李楨楨,尹明雨,王錫昌*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海,201306) 3(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室,上海,201306)

南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)屬十足目、對蝦科,其營養(yǎng)豐富、味道鮮美、肉質(zhì)細膩,深受消費者的喜愛。南美白對蝦在20世紀90年代初期成功進行人工繁殖,其養(yǎng)殖規(guī)模隨消費者需求量的增加而擴大,2021年我國養(yǎng)殖南美白對蝦產(chǎn)量高達197.74萬t,占全國養(yǎng)殖蝦類總產(chǎn)量的36.97%[1]。

目前,南美白對蝦主要以冷凍品形式銷售。冷鏈運輸是指冷藏冷凍品從生產(chǎn)、加工、運輸、銷售、配送直到消費者手中、全過程始終處于維持其品質(zhì)所需的可控環(huán)境溫度下的特殊供應(yīng)鏈,減少因腐敗變質(zhì)引起的損耗,使產(chǎn)品保持相對較高的新鮮度[2]。近幾年,隨著人們對高品質(zhì)消費需求的快速增長,冷鏈物流行業(yè)發(fā)展規(guī)模顯著擴大。然而,冷鏈流通過程中由于冷鏈設(shè)備缺乏、物流技術(shù)落后和物流不規(guī)范等原因常會出現(xiàn)“斷鏈”現(xiàn)象[3],使得冷凍水產(chǎn)品在運輸、貯藏和銷售等過程中不可避免地會發(fā)生溫度波動。溫度波動會導(dǎo)致水產(chǎn)品肌肉組織中的冰晶重結(jié)晶、蛋白變性、汁液流失等,嚴重影響其食用品質(zhì)。韓洋[4]對國內(nèi)冷鏈近距離運輸和遠距離運輸時低溫運輸車內(nèi)的溫度進行實時記錄,總結(jié)發(fā)現(xiàn)3 d內(nèi)運輸車內(nèi)小幅度溫度波動范圍為5 ℃左右,大幅度溫度波動范圍為12 ℃左右,某些極端條件下甚至?xí)郎刂? ℃,全程波動頻率在1～4次。SZYMCZAK等[5]將腌制7 d后的海鯡魚片分別置于恒溫-19 ℃和在-19～-23 ℃周期性變化的溫度下貯藏5個月,結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度波動組魚片的硬度、色澤和感官評分顯著高于恒溫組,溫度波動會導(dǎo)致肌肉組織結(jié)構(gòu)和溶酶體膜的分解。XIE等[6]模擬帶魚在恒溫冷鏈、運輸和零售過程中的溫度波動,研究表明魚片溫度波動次數(shù)越多,其品質(zhì)劣變速度越快,顯著高于貯藏在恒定溫度的樣品。ZHANG等[7]將冷凍凡納濱對蝦在-18～4 ℃進行溫度波動,結(jié)果顯示溫度波動會導(dǎo)致冰晶生長和重結(jié)晶現(xiàn)象,從而使得解凍損失、肌纖維間隙增大,降低了其硬度、彈性、肌原纖維蛋白含量和Ca2+-ATPase活性。現(xiàn)階段,國內(nèi)外針對溫度波動的研究主要集中在水產(chǎn)品的凍融循環(huán)過程,以及將物流運輸分為多個階段,每個階段不同溫度的切換波動中。而真正冷鏈流通中的溫度波動研究較少,且鮮有對持水性及質(zhì)構(gòu)特性進行深入的分析。

本研究依據(jù)冷鏈流通過程中環(huán)境溫度可能發(fā)生小幅度、大幅度以及極端波動,對冷凍南美白對蝦分別進行-18～-12、-18～-6、-18～0 ℃ 3個溫度波動處理,研究不同溫度波動及次數(shù)對其持水性及質(zhì)構(gòu)的影響并探究其內(nèi)在機理,旨在為冷凍南美白對蝦在冷鏈流通過程中的品質(zhì)調(diào)控提供參考和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍南美白對蝦整蝦[(24.87±3.01) g/尾,n=2 000]于2022年8月采購于上海新魚港國際貿(mào)易有限公司,置于泡沫箱中加干冰、冰袋,12 h內(nèi)運輸至上海海洋大學(xué)實驗室,在-18 ℃冰箱內(nèi)貯藏備用。該樣品由工廠專業(yè)化條件進行凍結(jié)并在-18 ℃下貯藏12個月,出廠日期一致且均在保質(zhì)期內(nèi)。

濃鹽酸、Tris,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、體積分數(shù)2.5%戊二醛固定液、考馬斯亮藍,上海麥克林生化科技有限公司;Carnoy固定液、無水乙醇、伊紅染液,北京索萊寶科技有限公司;5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[5,5′-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB],上海阿拉丁生化科技股份有限公司;以上均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RC-4溫度記錄儀,江蘇省精創(chuàng)電子有限公司;DHG-9070A型鼓風干燥箱,上海鰲珍儀器制造有限公司;TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀,英國 SMS公司;BT-224S電子分析天平,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;FJ200-SH型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機,上海標本模型廠;H2050R高速冷凍離心機,長沙湘儀有限公司;UV-1800PC紫外可見分光光度計,中國上海美普達公司;HWS-24電熱恒溫水浴鍋,上海恒科學(xué)儀器;AE-6500垂直電泳槽,日本ATTO公司;F-7100熒光分光光度計,日本日立高新技術(shù)公司;Eclipse E100正置光學(xué)顯微鏡,日本Nikon;SU5000熱場發(fā)射掃描電鏡,日本日立有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗設(shè)計

根據(jù)韓洋[4]監(jiān)測到的國內(nèi)近距離冷鏈流通中存在的小幅度(約5 ℃)、大幅度(約12 ℃)和極端波動(升溫至0 ℃)情況,本文設(shè)計了3種溫度波動梯度范圍(-18～-12、-18～-6、-18～0 ℃),使研究更貼合實際運輸情況。

將冷凍南美白對蝦整蝦隨機分為3組(n=900),分別進行-18～-12、-18～-6、-18～0 ℃溫度波動處理。溫度波動過程主要是將冷凍南美白對蝦整蝦置于-18 ℃冰箱中并用溫度計實時監(jiān)測其環(huán)境溫度,溫度穩(wěn)定后調(diào)節(jié)冰箱溫度至目標溫度(-12、-6、0 ℃),待其環(huán)境溫度穩(wěn)定在目標溫度后保持1 h,隨后將其溫度調(diào)回-18 ℃并在此溫度下貯藏24 h,即完成1次溫度波動。重復(fù)上述操作,分別取溫度波動0、1、3、5、7次的樣品進行相關(guān)指標的測定。

1.3.2 持水性測定

1.3.2.1 水分含量

水分含量測定參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中直接干燥法。

1.3.2.2 解凍損失

稱量解凍前和解凍后南美白對蝦的質(zhì)量,分別記為m1和m2,按公式(1)計算解凍損失:

(1)

1.3.2.3 離心損失

參考王玥科等[8]實驗方法并略有改動。稱量去頭、去殼后的南美白對蝦的質(zhì)量,記為m3;用兩層濾紙包裹后置于離心管中,離心(5 000 r/min,15 min,4 ℃)后稱量樣品質(zhì)量,記為m4。按公式(2)計算離心損失:

(2)

1.3.3 質(zhì)地剖面分析(texture profile analysis,TPA)及剪切力測定

參考李學(xué)鵬[9]的方法并略作修改。采用質(zhì)構(gòu)儀對南美白對蝦腹部第二節(jié)進行2次質(zhì)地剖面分析。測定參數(shù)如下:采用P/5平底柱形探頭,測前速率為3.00 mm/s,測試速率為1.00 mm/s,測后速率為1.00 mm/s,壓縮變形率為50%,探頭2次測試停留間隔時間為5 s,觸發(fā)力為5 g,每組測定6個樣品并取平均值。

參考邱澤慧等[10]的方法并稍作修改。采用WBS探頭,沿垂直于南美白對蝦第二腹節(jié)方向完全切斷,測前速率為5.00 mm/s,測試速率為1.00 mm/s,測后速率為10.00 mm/s,壓縮程度為50%,每組樣品測6組平行并取平均值。

1.3.4 肌原纖維蛋白的提取

參考楊慧等[11]的方法并稍作修改。在2.0 g切碎的蝦肉中加入10倍體積預(yù)冷緩沖液A(0.1 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5),均質(zhì)(10 000 r/min,30 s/次)2次后離心(10 000 r/min, 10 min, 4 ℃)取沉淀。加入5倍體積緩沖液繼續(xù)離心(10 000 r/min,10 min,4 ℃),重復(fù)2次,最后所得沉淀加入相同體積緩沖液B(0.6 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5)后在4 ℃下浸提2 h,用雙層紗布過濾除去不溶性部分,濾液即為肌原纖維蛋白溶液。以牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)制作標準曲線,采用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度。

1.3.5 蛋白質(zhì)巰基含量的測定

根據(jù)ZHANG等[12]的測定方法并稍作修改。將提取的肌原纖維蛋白溶液調(diào)整為4 mg/mL,取0.5 mL蛋白溶液中加入4.5 mL 0.2 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5),充分混合。取上述混合液4 mL,加入0.5 mL DTNB,混合均勻后置于40 ℃水浴25 min。以0.6 mol/L的NaCl溶液代替蛋白質(zhì)溶液作為對照組,在波長412 nm處測定吸光度。按公式(3)計算巰基含量:

(3)

式中:A412,412 nm處的吸光度;n,蛋白質(zhì)的稀釋倍數(shù);4,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,mg/mL;13 600,摩爾吸光系數(shù),L/(mol·cm)。

1.3.6 內(nèi)源熒光強度的測定

參照ZHANG等[13]測定方法并稍作改動。調(diào)整肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL,采用F-4600熒光分光光度儀進行測定。設(shè)置參數(shù)如下:激發(fā)波長為295 nm,發(fā)射光譜范圍為300～400 nm,掃描速度為1 200 nm/min。

1.3.7 SDS-PAGE

參考LAEMMLI[14]的測定方法并加以調(diào)整。調(diào)整肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL,加5×非還原蛋白上樣緩沖液并充分混合。在體積分數(shù)4%～20%的預(yù)制膠中進行電泳,上樣量為10 μL,在120 V電壓下電泳1 h。跑完后將凝膠置于體積分數(shù)0.1%考馬斯亮藍R-250染色10 min,用脫色液脫色。

1.3.8 冰晶形態(tài)的觀察與測定

參考ZHANG等[7]描述的蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色方法,觀察蝦肌肉組織中冰晶形態(tài)的變化情況。將樣品浸于固定液中過夜,用系列不同體積分數(shù)乙醇溶液(50%、70%、80%、90%、95%、100%)進行梯度洗脫,用石蠟包埋后于切片機下切成5 μm厚的切片,通過HE染色后在光學(xué)顯微鏡下進行觀察。

參考史羽瑤等[15]的方法,使用ImageJ圖像分析軟件對橫截面切片圖像進行處理并計算冰晶平均橫截面積和圓度,以評價冰晶的大小和形態(tài)。每組樣品至少選取3張圖片進行計算,圖中的有效冰晶個數(shù)不少于100個,以確保數(shù)據(jù)分析的準確性。

1.3.9 肌纖維微觀結(jié)構(gòu)測定

根據(jù)ZHANG等[7]方法并略有改動。將解凍后的樣品切成2～3 mm厚的小塊,置于2.5%戊二醛固定液中固定24 h,隨后用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5)洗脫3次,每次15 min;并用不同體積分數(shù)的乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)進行梯度洗脫,每次10 min;冷凍干燥,鍍金后于掃描電鏡下進行觀察。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

每組實驗至少重復(fù)3次以上,結(jié)果以平均值±標準差表示。通過SPSS軟件進行單因素方差分析(Duncan’s法),顯著性差異為 95%置信區(qū)間(P<0.05)。所有圖的繪制使用Origin 2023軟件;采用SIMCA 14.1軟件進行偏最小二乘法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度波動對冷凍南美白對蝦冰晶形態(tài)的影響

2.1.1 冰晶形態(tài)的變化

冷鏈物流中溫度波動將導(dǎo)致冰晶的重結(jié)晶,當冰晶再次凍結(jié)時會以小冰晶的積聚、遷移和表面等滲形式生長,從而使得冰晶體積變大、形態(tài)變得不規(guī)則化,擠壓肌肉組織甚至刺破細胞膜,造成不可逆的機械損傷,引起持水性、質(zhì)構(gòu)特性等食用品質(zhì)的降低[16]。冷凍南美白對蝦在不同溫度波動下組織橫截面和縱截面中冰晶形態(tài)的變化如圖1所示,可看到未波動組的南美白對蝦肌纖維連接緊密,部分出現(xiàn)組織間隙,但冰晶細小且分布均勻。隨著溫度波動次數(shù)和范圍的增大,冰晶變得大且不規(guī)則,逐漸占據(jù)細胞外空間,肌纖維間隙增加,使得組織完整性降低。與-18～-12 ℃組相比,-18～-6 ℃和-18～0 ℃組樣品中冰晶形態(tài)變化更為明顯,波動1次后冰晶開始呈現(xiàn)出大而不規(guī)則的形態(tài),肌纖維間存在較大間隙。尤其-18～0 ℃組波動7次后冰晶體積顯著增加,部分肌纖維膜不連貫,甚至嚴重解體,形成大量小碎片。溫度波動次數(shù)和范圍越大,小冰晶積聚、遷移和表面等滲的程度越劇烈,形成的大且不規(guī)則冰晶極易導(dǎo)致肌肉軟化和肌纖維的形變[17]。ZHANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦在-18～4 ℃波動6次后肌肉細胞外空間明顯變大,甚至導(dǎo)致肌肉嚴重解體,冰晶生長也會降低結(jié)締組織的機械強度,從而引起質(zhì)構(gòu)特性的下降。

2.1.2 平均橫截面積及圓度分析

通過ImageJ圖像分析軟件計算出冷凍南美白對蝦橫截面中冰晶的平均橫截面積和圓度,可準確地顯示出冰晶的大小和形態(tài),以更好地判斷溫度波動過程中冰晶的變化對南美白對蝦品質(zhì)的影響[19]。結(jié)果如圖2所示。

3組樣品中冰晶的橫截面積整體上呈現(xiàn)增加的趨勢,-18～0 ℃組波動7次橫截面積由322.07 μm2增加至2 059.91 μm2,增加幅度顯著高于其余兩組。圓度值可用來描述冰晶的形態(tài)大小,圓度值越接近1其形態(tài)越圓且規(guī)則。3組樣品的圓度值在波動前3次均未發(fā)生顯著性變化(P>0.05),在波動5次后開始顯著性降低,波動7次后3組樣品的圓度值從0.58分別下降至0.52、0.52和0.45。這說明溫度波動過程中前期冰晶的生長主要以體積增大為主,但隨著波動次數(shù)和范圍的增加,冰晶形態(tài)開始不規(guī)則化,從而導(dǎo)致波動后期對肌肉組織的損傷更為嚴重。

2.2 溫度波動對冷凍南美白對蝦持水性的影響

持水性一般指肌肉組織網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中保留水分的能力,是衡量水產(chǎn)品品質(zhì)好壞的重要指標[20]。水分是南美白對蝦中含量最豐富的成分,它直接影響蝦類在溫度波動過程中持水性、質(zhì)構(gòu)特性等品質(zhì)變化[21]。由表1可知,-18～-12、-18～-6、-18～0 ℃組樣品水分含量整體上均隨波動次數(shù)的延長呈下降趨勢,波動7次后-18～-12 ℃顯著高于其余2組(P<0.05)。3組樣品經(jīng)溫度波動7次后解凍損失由1.86%分別增加至3.29%、3.56%和3.86%,但-18～-12 ℃和-18～-6 ℃組沒有顯著性差異(P>0.05)。各組離心損失與解凍損失變化趨勢一致,-18～0 ℃組離心損失一直保持最高,表明溫度波動幅度越大,持水性越差。

表1 不同溫度波動對冷凍南美白對蝦持水性的影響Table 1 Effect of different temperature fluctuations on water holding capacity of frozen L. vannamei

水產(chǎn)品肌肉組織中85%以上的水分存在于肌原纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及其間隙中[22],由此推斷汁液流失主要與肌纖維的收縮程度及完整性有關(guān)。環(huán)境中的溫度波動會使得冷凍品出現(xiàn)凍融現(xiàn)象,導(dǎo)致冰晶發(fā)生重結(jié)晶,改變冰晶的大小和形態(tài)[16],從而擠壓甚至刺破肌纖維細胞,引起解凍損失增加。3組樣品的離心損失及解凍損失均發(fā)生增加與圖2中冰晶面積增加、形態(tài)逐漸不規(guī)則化的趨勢相一致。當溫度波動次數(shù)過多時,肌肉細胞受損嚴重,其細胞間結(jié)合力下降,一旦在外力的作用下如離心處理時,肌肉中的水分會流出,造成較大的離心損失[23]。同時,重結(jié)晶過程中冰晶的生長會導(dǎo)致水分的遷移,不易流動水逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤鞒?使得水分含量降低。溫度波動幅度越小,持水性越好,這可能是因為環(huán)境溫度波動小,冰晶發(fā)生重結(jié)晶程度小,從而對肌肉組織形成的機械性損傷小,圖1中可直觀看出-18～0 ℃組發(fā)生冰晶重結(jié)晶現(xiàn)象較其余2組嚴重。

a-橫截面;b-縱截面

a-平均橫截面積;b-圓度

2.3 溫度波動對冷凍南美白對蝦質(zhì)構(gòu)特性的影響

硬度、內(nèi)聚性和咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特性指標對評價水產(chǎn)品品質(zhì)和消費者可接受度具有十分重要的意義。質(zhì)構(gòu)特性主要與肌肉組織結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有關(guān),在溫度波動過程中冰晶重結(jié)晶形成的較大冰晶會破壞肌纖維細胞的完整性;水分的遷移也可能會奪走與蛋白質(zhì)表面結(jié)合的水,使得其二硫鍵暴露導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,從而引起質(zhì)構(gòu)的劣變現(xiàn)象[24]。如圖3所示,3組樣品的硬度在溫度波動過程中均呈現(xiàn)下降趨勢。與-18～-12 ℃和-18～-6 ℃組樣品相比,-18～0 ℃組南美白對蝦的硬度顯著降低(P<0.05)。波動7次后,3組樣品的硬度分別減少15.54%、18.14%和19.54%。內(nèi)聚性和咀嚼性均隨波動次數(shù)的增加而減小,與硬度變化趨勢相同,但3組之間無顯著性差異(P<0.05)。ZHANG等[7]研究中空白組凡納濱對蝦的硬度隨溫度波動次數(shù)的增加而顯著降低,且顯著低于海藻糖組,其推斷可能是由于溫度波動期間冰晶的形成和生長導(dǎo)致的肌原纖維部分變性引起的聚集和水分損失。其中,-18～-12 ℃組樣品的內(nèi)聚性和咀嚼性在溫度波動過程中均無顯著性差異(P<0.05),表明小幅度的溫度波動對南美白對蝦內(nèi)聚性和咀嚼性并無影響。

剪切力是評價水產(chǎn)品嫩度的一個重要指標,也可反映肌原纖維蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)狀態(tài)[25]。由圖3-b可知,在溫度波動過程中3組樣品剪切力不斷下降,但-18～-12 ℃和-18～-6 ℃組整體無明顯差異(P>0.05);而-18～0 ℃組在波動5次后開始差異顯著,到第7次其剪切力達到3 501.53 g。這說明溫度波動幅度越大,剪切力越小,進一步驗證說明大幅度的溫度波動引起的重結(jié)晶會使得冰晶大而不規(guī)則,破壞肌肉纖維組織,導(dǎo)致肌原纖維蛋白變性,剪切力降低。

a-硬度、內(nèi)聚性;b-咀嚼性、剪切力

2.4 溫度波動對冷凍南美白對蝦蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響

2.4.1 巰基含量

巰基是肌肉蛋白質(zhì)中最敏感的官能團之一,70%以上的巰基存在于肌原纖維蛋白中,當它受到自由基攻擊時極易氧化成二硫鍵,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性[26]。如圖4所示,各組樣品的巰基含量均呈現(xiàn)下降趨勢,這與上文提到的質(zhì)構(gòu)特性變化趨勢相一致。波動7次時,-18～-12、-18～-6、-18～0 ℃組的巰基含量分別減少20.07%、30.44%和35.32%,-18～0 ℃組巰基含量下降程度是-18～-12 ℃和-18～-6 ℃的1.76和1.16倍,且顯著低于其余2組(P<0.05)。SRIKET等[27]研究發(fā)現(xiàn)黑虎蝦和南美白對蝦巰基含量隨凍融循環(huán)次數(shù)的增加而減少。這主要歸因于溫度波動會對肌肉細胞組織造成機械性損傷,破壞肌原纖維蛋白內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu),使得巰基暴露出來從而被氧化成二硫鍵,進一步氧化則會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的交聯(lián)。溫度波動幅度越大,重結(jié)晶所形成的冰晶越大,肌肉組織損傷越嚴重,巰基含量越低。

圖4 不同溫度波動對冷凍南美白對蝦蛋白質(zhì) 巰基含量的影響Fig.4 Effects of different temperature fluctuations on sulfhydryl content of frozen L. vannamei

2.4.2 內(nèi)源熒光強度

色氨酸殘基主要位于蛋白質(zhì)內(nèi)核中,其極易受周邊微環(huán)境極性的影響,一旦色氨酸暴露于極性環(huán)境時,蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光強度會降低,因此內(nèi)源熒光強度常被廣泛用于蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的測定[28]。不同溫度波動對冷凍南美白對蝦的內(nèi)源熒光強度均會產(chǎn)生影響(圖5)。-18～-12、-18～-6、-18～0 ℃組的冷凍南美白對蝦在溫度波動過程中內(nèi)源熒光強度均呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P<0.05)。這表明蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)經(jīng)過溫度波動后逐漸展開,內(nèi)部的色氨酸殘基暴露在極性環(huán)境中,因此極易與蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)生的過氧化氫自由基反應(yīng)形成穩(wěn)定的化合物,導(dǎo)致熒光猝滅。-18～0 ℃組的內(nèi)源熒光強度下降程度最大,且顯著低于其余2組。與巰基相同,較大的溫度波動幅度會導(dǎo)致更大且不規(guī)則的冰晶,從而對肌原纖維蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)造成的破壞較大,一定程度上也會影響持水性及質(zhì)構(gòu)特性的變化。DU等[26]研究結(jié)果也證實反復(fù)凍融形成的大冰晶會加劇蛋白質(zhì)的氧化程度,從而引起內(nèi)源熒光強度的降低。

2.4.3 SDS-PAGE圖譜

圖6為不同溫度波動下冷凍南美白對蝦肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖譜,其中主要條帶:肌球蛋白重鏈(約220 kDa),副肌球蛋白(約100 kDa),肌動蛋白(約48 kDa)和原肌球蛋白(約34 kDa)。隨著溫度波動次數(shù)的增加,4個條帶均逐漸變窄變淺,但肌動蛋白條帶變化不明顯。-18～-12 ℃組變化最小,其肌球蛋白重鏈條帶在波動7次后仍顯示出較寬且清晰的條帶;而-18～-6 ℃組和-18～0 ℃組的肌球蛋白重鏈條帶分別在波動3次和5次后變窄變淺。這一結(jié)果與巰基含量和內(nèi)源熒光強度變化情況相同,推斷可能因為溫度波動過程中較大冰晶的形成破壞了蛋白質(zhì)內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)分子不穩(wěn)定被氧化引起蛋白質(zhì)交聯(lián)、聚集,導(dǎo)致部分較大蛋白分子無法進入凝膠。姜晴晴等[23]發(fā)現(xiàn)凍融循環(huán)后肌原纖維蛋白分子間二硫鍵、二酪氨酸的形成引起的蛋白聚集是導(dǎo)致重鏈肌球蛋白條帶變窄變淺的主要原因。這也進一步解釋說明了溫度波動會使得肌原纖維蛋白發(fā)生交聯(lián)和聚集,溫度波動次數(shù)越多、波動幅度越大,則蛋白質(zhì)氧化變性程度越大。

圖6 不同溫度波動對冷凍南美白對蝦肌原纖維蛋白SDS-PAGE的影響Fig.6 Effects of different temperature fluctuations on SDS-PAGE pattern of myofibril protein of frozen L. vannamei

2.5 溫度波動對冷凍南美白對蝦組織結(jié)構(gòu)的影響

南美白對蝦的持水性及質(zhì)構(gòu)特性的變化與肌肉組織的微觀結(jié)構(gòu)密切相關(guān),通過圖7可對不同溫度波動下其肌肉組織的形態(tài)變化進行觀察,以判斷出其品質(zhì)的好壞。

從圖7中可以看出,未波動組橫截面肌肉組織平整,存在少許冰晶留下的小孔洞,肌纖維束縱向排列緊密且有序。隨著波動次數(shù)和范圍的增加,橫截面逐漸變得凹凸不平,孔洞增大且出現(xiàn)部分蜂窩狀小孔洞;肌纖維發(fā)生形變且間隙增加明顯,尤其在波動7次后,-18～0 ℃組肌纖維間不相連,甚至出現(xiàn)斷裂,推斷這主要是冰晶生長對肌纖維造成的擠壓,使得肌肉組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不可逆的變形。這與圖2中冰晶的大小和形態(tài)演變一致,深入驗證了溫度波動過程中冰晶重結(jié)晶的程度決定其品質(zhì)的好壞。QIAN等[29]研究發(fā)現(xiàn)肌肉組織間孔洞大小會影響肌肉組織的持水能力和汁液流失的程度,與上文解凍損失和離心損失變化趨勢相一致。LI等[30]研究證明了肌肉組織完整性的減小會導(dǎo)致質(zhì)構(gòu)劣變,本文研究中硬度、內(nèi)聚性、咀嚼性等結(jié)果與肌肉組織完整性變化相關(guān)。周聃等[31]認為肌纖維排列越致密,其硬度和咀嚼性越大,這與本文中硬度和咀嚼性研究結(jié)果相一致。

a-橫截面;b-縱截面

2.6 溫度波動對冷凍南美白對蝦持水性及質(zhì)構(gòu)的影響機制

通過偏最小二乘法(partial least squares regression,PLS-R)來分析持水性、質(zhì)構(gòu)特性、冰晶形態(tài)及蛋白質(zhì)氧化間的相關(guān)關(guān)系,結(jié)果如圖8所示。

圖8 偏最小二乘回歸相關(guān)圖Fig.8 PLS-R correlation map

PC1和PC2方差貢獻率分別為89.20%和3.98%,總貢獻率達到了93.18%,說明此模型能較好地評價各組別及指標間的相關(guān)性,且各組別間距離越遠則表示經(jīng)過不同溫度波動處理后南美白對蝦間存在差異。-18～-12、-18～-6、-18～0 ℃組南美白對蝦在經(jīng)過溫度波動后逐漸分布于右半部分,說明其分別在波動7、5和3次后各指標發(fā)生顯著性變化(P<0.05),-18～0 ℃組各樣品點分布較遠,說明該組受溫度波動影響變化程度較大,驗證了上文中-18～0 ℃組持水性及質(zhì)構(gòu)特性較其余2組差的結(jié)論。剪切力、咀嚼性、內(nèi)聚性、硬度和內(nèi)源熒光強度、巰基含量、圓度值之間具有較強的相關(guān)性,這表明蛋白變性一定程度上會導(dǎo)致質(zhì)構(gòu)特性劣變,這與吳興閣等[32]的研究結(jié)果相一致。巰基含量和內(nèi)源熒光強度值的降低會引起水分含量的下降,這意味著蛋白變性后內(nèi)部空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞,出現(xiàn)汁液流失現(xiàn)象。解凍損失、離心損失和平均橫截面積間顯著相關(guān)(P<0.05),且平均橫截面積越大,解凍損失和離心損失越大,這說明冰晶的生長會引起持水性的下降。因此,綜合前面的分析結(jié)果進一步說明在溫度波動過程中冰晶形態(tài)和蛋白變性程度均會影響冷凍南美白對蝦的持水性和質(zhì)構(gòu)特性。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示,隨著溫度波動次數(shù)的增加,3組溫度波動組南美白對蝦的水分含量、硬度、內(nèi)聚性、咀嚼性和剪切力逐漸減少,解凍損失、離心損失逐漸增加,表明在溫度波動過程中持水性及質(zhì)構(gòu)特性發(fā)生劣變且隨著波動范圍的增加劣變程度加劇。巰基含量、最大內(nèi)源熒光強度不斷下降,且SDS-PAGE圖顯示肌原纖維蛋白部分發(fā)生氧化變性;通過微觀結(jié)構(gòu)更直觀地發(fā)現(xiàn)溫度波動過程中各組的冰晶和肌肉組織中的孔洞逐漸增大且不規(guī)則化。此外,通過PLS-R進一步闡明蛋白變性和冰晶的重結(jié)晶是引起持水性及質(zhì)構(gòu)特性下降的主要原因。因此,溫度波動次數(shù)增加會加劇南美白對蝦持水性和質(zhì)構(gòu)特性的下降,應(yīng)盡量避免冷鏈流通過程中多次大幅度甚至極端溫度波動情況的發(fā)生。