張迎陽,陳文濤,徐瑩,孫承駿,鄒林玲,鄒平,滿在偉

(常州大學(xué) 藥學(xué)院/生物與食品工程學(xué)院,江蘇 常州,213164)

有氧生物的新陳代謝和呼吸過程中會產(chǎn)生活性氧[1](reactive oxygen species,ROS), 當(dāng)ROS自由基產(chǎn)生過多且沒有被完全清除時,它們可以攻擊附近的分子,造成細(xì)胞的氧化損傷[2]。目前,因天然抗氧化肽結(jié)構(gòu)簡單,同時比酶類抗氧化劑更穩(wěn)定,不會產(chǎn)生危險的免疫反應(yīng),可以作為外源性抗氧化劑維持體內(nèi)的氧化還原平衡[3]。

肉類蛋白是一種極佳的抗氧化肽來源,與豆類蛋白相比,肉類蛋白富含更多的人體必需氨基酸,如Arg、Lys和Gly等[4],不同肉類制備的水解液可以作為必需氨基酸的良好來源[5],且其容易被人體吸收[6]。與其他蛋白資源相比,肉類蛋白具有不同的氨基酸的種類和水平,這為制備出不同結(jié)構(gòu)的抗氧化肽帶來更多的可能性。近年來,針對抗氧化肽制備、分離純化和鑒定序列方面的研究較多[7],分離純化抗氧化肽的方法有很多,凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜法較為常見,但隨著研究的深入,大孔樹脂也被用于抗氧化肽的分離純化。WANG等[8]通過凝膠色譜法從鯖魚內(nèi)臟中分離出了具有抗氧化活性的三肽MVH;YANG等[9]利用色譜法從鱷魚肉水解物中分離出了4種具有抗氧化活性的肽:SSLTIQFVEGQFVDSYDPTIENTFTK、VPPHIY、VAPEEHPVLLTEAPLNPK和RNGLPGPIGPAG;CAI等[10]從干腌宣威火腿中分離出了7種具有活性肽;LI等[11]選用XAD-7HP大孔樹脂分離出了紫花蕓豆中的抗氧化肽。

本課題以干腌牛肉為原料,以鹽酸提取法提取多肽,通過AB-8型大孔樹脂及C18球形硅膠柱的分離純化出抗氧化肽,借助質(zhì)譜的技術(shù)進(jìn)行了抗氧化肽的鑒定,利用分子對接4種抗氧化肽與SOD的結(jié)合方式,為后續(xù)開發(fā)干腌牛肉制品提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

干腌牛肉,滇南回鄉(xiāng)食品有限公司;AB-8、D101、S-8、X-S、HPD-500、NKA-9,凱威化工;C18球形硅膠柱,常州三泰生物科技公司;鹽酸、無水乙醇、乙腈、三氟乙酸、DPPH、ABTS、氯化硝基四氮唑藍(lán)(p-nitro-blue tetrazolium chloride, NBT)、吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate, PMS)、牛源超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、NADH,阿拉丁(上海)生物試劑公司,均為分析純;SOD活力檢測盒,南京建成生物。

721 N可見光分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;多功能離心機(jī),艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司;SHB-ⅢA環(huán)水式真空泵,上海聚昆儀器設(shè)備有限公司;ATY224精密電子天平,常州萬泰天平儀器有限公司;UV-3600紫外可見近紅外分光光度計,島津企業(yè)管理(中國)有限公司;Q ExactiveTMPlus質(zhì)譜儀,賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多肽的處理

1.2.1.1 多肽的提取

根據(jù)LI等[12]的方法稍加修改。采用鹽酸提取法,剝?nèi)ト庋劭梢姷闹竞徒Y(jié)締組織用勻漿機(jī)將50 g肌肉在250 mL 0.01 mol/L鹽酸中勻漿。均質(zhì)采用4次沖程,每次30 s,在冰水中冷卻。勻漿在低溫(12 000×g,4 ℃,20 min)下離心,快速定性濾紙過濾后,用乙醇按料液比1∶3(g∶mL)變性沉淀上清液中的蛋白質(zhì)組分。將混合物在4 ℃下放置20 min后在4 ℃下以12 000×g離心20 min。將混合物在50 ℃、55 r/min的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去乙醇,然后冷凍干燥并儲存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

測定采用雙縮脲法[13],在540 nm波長下測定吸光度,以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度(0、2、4、6、8、10 mg/mL)為橫坐標(biāo)(x),A540nm吸光值為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,算得樣品溶液的多肽含量。通過雙縮脲法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.255x+0.003 3,R2=0.999 9,曲線擬合良好。

1.2.2 抗氧化能力測定

1.2.2.1 DPPH自由基清除能力測定

(1)

式中:As、Ab分別代表樣品和空白的吸光度。

1.2.2.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

根據(jù)ILYASOV等[15]的方法稍加修改。用無菌水配制不同質(zhì)量濃度的抗氧化肽(1、2、3、4、5 mg/mL)。將5 mL 7 mmol/L ABTS溶液與88 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合,在20 ℃下放置20 h,加入約3倍體積時75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇,在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02,得到ABTS陽離子自由基。樣品由9.8 mL稀釋的ABTS陽離子自由基溶液和0.2 mL 1 mg/mL粗肽組成。以0.2 mL蒸餾水和9.8 mL稀釋的ABTS陽離子自由基溶液的混合物為空白,0.2 mL粗肽和9.8 mL蒸餾水為對照。所有混合物在室溫下放置0.5 h,用分光光度計在734 nm處測定。ABTS陽離子自由基清除能力按公式(2)計算:

(2)

式中:As、Ac、Ab分別表示樣品、對照和空白的吸光度。

1.2.2.3 超氧陰離子(·O2-)清除能力測定

根據(jù)CAI等[10]的方法稍加修改。用無菌水配制不同質(zhì)量濃度的抗氧化肽(1、2、3、4、5 mg/mL)。1.5 mL粗肽液,依次加入0.5 mL 300 μmol/L NBT(pH 8.0 Tris-HCl緩沖液配制),0.5 mL 468 μmol/L NADH(pH 8.0 Tris-HCl緩沖液配制), 0.5 mL 60 μmol/L PMS(pH 8.0 Tris-HCl緩沖液配制),振蕩混勻,25 ℃水浴5 min,560 nm波長測定吸光值,以緩沖液代替樣品作為空白對照。·O2-清除能力按公式(3)計算:

(3)

式中:As、Ab分別代表樣品和空白吸光度。

1.2.3 大孔樹脂的篩選

1.2.3.1 大孔樹脂預(yù)處理

本實驗選用6種不同性質(zhì)的大孔樹脂,分別為AB-8、D101、S-8、X-S、HPD-500、NKA-9。大孔樹脂預(yù)先用95%乙醇浸泡24 h,用蒸餾水多次沖洗大孔樹脂至無明顯乙醇味,流出液無渾濁后,用4% NaOH浸泡24 h,去除樹脂合成過程中的雜質(zhì),避免對樣品吸附造成影響[16]。處理完成的樹脂用蒸餾水清洗至中性后雙層濾紙濾去水分備用。

1.2.3.2 大孔樹脂的參數(shù)

不同性質(zhì)的大孔樹脂對于不同極性的物質(zhì)具有不同的分離效果,綜合比較6種不同大孔樹脂對于多肽的吸附率、解吸率的差異來篩選樹脂。不同樹脂的參數(shù)見表1。

表1 六種不同大孔樹脂的性質(zhì)比較Table 1 Comparison of properties of six different macroporous resins

1.2.3.3 吸附率的計算

選用AB-8、D101、S-8、X-S、HPD-500、NKA-9共6種大孔樹脂,取不同種類的大孔樹脂2.5 g于錐形瓶內(nèi),加入25 mL多肽液,放入恒溫振蕩箱中8 h(25 ℃,180 r/min)后取上清液測定溶液中剩余多肽含量。根據(jù)公式(4)計算吸附率:

(4)

式中:ρ1,吸附前溶液多肽含量,mg/mL;ρ2,吸附后溶液剩余多肽含量,mg/mL。

1.2.3.4 解吸率的計算

乙醇可以和大孔樹脂進(jìn)行分子態(tài)的物質(zhì)競爭吸附,使物質(zhì)溶解于乙醇,從而從大孔樹脂上解析下來[17]。將充分吸附8 h后的大孔樹脂放入錐形瓶內(nèi),加入25 mL 75%乙醇,放入恒溫振蕩箱中8 h(25 ℃,180 r/min)后取上清液測定溶液中剩余多肽含量。根據(jù)公式(5)計算解吸率:

(5)

式中:ρ1,吸附前溶液多肽含量,mg/mL;ρ2,吸附后溶液剩余多肽含量,mg/mL;ρ3,解吸后溶液多肽含量,mg/mL;V1,解吸液體積,mL;V2,吸附液體積,mL。

1.2.4 動態(tài)洗脫工藝的確定

1.2.4.1 確定最佳上樣流速

選用30 mm×300 mm的層析柱,將層析柱垂直安裝,采用濕法裝柱,將大孔樹脂裝入層析柱后蒸餾水沖洗平衡,然后上樣10 mL 5 mg/mL的多肽液。實驗選用1、2、3、4、5 BV/h的流速進(jìn)行收集,待大孔樹脂吸附30 min后加入75%乙醇,每管收集1 mL,按照1.2.1.2節(jié)的方法測定多肽含量,繪制曲線,確定最佳上樣流速。

1.2.4.2 確定最佳上樣量

根據(jù)最佳上樣流速進(jìn)行收集,每管收集1 mL,按照1.2.1.2節(jié)的方法測定多肽含量,繪制泄漏曲線,確定最佳上樣量。

1.2.4.3 確定最佳乙醇洗脫濃度

根據(jù)1.2.4.2節(jié)的最佳上樣量上樣,控制最佳上樣流速直至吸附飽和,選用不同體積分?jǐn)?shù)(55%、65%、75%、85%、95%)乙醇進(jìn)行洗脫,控制流速1 mL/min,每管收集1 mL,按照1.2.1.2節(jié)的方法測定多肽含量,繪制曲線,確定最佳乙醇洗脫濃度。

1.2.4.4 確定最佳洗脫速度

分別設(shè)置流速為0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0 mL/min進(jìn)行洗脫。每管收集1 mL,按照1.2.1.2節(jié)的方法測定多肽含量,繪制曲線,確定最佳洗脫速度。

1.2.4.5 大孔樹脂分離

根據(jù)最佳上樣量、最佳上樣流速、最佳乙醇洗脫濃度、最佳洗脫速度進(jìn)行吸附分離,分離后的不同組分根據(jù)1.2.2節(jié)的方法測試其抗氧化能力。

1.2.5 C18柱分離

C18球形硅膠柱選用常州三泰科技公司分離柱,粒徑15 mm,孔徑100 ?,柱尺寸20 g,最大工作壓力400 psi(27.5 bar),pH值范圍2～8。通過多點(diǎn)BET法測定的比表面積為312 m2/g, 孔徑為0.88 mL/g, 粒度分析儀測得硅膠柱粒度分布D50為15.2 mm, 采用元素分析法測得碳含量為16.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。流動相選用含有0.1%三氟乙酸的70%(體積分?jǐn)?shù))乙腈[18],選用經(jīng)大孔樹脂分離后抗氧化效果好的組分上樣,上樣量為5 mL,流速1 mL/min,每管收集1 mL備用。按照1.2.2節(jié)方法測試抗氧化能力。

1.2.6 抗氧化肽的鑒定

質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)依賴采集模式下運(yùn)行,自動在MS和MS/MS 采集間切換。質(zhì)譜參數(shù)[19]:1) MS:掃描范圍(m/z)為200～1 800;分辨率為70 000;AGC target為3e6;最大注入時間為50 ms;2) HCD-MS/MS:分辨率為17 500;AGCtarget:1e5;最大注入時間為45 ms;碰撞能量為28;動態(tài)排除時間為30 s。

1.2.7 分子對接

采用ChemBioDraw Ultra 14.0繪制多肽結(jié)構(gòu),將結(jié)構(gòu)導(dǎo)入ChemBio3D Ultra 14.0進(jìn)行能量最小化,將Minimum RMS Gradient設(shè)置為0.001,將小分子保存為mol2格式。將優(yōu)化好的小分子導(dǎo)入AutodockTools-1.5.6進(jìn)行加氫、計算電荷、分配電荷、設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵后保存為“pdbqt”格式。PDB數(shù)據(jù)庫下載SOD(PDB ID:1E9O)蛋白結(jié)構(gòu);使用Pymol 2.3.0去除蛋白結(jié)晶水、原始配體等,將蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDocktools(v1.5.6)進(jìn)行加氫、計算電荷、分配電荷、指定原子類型并保存為“pdbqt”格式。使用POCASA 1.1預(yù)測蛋白結(jié)合位點(diǎn),采用AutoDock Vina1.1.2進(jìn)行對接,SOD相關(guān)參數(shù)[20]設(shè)置為:center_x=16.3,center_y =28.4,center_z =74.9;搜索空間:size_x:50,size_y:50,size_z:50(每個格點(diǎn)的間距為0.375 ?),exhaustiveness:10,其余參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。

為測試多肽對于SOD的活力及酶活力單位影響,采用SOD活力檢測盒進(jìn)行檢測,測試方法按照其說明書進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗重復(fù)3次,數(shù)據(jù)采用Origin 9.0進(jìn)行分析處理,分子對接部分采用Pymol 2.3.0進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化能力的測定

測試不同濃度活性肽的抗氧化能力,發(fā)現(xiàn)隨著肽含量的增加,抗氧化能力也在逐漸增加,如圖1所示,當(dāng)肽含量為5 mg/mL時,DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和·O2-的清除率分別為86.24%、35.62%和54.34%。DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和·O2-清除活性可以反映大多數(shù)天然提取物的抗氧化活性。抗氧化肽主要通過電子轉(zhuǎn)移和氫原子轉(zhuǎn)移反應(yīng)來淬滅自由基,在淬滅自由基的2種機(jī)制中,與氫原子轉(zhuǎn)移相比,電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)非?？觳⑶也皇軘U(kuò)散控制[21-22]。因此,多肽在自由基清除活性方面的差異可能是由于肽含量的增加,賦予了抗氧化肽更強(qiáng)的氫原子轉(zhuǎn)移能力,進(jìn)而表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。

圖1 不同濃度多肽的抗氧化能力Fig.1 Antioxidant capacity of peptides at different concentrations

2.2 吸附率與解吸率

吸附率和解吸率是評價大孔樹脂分離能力的一項重要指標(biāo)。如圖2所示,通過對6種大孔樹脂進(jìn)行吸附率與解吸率測試,結(jié)果表明AB-8型大孔樹脂的吸附率和解吸率最好,分別為92.55%和82.88%。這可能是因為AB-8型大孔樹脂具有弱極性、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及高比表面積的特點(diǎn)[23],能對不同分子大小的化合物進(jìn)行篩選分離,適用于各類蛋白質(zhì)、多肽類的分離純化。因此選用AB-8型大孔樹脂進(jìn)行分離純化多肽。

圖2 六種大孔樹脂的吸附率與解吸率Fig.2 Adsorption and desorption rates of 6 macroporous resins

2.3 AB-8大孔樹脂的選用

大孔樹脂的分離能力受很多條件的影響,上樣速度、上樣量的差異、洗脫劑的濃度以及洗脫流速的差異都會影響最終分離效果。因為大孔樹脂對于多肽類的吸附不受pH的影響[11],因此我們比較了不同上樣速度、上樣量、洗脫劑濃度以及洗脫流速對于AB-8型大孔樹脂分離效果的影響。

2.3.1 確定最佳上樣流速

由圖3可知,不同上樣流速的分離效果有所差異,當(dāng)上樣流速為2 BV/h時,曲線迅速達(dá)到峰值,流出液的多肽含量為2.63 mg/mL,說明2 BV/h時大孔樹脂吸附迅速達(dá)到飽和,多肽未被充分吸附進(jìn)樹脂內(nèi)部就被沖出柱外[24],當(dāng)上樣流速為4 BV/h時,第21管的多肽含量達(dá)到了1.40 mg/mL,4 BV/h時的流出液多肽含量低于1、2、5 BV/h流速的,略高于3 BV/h的1.27 mg/mL,但由于3 BV/h的峰形拖尾嚴(yán)重,4 BV/h流速時,隨著收集管數(shù)的增加,第21管之后的多肽含量下降明顯,因此選用4 BV/h上樣流速較為合理。

圖3 不同上樣流速洗脫曲線Fig.3 Elution curves with different loading flow rates

2.3.2 確定最佳上樣量

用4 BV/h上樣流速收集溶液,測試多肽含量,由圖4可知,當(dāng)柱體積不變時,多肽含量隨著流出液的增加而增加,當(dāng)收集管數(shù)為39時,多肽含量達(dá)到最大值為2.52 mg/mL,最后開始緩慢下降,第60管時多肽含量為2.48 mg/mL,這說明在第39管時AB-8型大孔樹脂的吸附已經(jīng)趨于飽和狀態(tài)[24],因此選擇第39管(即39 mL)為最佳上樣量。

圖4 AB-8大孔樹脂泄漏曲線Fig.4 AB-8 macroporous resin leakage curve

2.3.3 確定最佳乙醇洗脫濃度

乙醇溶液通過削弱多肽與大孔樹脂之間的疏水相互作用[25],從而使吸附物洗脫下來,且乙醇溶液具有無毒性、易回收的特點(diǎn),因此選用乙醇作為洗脫劑。由圖5可知,不同濃度的乙醇溶液對于多肽有不同的洗脫效果,75%乙醇溶液洗脫的多肽含量最高為1.56 mg/mL,高于其他濃度的乙醇溶液,這可能是因為不同濃度的乙醇溶液對于多肽與大孔樹脂間的作用力影響有所差異,因此選用75%乙醇溶液為洗脫劑。

圖5 不同濃度乙醇洗脫曲線Fig.5 Elution curves of different concentrations of ethanol

2.3.4 確定最佳洗脫速度

洗脫流速也是影響洗脫效果的一個重要因素,太快的洗脫流速會導(dǎo)致多肽分子未能被洗脫劑洗脫出柱,太慢的洗脫速度則會導(dǎo)致多組分被一同洗脫出柱,分離效果受到影響[26]。根據(jù)2.3.3節(jié)的洗脫曲線,選用75%乙醇進(jìn)行洗脫,比較了不同流速的洗脫曲線,如圖6所示,當(dāng)洗脫流速為1 mL/min時,多肽含量最高為1.63 mg/mL,當(dāng)洗脫流速<1 mL/min時,洗脫曲線出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象,這可能是因為多組分被一同洗脫導(dǎo)致,當(dāng)洗脫流速>1 mL/min時,多肽含量相比于1 mL/min時減少,且最高峰位置出現(xiàn)后移現(xiàn)象,這可能是因為洗脫流速過快導(dǎo)致多肽與大孔樹脂未能充分分離。因此選用1 mL/min洗脫流速較為合適。

圖6 不同洗脫速度洗脫曲線Fig.6 Elution curves at different elution rates

2.3.5 AB-8大孔樹脂分離抗氧化肽

采用最佳工藝對多肽進(jìn)行分離,以收集管數(shù)為橫坐標(biāo)(x),OD240nm值為縱坐標(biāo)(y)。通過檢測OD240nm值可以分析AB-8型大孔樹脂分離的組分,結(jié)果如圖7所示,AB-8型大孔樹脂對于多肽具有良好的分離效果,共分離出A、B和C三個組分,將A、B和C三個組分冷凍干燥后配制為1 mg/mL的多肽溶液,測試其在1 mg/mL時的抗氧化能力,B組分的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和·O2-清除率最高,分別為73.33%、21.01%和63.33%,高于A、C組分。因此選擇B組分進(jìn)行后續(xù)分離。

a-AB-8樹脂分離組分;b-抗氧化能力

2.4 C18柱分離

AB-8型大孔樹脂通常用于分離不同組分,因此我們借助制備色譜柱(C18球形硅膠柱)進(jìn)行進(jìn)一步分離,C18柱具有分離效率高的特點(diǎn),可以將混合物分離純化為單一組分[27],廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)與多肽的純化。通過對B組分的進(jìn)一步分離,分離出了4個組分,如表2所示,分別為B-1、B-2、B-3和B-4。將4個組分冷凍干燥后配制為1 mg/mL的多肽溶液,測試其在1 mg/mL時的抗氧化能力,如圖8所示,B-1組分的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和·O2-清除能力最高,分別為76.55%、26.31%和73.65%,高于其他3個組分。對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果如表2所示,鑒定出4個組分,Score為多肽評分(http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/),得分為(0～1),越接近1,表明其預(yù)測該多肽的生物活性最強(qiáng)[28]。由表2可知FDGDF的多肽活性最強(qiáng),得分為0.948 8。半衰期為多肽的一個重要指標(biāo),通過預(yù)測(https://web.expasy.org/protparam/)多肽在哺乳動物體內(nèi)的半衰期,可以為后續(xù)開發(fā)相關(guān)多肽產(chǎn)品提供思路[29]。

表2 B組分成分分析Table 2 Analysis of B components

a-C18柱分離組分;b-抗氧化能力

2.5 分子對接

分子模擬是分析蛋白質(zhì)作用力的一項重要工具。SOD廣泛存在于各種生物體內(nèi),是生物體內(nèi)廣泛存在的一種抗氧化金屬酶,能夠催化·O2-生成氧和H2O2,在機(jī)體氧化與抗氧化的平衡中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[30-31]。牛的體內(nèi)也存在SOD(PDB ID;1E9O),相比較于牛體內(nèi)的其他抗氧化酶,SOD十分穩(wěn)定,牛紅細(xì)胞SOD在75 ℃下加熱數(shù)分鐘仍很少失活,對酸堿也較穩(wěn)定,可在pH 5.3～10.5范圍內(nèi)反應(yīng)。通過分離出的4種抗氧化肽;FDGDF、TGPGPW、FLSDH和KPFDAK與SOD進(jìn)行分子對接,結(jié)合量子化學(xué)的方法,推斷抗氧化肽與SOD的結(jié)合方式,為發(fā)現(xiàn)牛體內(nèi)的抗氧化機(jī)制提供研究基礎(chǔ),為后續(xù)開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品提供理論研究。

如圖9所示,FDGDF與SOD的結(jié)合能為-6.7 kcal/mol,證明具有較好的結(jié)合作用。FDGDF與SOD發(fā)生相互作用,主要是通過形成氫鍵以及疏水作用力,與Arg-141、Thr-135、Ala-138、Gly-139形成氫鍵,氫鍵的長度分別為3.20、3.24、3.07、3.05、3.24、2.87、3.32、2.87 ?;與Pro-60、His-78、Lys-134、Thr-56氨基酸形成疏水相互作用。

a-分子對接;b-分子作用力細(xì)節(jié)圖

如圖10所示,TGPGPW與SOD的結(jié)合能為-6.55 kcal/mol, 表明多肽與蛋白存在很強(qiáng)的結(jié)合作用,TGPGPW與SOD蛋白發(fā)生相互作用主要是通過形成氫鍵及疏水相互作用力,與Arg-141、Lys-134氨基酸形成很強(qiáng)的氫鍵相互作用,氫鍵的長度分別為3.09、3.29、3.24、2.94、2.92、2.90 ?,另外,還可以與Pro-60、Gly-59、Thr-56、Gly-139、Asp-11、Cys-55、Ser-140、Thr-135氨基酸形成疏水相互作用。

a-分子對接;b-分子作用力細(xì)節(jié)圖

如圖11所示,FLSDH與SOD的結(jié)合能為-6.6 kcal/mol,證明具有較好的結(jié)合作用。FLSDH與SOD發(fā)生相互作用,主要是通過形成氫鍵以及疏水作用力,與Gln-47、Ser-66、Asn-63、His-61、Lys-134形成氫鍵,氫鍵的長度分別為3.19、2.98、3.34、3.00、3.07、3.26 ?;與Thr-135、Pro-64、Pro-60氨基酸形成疏水相互作用。

a-分子對接;b-分子作用力細(xì)節(jié)圖

如圖12所示,KPFDAK與SOD的結(jié)合能為-7.35 kcal/mol,表明KPFDAK與SOD存在很強(qiáng)的結(jié)合作用,KPFDAK與SOD蛋白發(fā)生相互作用主要是通過形成氫鍵及疏水相互作用力,KPFDAK與SOD的Leu-142、Thr-56、Gly-139、His-61、Glu-131、Arg-141氨基酸形成很強(qiáng)的氫鍵相互作用,氫鍵的長度分別為2.82、2.95、3.07、3.24、2.93、2.91、2.99 ?;另外,還可以與Ser-140、Thr-135、Lys-134、Asn-63、His-78、Pro-60、Asp-11、Gly-12氨基酸形成疏水相互作用。

a-分子對接;b-分子作用力細(xì)節(jié)圖

如圖13所示,1 mg/mL的FDGDF可以有效增加SOD活力與酶活力單位,1 mg/mL時酶活力增加11.64%,酶活力單位增加697 U/mL。因此我們推斷FDGDF可以有效提高SOD活力與酶活力單位。

圖13 SOD活力與酶活力單位Fig.13 SOD activity and enzyme activity unit

3 結(jié)論

活性肽是指對生物機(jī)體的生命活動有益或具有生物活性的肽類化合物,屬于蛋白質(zhì)片段,起著調(diào)節(jié)機(jī)體功能平衡的作用。本實驗利用鹽酸提取法提取并發(fā)現(xiàn)干腌牛肉活性肽在5 mg/mL時對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和·O2-的清除率分別為86.24%、35.62%和54.34%。AB-8型大孔樹脂的吸附率與解吸率性能最好,分別為92.55%和82.88%。優(yōu)化得出AB-8的上樣流速4 BV/h、上樣量39 mL、乙醇洗脫體積分?jǐn)?shù)75%,洗脫流速1 mL/min,分離得到3個組分(A、B和C),測試選出抗氧化能力最好的B組分進(jìn)行C18柱分離,分離出4個抗氧化肽:FDGDF、TGPGPW、FLSDH和KPFDAK。與SOD(PDB ID;1E9O)進(jìn)行分子對接,發(fā)現(xiàn)FDGDF、TGPGPW、FLSDH和KPFDAK均可以與SOD形成氫鍵。本實驗通過大孔樹脂-C18柱聯(lián)用分離了干腌牛肉抗氧化肽,為干腌牛肉制品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。