功能群，見表5。

在各土樣中真菌優(yōu)勢營養(yǎng)型均為腐生營養(yǎng)型真菌。腐生營養(yǎng)型真菌在C 組占46. 36%，E組占45. 55%，D組占74. 62%，G組占70. 10%。說明腐生營養(yǎng)型真菌在人工林中占比較大，在天然林中占比較少。病理營養(yǎng)型真菌在C組中占16. 20%，E組中占24. 62%，D組中占8. 36%，G組中占16.56%，即病理營養(yǎng)型真菌在感枯梢病樟子松天然林中占比最大。共生型真菌在C組占比約為36. 75%，在E組占29. 78%，在D組占16. 95%，在G組占13. 2%。表明共生營養(yǎng)型真菌在天然林占比大于人工林占比，而共生營養(yǎng)型真菌在健康樟子松天然林中占比大于感枯梢病樟子松天然林。

3討論

本研究通過Illumina MiSeq測序平臺，對健康樟子松天然林和不同地區(qū)感枯梢病樟子松林下土壤真菌進行了分析，用數(shù)據(jù)說明上述地區(qū)之間土壤真菌多樣性和群落組成的差異。關于植物感病對土壤微生物群落的影響，在以往的多種作物研究中曾發(fā)現(xiàn)［15-17］，植物感病可以導致土壤中真菌數(shù)量明顯增加。而本研究中也得到了相同的結論，感病樟子松土壤真菌ASV數(shù)對比健康樟子松土壤真菌ASV數(shù)有明顯增加。

本研究發(fā)現(xiàn)，樟子松林下土壤真菌中子囊菌門和擔子菌門是主要類群，子囊菌門大多數(shù)為腐生菌，可以分解難降解性有機質(zhì)。擔子菌門腐生或寄生，在潮濕的土壤中分解木質(zhì)纖維素，作為主要分解群落在土壤中存在［18］。此外，在健康樟子松林下毛霉門相對豐度同樣較高。毛霉門真菌在自然界中分布廣泛，腐生于土壤、動物糞便和動植物殘體等基物中，或寄生于動植物甚至其他真菌（包括其他毛霉門真菌）中［19］。感枯梢病樟子松林下土壤真菌中還有被孢霉門占比較大，被孢霉門在分解植物凋落物方面有著重要作用［20-21］。

樟子松林下土壤真菌的營養(yǎng)模式分為腐生營養(yǎng)型、共生營養(yǎng)型以及病理營養(yǎng)型3種［22］。本研究中，感枯梢病樟子松天然林中共生營養(yǎng)型真菌占比較大，其中外生菌根為主要類群。共生營養(yǎng)型真菌通過和植物兩者共生的生態(tài)學機制增強寄主植物的抗逆性，減輕有害生物危害，提高寄主植物對生境的適應能力［23］。此外，腐生營養(yǎng)型真菌在各樣本中占據(jù)主要地位，其在養(yǎng)分循環(huán)方面具有重要作用［24］。以往的研究表明，腐生營養(yǎng)型真菌與土壤有機質(zhì)含量有關［25-26］，因此接下來的研究可以著重分析感枯梢病樟子松林下土壤的理化性質(zhì)與腐生營養(yǎng)型真菌的關系。

外生菌根是土壤真菌和植物根系之間形成的共生關系，有利于宿主物種抵抗非生物或生物脅迫，還可以提高植物的抗病能力，促進植物生長［27］。樹種多樣性增加可以顯著降低病原性真菌的數(shù)量及豐富度，增加外生菌根的豐富度，樹種組成改變外生菌根的真菌群落結構，對森林生態(tài)系統(tǒng)功能產(chǎn)生積極影響［28］。本研究數(shù)據(jù)表明，章古臺感病人工林土壤真菌中外生菌根占比最低，僅為1. 43%，其次為泰來縣感病人工林中占11. 27%。由于其單一的樹種組成，導致外生菌根的豐富度低。病理營養(yǎng)型真菌中植物病原菌生態(tài)功能群在感病人工林土壤真菌群落占比分別為2. 63%、5. 04%，遠低于健康天然林（8. 11%）。推測人工林樹種的單一性導致外生菌根豐富度低，樟子松對生境的適應能力弱，抗病性較差，更易患病。

4結論

本研究以健康樟子松天然林和不同地區(qū)感枯梢病樟子松林林下土壤為研究對象，利用高通量測序技術，分析樟子松天然林及人工林土壤真菌群落結構組成的多樣性和差異，得到以下研究結果。1）來自3個地區(qū)的4組樟子松林下土樣中，總共獲得5564個真菌ASV，其中擔子菌門和子囊菌門的相對豐度較高。2）在不同立地條件下、不同深度土壤中，真菌群落的結構組成具有差異性。3）病理營養(yǎng)型真菌中植物病原菌生態(tài)功能群在章古臺和泰來感病人工林土壤真菌群落分別占2. 63%、5. 04%，在健康天然林中占8. 11%，感病天然林中占8. 77%。4）章古臺感病人工林土壤真菌中外生菌根占1. 43%，泰來縣感病人工林中占11. 27%，健康天然林中占30. 73%，感病天然林中占16. 17%。

本研究結果表明，不同立地條件下樟子松林下土壤真菌群落的組成存在差異，明確了枯梢病的發(fā)生對樟子松林下土壤微生物群落結構有一定影響，人工林樹種的單一性導致外生菌根豐富度低，樟子松人工林抗病性較差，更易患病。