陳嘉麗 韓夢(mèng)媛 王冬明

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥劑科,上海 200032)

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是一種被認(rèn)為來(lái)源于骨形成間充質(zhì)干細(xì)胞的罕見(jiàn)腫瘤[1],主要影響青少年,雖然僅占兒童和青少年癌癥約5%,但它對(duì)兒童癌癥死亡率有很大影響[2-4]。一小部分低級(jí)別OS可通過(guò)手術(shù)治愈[5],但當(dāng)OS發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí),單獨(dú)手術(shù)無(wú)法治愈[6]。因此,研究OS的發(fā)生機(jī)制仍是一個(gè)挑戰(zhàn)?；倍哂袕V泛的抗癌功能,包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成和刺激免疫系統(tǒng),且未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用[7-8]。槐耳多糖(Sophora japonica polysaccharide,PST)是從槐耳中提取的活性成分,由6種單糖和18種氨基酸組成。研究發(fā)現(xiàn),PST可以抑制三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)細(xì)胞的增殖和遷移[9]。Qi等[10]發(fā)現(xiàn)PST誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。Li等[11]發(fā)現(xiàn)PST可以在乳腺癌治療中起到積極作用。但是目前關(guān)于PST是否對(duì)OS起到積極影響鮮有報(bào)道。Yes相關(guān)蛋白(YAP)/轉(zhuǎn)錄共激活因子PDZ結(jié)合基序(TAZ)信號(hào)軸在許多實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展過(guò)程中經(jīng)常被激活,包括肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、黑色素瘤和膠質(zhì)瘤,YAP/TAZ信號(hào)通路激活可以驅(qū)動(dòng)癌細(xì)胞存活、增殖、侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移[12]。YAP/TAZ信號(hào)通路的激活也可能使化療、放療或免疫治療產(chǎn)生耐藥性[13]。也有研究發(fā)現(xiàn)YAP/TAZ通路可以作為治療轉(zhuǎn)移性癌癥的靶標(biāo)[14]。Kovar等[15]發(fā)現(xiàn),YAP/TAZ在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起重要作用。而槐耳可以通過(guò)下調(diào)肝細(xì)胞癌中的YAP來(lái)增強(qiáng)奧沙利鉑的化療敏感性[16]。基于此,本研究探討PST是否可能通過(guò)下調(diào)YAP/TAZ信號(hào)通路對(duì)OS細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要材料 PST(貨號(hào):FT28138-5g)購(gòu)自上海梵態(tài)生物科技有限公司;人OS細(xì)胞MG63(貨號(hào):YS4270C)、Saos-2(貨號(hào):YS4116C)、G292(貨號(hào):YS3740C)、U20S(貨號(hào):YS962C)購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司;人成骨細(xì)胞hFOB 1.19(貨號(hào):Sci-H1092)購(gòu)自上海圻明生物科技有限公司;CCK-8試劑盒(貨號(hào):PH1759)購(gòu)自福州飛凈生物科技有限公司;抗體:p-YAP(貨號(hào):ab76252)、YAP(貨號(hào):ab205270)、TAZ(貨號(hào):ab242313)、Bcl-2(貨號(hào):ab117115)、Bax(貨號(hào):ab81083)、cleaved-Caspase-3(貨號(hào):ab208003)、E-cadherin(貨號(hào):ab76319)、vimentin(貨號(hào):ab217673)、N-cadherin(貨號(hào):ab271856)購(gòu)自Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將所有細(xì)胞均用補(bǔ)充有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基置于37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中。待G292細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)到70%時(shí),分為以下6組:G292組(G292細(xì)胞未做任何處理);用1、2.5、5 μg/mL PST[17]處理G292細(xì)胞依次記為L(zhǎng)-PST組、M-PST組、H-PST組,用10 μmol/L YAP/TAZ信號(hào)通路激活劑GA-017[18]處理G292細(xì)胞記為GA-017組,用5 μg/mL PST和10 μmol/L GA-017共同處理G292細(xì)胞記為H-PST+GA-017組。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8檢測(cè)G292細(xì)胞活性 將細(xì)胞接種在96孔板上,每孔接種3 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后添加10 μL CCK-8試劑,最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值(A450)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)G292細(xì)胞凋亡 將各組細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化,以250×g離心5 min,用預(yù)冷的PBS洗滌兩次,每次10 min,然后轉(zhuǎn)移到流式管中。用500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加入5 μL AnnexinV-FITC和PI,室溫下孵育10 min,上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell法檢測(cè)G292細(xì)胞遷移和侵襲 ①遷移:將細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個(gè)/mL。取1 mL細(xì)胞懸液加入6孔板中。在細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋板底部后,使用無(wú)菌移液槍槍頭小心地刮擦板底部,并用PBS沖洗。在細(xì)胞培養(yǎng)24 h后用顯微鏡拍照并計(jì)算遷移率。遷移率(%)=(初始劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%。②侵襲:預(yù)先將Matrige鋪在Transwell上室,向Transwell上室加入200 μL濃度為2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。在下室加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,并在孵育24 h后取出Transwell的上室。小心地去除未穿膜的G292細(xì)胞,用4%多聚甲醛將G292細(xì)胞固定,并用0.01%結(jié)晶紫染色約10 min。隨后,在光學(xué)顯微鏡下觀察G292細(xì)胞侵襲數(shù)量。

1.6 Western blot檢測(cè)YAP/TAZ通路蛋白、EMT相關(guān)蛋白以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 將G292細(xì)胞加入裂解液后,在冰上裂解30 min,將細(xì)胞經(jīng)4 ℃離心機(jī)離心后獲得上清液,上清液用于總蛋白提取。使用BCA法定量總蛋白,隨后將蛋白質(zhì)在制備的凝膠上運(yùn)行以進(jìn)行分離。分離后,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,該膜與一抗(p-YAP、YAP、TAZ、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3、E-cadherin、vimentin、N-cadherin、GAPDH)在4 ℃下孵育過(guò)夜,TBST洗膜后,加入標(biāo)記的二抗孵育1 h,ECL顯色劑顯色后用ImageJ軟件對(duì)蛋白質(zhì)定量。

2 結(jié)果

2.1 PST對(duì)細(xì)胞活性的影響 PST(2.5～5 μg/mL)抑制MG63、Saos-2、U20S、G292細(xì)胞A450值(P<0.05),且對(duì)G292細(xì)胞影響最顯著。因此,以G292細(xì)胞為研究對(duì)象。見(jiàn)表1。

表1 PST對(duì)細(xì)胞A450值的影響

2.2 PST對(duì)各組G292細(xì)胞活性的影響 與G292組相比,M-PST組、H-PST組G292細(xì)胞A450值顯著減小(P<0.05),GA-017組顯著增加(P<0.05);與H-PST組相比,H-PST+GA-017組A450值顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 PST對(duì)G292細(xì)胞活性的影響

2.3 PST對(duì)G292細(xì)胞凋亡的影響 與G292組相比,M-PST組、H-PST組細(xì)胞凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平顯著下降(P<0.05),GA-017組呈相反趨勢(shì)(P<0.05);與H-PST組相比,H-PST+GA-017組細(xì)胞凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著下降(P<0.05),Bcl-2蛋白水平顯著上升(P<0.05)。見(jiàn)圖1～2、表3。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)G292細(xì)胞凋亡率

圖2 各組G292細(xì)胞凋亡蛋白比較

表3 各組G292細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白的比較

2.4 PST對(duì)G292細(xì)胞遷移、侵襲以及EMT相關(guān)蛋白的影響 與G292組相比,M-PST組、H-PST組G292細(xì)胞遷移率、侵襲數(shù)量以及vimentin、N-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白水平呈顯著上調(diào)趨勢(shì)(P<0.05),而GA-017組E-cadherin蛋白水平顯著減少(P<0.05),遷移率、侵襲數(shù)量以及vimentin、N-cadherin蛋白水平顯著上升(P<0.05);H-PST+GA-017組較H-PST組G292細(xì)胞遷移率、侵襲數(shù)目、vimentin、N-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05),E-cadherin蛋白水平顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)圖3～5、表4～5。

圖3 劃痕試驗(yàn)觀察G292細(xì)胞遷移(40×)

圖4 Transwell試驗(yàn)觀察G292細(xì)胞侵襲(200×)

圖5 各組G292細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的比較

表4 PST對(duì)G292細(xì)胞遷移、侵襲的影響

表5 PST對(duì)G292細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的影響

2.5 PST對(duì)G292細(xì)胞YAP/TAZ通路蛋白的影響 與G292組相比,M-PST組、H-PST組G292細(xì)胞p-YAP/YAP、TAZ蛋白水平顯著下降(P<0.05),而GA-017組p-YAP/YAP、TAZ蛋白水平顯著上升(P<0.05);H-PST+GA-017組較H-PST組p-YAP/YAP、TAZ蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖6、表6。

圖6 各組G292細(xì)胞YAP/TAZ通路蛋白水平

表6 各組G292細(xì)胞YAP/TAZ通路蛋白水平比較

3 討論

OS是最常見(jiàn)的原發(fā)性骨惡性腫瘤,具有很高的局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移傾向。盡管手術(shù)與化療相結(jié)合極大地改善了OS患者的預(yù)后,但轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性O(shè)S的預(yù)后仍然效果不佳[19]。因此,研究OS的發(fā)生機(jī)制仍是臨床面臨的難題之一。越來(lái)越多的證據(jù)表明,中藥具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的潛力[16]?；倍驯挥糜诙喾N癌癥的治療,而PST作為槐耳中的主要活性成分在癌癥治療中也被廣泛研究,大量研究證實(shí)PST在TNBC[9]、肝癌[20]、乳腺癌[11]的治療中起到積極作用,但PST在OS上的研究鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示,PST抑制OS細(xì)胞系(MG63、Saos-2、U20S、G292)細(xì)胞活性,且對(duì)G292細(xì)胞效果最顯著,因此,以G292細(xì)胞為研究對(duì)象。與G292組相比,M-PST組、H-PST組G292細(xì)胞A450值、Bcl-2蛋白水平顯著下降,細(xì)胞凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著升高,提示PST可能通過(guò)抑制G292細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡抑制OS發(fā)展。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)已被確定在腫瘤進(jìn)展,侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用,并且是癌細(xì)胞獲得侵襲性的一種方式[21]。在EMT過(guò)程中,上皮細(xì)胞通過(guò)失去細(xì)胞極性和上皮標(biāo)志物(E-cadherin)的表達(dá)而經(jīng)歷表型轉(zhuǎn)換,通過(guò)獲得間充質(zhì)標(biāo)志物(N-cadherin,vimentin)表達(dá)而成為間充質(zhì)細(xì)胞[22]。因此,這些轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞獲得成纖維細(xì)胞樣特性,并表現(xiàn)出細(xì)胞間粘附減少和運(yùn)動(dòng)性增加[23-24]。本研究結(jié)果顯示,與G292組相比,M-PST組、H-PST組G292細(xì)胞遷移率、侵襲數(shù)量以及vimentin、N-cadherin蛋白水平均顯著下降,E-cadherin蛋白水平顯著升高,提示PST可能通過(guò)抑制G292細(xì)胞EMT過(guò)程抑制OS的進(jìn)展。

國(guó)外研究報(bào)道稱YAP/TAZ信號(hào)通路激活是腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥性的驅(qū)動(dòng)因素[12]。大量研究也證實(shí)可以通過(guò)調(diào)控YAP/TAZ信號(hào)通路來(lái)抑制癌癥的發(fā)展。例如Zhu等[25]發(fā)現(xiàn)激活YAP/TAZ通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌的增殖。Ma等[26]發(fā)現(xiàn)激活YAP/TAZ信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。而YAP/TAZ信號(hào)通路在OS中的研究已經(jīng)非常普遍,研究發(fā)現(xiàn)YAP/TAZ信號(hào)軸協(xié)調(diào)人OS的去分化、細(xì)胞命運(yùn)和轉(zhuǎn)移[27]。Ferraiuolo等[28]還發(fā)現(xiàn)龍舌蘭可以通過(guò)抑制YAP/TAZ信號(hào)通路抑制細(xì)胞活力、集落形成和細(xì)胞遷移,并且可以誘導(dǎo)OS細(xì)胞系的凋亡,本研究結(jié)果與其一致。在本研究中,PST處理后G292細(xì)胞p-YAP/YAP、TAZ蛋白水平顯著降低,提示PST可能通過(guò)抑制YAP/TAZ信號(hào)通路發(fā)揮抑制OS發(fā)展的作用。為了進(jìn)一步證實(shí)猜測(cè),本研究用YAP/TAZ信號(hào)通路激活劑GA-017處理G292細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GA-017組G292細(xì)胞A450值、遷移率、侵襲數(shù)量以及vimentin、N-cadherin、Bcl-2、p-YAP/YAP、TAZ蛋白水平均顯著升高,細(xì)胞凋亡率、E-cadherin、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著降低,與M-PST組、H-PST組的作用效果呈相反的趨勢(shì),而GA-017和PST共同處理G292細(xì)胞發(fā)現(xiàn),PST對(duì)G292細(xì)胞惡性行為的抑制作用被GA-017部分逆轉(zhuǎn),提示PST可能通過(guò)下調(diào)YAP/TAZ信號(hào)軸抑制OS的進(jìn)展。本研究不足之處在于缺少臨床數(shù)據(jù),將在下一步實(shí)驗(yàn)實(shí)施。

4 結(jié)論

PST可能通過(guò)調(diào)控YAP/TAZ信號(hào)軸影響OS細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲,進(jìn)而抑制OS發(fā)展。