侯菲翔,蔡燕雪,肖珊,王波,陳璇,王際輝*

1(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連,116034)2(東莞理工學(xué)院 生命健康技術(shù)學(xué)院,廣東 東莞,523808)

西蘭花(Brassicaoleraceavar.italica)屬于十字花科植物中的蕓薹屬甘藍(lán)種,也稱綠花菜、青花菜等[1],因營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高,被譽(yù)為“蔬菜之王”。原產(chǎn)于歐洲地中海意大利一帶,19世紀(jì)末傳入中國(guó),現(xiàn)已成為我國(guó)消費(fèi)者喜愛(ài)的蔬菜之一。西蘭花中還富含多種生物活性成分(如多酚類化合物、類黃酮、異硫氰酸鹽等),因此具有較強(qiáng)的抗氧化活力[2]。

由于代謝組學(xué)可發(fā)現(xiàn)樣品間的細(xì)微差別,故可對(duì)乳酸菌發(fā)酵食品的成分進(jìn)行定性或定量分析。目前,關(guān)于非靶向代謝組學(xué)應(yīng)用于硒酸鹽處理西蘭花芽[3]、環(huán)境光亮對(duì)西蘭花代謝組學(xué)的影響[4]、西蘭花小花創(chuàng)傷應(yīng)激的分子機(jī)制[5]均有報(bào)道,但關(guān)于非靶向代謝組學(xué)研究乳酸菌發(fā)酵西蘭花前后組分變化情況仍不明晰。

蘿卜硫素(sulforaphane)是一種異硫氰酸鹽,是最有前景的具有抗癌活性的天然植物活性物質(zhì)之一[6],蘿卜硫素可以激活醌還原酶或谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶等II型解毒酶,達(dá)到失活部分致癌基因的效果,最終發(fā)揮抗癌作用[7],同時(shí)蘿卜硫素也具備較強(qiáng)的抗氧化、抗肥胖、抗糖尿病等活性[8]。

在完整的西蘭花組織中,硫代葡萄糖苷與黑芥子酶被嚴(yán)格分開(kāi),只有組織細(xì)胞被破壞時(shí)才會(huì)相互接觸,因此蘿卜硫素等異硫氰酸鹽的生成對(duì)于植物來(lái)說(shuō)是一種主動(dòng)的防御機(jī)制,所產(chǎn)生的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)破壞其細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)的動(dòng)物或病菌等都能夠產(chǎn)生一定的生理毒性[9]。阻礙蘿卜硫素生成的主要原因有:(1)傳統(tǒng)烹飪及冷凍對(duì)西蘭花內(nèi)黑芥子酶的熱失活;(2)表皮特異硫蛋白(epithiospecifier protein,ESP)的存在使得生西蘭花中硫代葡萄糖苷降解后更加傾向于轉(zhuǎn)向生物活性很低的蘿卜硫素腈;(3)蘿卜硫素本身不穩(wěn)定且受熱易降解[10]。

針對(duì)這些問(wèn)題,前人主要提出兩種思路:一種是在西蘭花育苗時(shí)提高前體物硫代葡萄糖苷的含量,進(jìn)而增加蘿卜硫素的轉(zhuǎn)化量,如使用富硒肥、鹽離子、光照等外源性脅迫方式[11];另一種是在加工過(guò)程中改變酶活或添加保護(hù)劑等以減少蘿卜硫素的降解,提高其穩(wěn)定性[12]。雖然它們都在一定程度上被動(dòng)地保留了蘿卜硫素的含量,但仍然存在無(wú)法主動(dòng)促進(jìn)西蘭花生成更多蘿卜硫素的局限性。

本研究從西蘭花中篩選內(nèi)源乳酸菌對(duì)西蘭花泥進(jìn)行發(fā)酵,并對(duì)發(fā)酵前后西蘭花的基本營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定,通過(guò)非靶向代謝組學(xué)技術(shù),研究了代謝產(chǎn)物的種類和豐度并篩選出顯著性差異代謝物,最后分析了乳酸菌發(fā)酵對(duì)蘿卜硫素含量的影響。本課題的開(kāi)展為明確乳酸菌發(fā)酵西蘭花過(guò)程中的組分變化情況及其在新型功能性食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花選購(gòu)于東莞市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),經(jīng)鑒定品種為Brassicaoleraceavar.italica。MRS(de Man, Rogosa, and Sharpe)肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;3,5-二硝基水楊酸,上海源葉生物科技有限公司;蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品(≥90%,HPLC)、甲醇、乙酸胺、甲酸、甲醇、乙腈,美國(guó)Sigma公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQZY-78BV培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司;Spark酶標(biāo)儀,瑞士TECAN有限公司;PB9590破壁機(jī),中國(guó)奧克斯集團(tuán)有限公司;AB Triple TOF 6600質(zhì)譜儀,美國(guó)AB SCIEX公司;ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱,美國(guó)Waters公司;CV200冷凍濃縮機(jī),北京艾吉姆科技有限公司;Agilent 1250 Infinity II高效液相色譜,美國(guó)Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 西蘭花內(nèi)源乳酸菌的篩選

乳酸菌的篩選參考文獻(xiàn)[13],取西蘭花的花頂2 cm部分切出并收集100 g,加入到250 mL滅菌MRS肉湯培養(yǎng)基中,于37 ℃下孵育24 h。完成后取適量按10倍稀釋法稀釋至10-5CFU/g,取200 μL稀釋液轉(zhuǎn)移至滅菌MRS瓊脂培養(yǎng)基中并于37 ℃下孵育24 h。取平板上10個(gè)單菌落在另一滅菌MRS瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),分別對(duì)其命名為BrocLAB1-BrocLAB10,重復(fù)2次后得到純種菌并凍藏。

1.3.2 菌種鑒定

將菌液進(jìn)行細(xì)胞破碎,隨后提取菌種基因組DNA并送至廣東美格基因科技有限公司進(jìn)行菌種鑒定。PCR擴(kuò)增目的片段后使用引物8F和16SR對(duì)片段進(jìn)行Sanger測(cè)序并拼接。拼接好后的序列與NCBI的NT庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.3.3 西蘭花發(fā)酵

取西蘭花的花頂2 cm部分,按每300 g西蘭花加入200 mL滅菌水的比例加入破壁機(jī)破壁75 s,取出西蘭花泥并混勻。取250 g西蘭花泥于250 mL藍(lán)蓋試劑瓶中,加入選定菌種菌液使其濃度為108CFU/g,分別發(fā)酵0、12、24、36、48、60 h后立即停止,隨機(jī)分裝至透明真空袋后分別于4、-20和-80 ℃下貯存。

1.3.4 總蛋白含量

總蛋白含量使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)完成。停止發(fā)酵后取2 mg發(fā)酵西蘭花凍干粉溶解于1 mL體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇得到2 mg/mL 懸濁液,700 r/min下振蕩20 min后取20 μL上清液與200 μL BCA工作液于37 ℃下反應(yīng)20 min。隨后在酶標(biāo)儀內(nèi)562 nm波長(zhǎng)處觀察吸光值。以牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.913 8x+0.092 4,R2=0.998 4,結(jié)果表示為BSA當(dāng)量(mg BSA/g DW)。

1.3.5 總還原糖含量

總還原糖的測(cè)定方法為3,5-二硝基水楊酸法并在前人的研究方法[14]基礎(chǔ)上加以修改。停止發(fā)酵后取5 mg發(fā)酵西蘭花凍干粉溶解于1 mL 80%甲醇得到5 mg/mL懸濁液,700 r/min振蕩20 min后取200 μL上清液與200 μL DNS試劑混合并沸水浴加熱5 min,隨后將其稀釋至原來(lái)的1/10并在酶標(biāo)儀內(nèi)觀察波長(zhǎng)540 nm處吸光值。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.360 7x+0.051 2,R2=0.998 9,結(jié)果表示為葡萄糖當(dāng)量(mg Glucose/g DW)。

1.3.6 非靶向代謝組學(xué)

未發(fā)酵和發(fā)酵48 h的西蘭花樣品送至上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行非靶向植物代謝組學(xué)分析。具體檢測(cè)步驟參考文獻(xiàn)[15]如下:發(fā)酵西蘭花樣品在4 ℃條件下解凍,隨后選取不同處理組發(fā)酵西蘭花樣品至預(yù)冷的溶劑中[V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=2∶2∶1],渦旋混勻后在4 ℃下超聲波30 min,隨后在-20 ℃下靜置20 min后離心(10 000 r/min、4 ℃、20 min),上清液干燥后備用。分析時(shí)使用100 μL溶液[V(乙腈)∶V(水)=1∶1]渦旋復(fù)溶并離心(10 000 r/min、4 ℃、15 min),上清液進(jìn)樣。

色譜分析使用C18色譜柱分離,柱溫40 ℃,流速0.4 mL/min,進(jìn)樣量2 μL,流動(dòng)相A:25 mmol/L乙酸胺+體積分?jǐn)?shù)為0.5%甲酸的水溶液,流動(dòng)相B:甲醇。梯度洗脫程序如下:0～0.5 min,5% B;0.5～10.0 min,5%～100% B;10.0～12.0 min 100% B;12.0～ 12.1 min,100%～5% B;12.1～16.0 min 5% B。隨機(jī)順序自動(dòng)連續(xù)進(jìn)樣,環(huán)境溫度4 ℃。

西蘭花樣品一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜的采集和分析通過(guò)質(zhì)譜儀參考文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。ESI源分離條件如下:Ion Source Gas1 60,Ion Source Gas2 60,Curtain gas(CUR)30,樣本溫度600 ℃,IonSapary Voltage Floating(ISVF)±5 500 V(正負(fù)兩種模式),TOF MSm/z掃描范圍60～1 000 Da,產(chǎn)物離子m/z掃描范圍25～1 000 Da,TOF MS掃描累積時(shí)間0.20 s/spectra,產(chǎn)物離子掃描累積時(shí)間0.05 s/spectra。二級(jí)質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴型采集(information dependent acquisition,IDA)獲得,并且采用高靈敏度模式,去族電壓為±60 V(正負(fù)兩種模式),裂解電壓為(35±15) eV。IDA設(shè)置如下:Exclude isotopes within 4 Da,Candidate ions to monitor per cycle為10。

通過(guò)使用ProteoWizard和MSDAIL軟件,將原始數(shù)據(jù)由RAW格式轉(zhuǎn)換為mz XML格式、對(duì)齊峰位置、校正保留時(shí)間并提取峰面積,隨后依次進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定、數(shù)據(jù)預(yù)處理、數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)價(jià)和分析。

1.3.7 蘿卜硫素含量

參考文獻(xiàn)[13]的方法。取5 g發(fā)酵西蘭花,與5 mL去離子水振蕩混合并超聲波處理5 min,加入20 mL乙酸乙酯,于4 ℃、8 000 r/min下離心10 min,收集上清液后向沉淀再加入15 mL乙酸乙酯再離心,收集上清液于室溫下冷凍濃縮。完成后加入250 μL體積分?jǐn)?shù)為30%的乙腈,過(guò)0.22 μm有機(jī)尼龍微孔濾膜并加入到帶襯管的2 mL棕色色譜進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

色譜分析采用C18色譜柱分離,柱溫30 ℃,流速0.3 mL/min,進(jìn)樣量5 μL,流動(dòng)相A:0.1%甲酸溶液,流動(dòng)相B:0.1%甲酸乙腈溶液,等度洗脫程序?yàn)?.0～10.0 min,20% B。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為重復(fù)實(shí)驗(yàn)平均值,至少3次重復(fù),單因素方差分析使用SPSS 27.0軟件,均值比較測(cè)試方法為L(zhǎng)SD并通過(guò)Waller-Duncan進(jìn)行顯著性分析,不同字母表示差異顯著(P<0.05),所有數(shù)據(jù)由OriginPro 2023進(jìn)行作圖,實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選與西蘭花發(fā)酵產(chǎn)品特性

前期通過(guò)對(duì)西蘭花內(nèi)生菌篩選,共選出10株西蘭花內(nèi)源乳酸菌進(jìn)行16S rDNA片段擴(kuò)增測(cè)序,并在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)。物種注釋鑒定結(jié)果:BrocLAB1、BrocLAB3～9為植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarum),BrocLAB2～4、BrocLAB10則為戊糖乳桿菌(Lactiplantibacilluspentosus)。進(jìn)一步根據(jù)生長(zhǎng)曲線、產(chǎn)酸與耐酸曲線,最終在兩種物種各挑1株優(yōu)良菌種,BrocLAB1和BrocLAB10來(lái)進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)(表1)。

表1 篩選的西蘭花內(nèi)源乳酸菌的物種注釋結(jié)果Table 1 Species annotation of selected endogenous lactic acid bacteria in broccoli

2.2 總蛋白與總還原糖含量

西蘭花發(fā)酵過(guò)程中的總蛋白含量變化如圖1所示,未發(fā)酵的西蘭花樣品總蛋白含量為(96.1±13.6) mg BSA/g DW。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,西蘭花總蛋白含量略有下降,但整體呈波動(dòng)狀態(tài),特別在發(fā)酵60 h后為(82.6±8.7) mg BSA/g DW,發(fā)酵前后總蛋白含量整體變化不明顯(P>0.05)。

圖1 發(fā)酵后西蘭花總蛋白含量的變化Fig.1 Changes in total protein content of broccoli after fermentation

進(jìn)一步研究發(fā)酵前后西蘭花總還原糖含量變化,如圖2所示。發(fā)酵前西蘭花的總還原糖含量為(180.0±16.2) mg Glucose/g DW,與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[16]。發(fā)酵后,西蘭花樣品的總還原糖含量顯著下降,這可能是因?yàn)檫€原糖被用于乳酸菌的生長(zhǎng)和乳酸的生成[17]?？梢杂^察到發(fā)酵24 h后總還原糖含量急劇下降至(57.6±4.8) mg Glucose/g DW,而在48 h后又緩慢降至(51.6±5.9) mg Glucose/g DW,這說(shuō)明乳酸菌只在最開(kāi)始的24 h內(nèi)迅速消耗糖類物質(zhì)。

2.3 代謝組學(xué)鑒定與差異分析

非靶向代謝組學(xué)能對(duì)樣本中各類代謝物進(jìn)行分析,測(cè)定各代謝物的含量、表征代謝物分子的表現(xiàn)型并對(duì)比不同樣品組間的概況[3],能有效體現(xiàn)出生物體內(nèi)的代謝水平。通過(guò)匹配數(shù)據(jù)庫(kù)中代謝物的基本信息,包括分子質(zhì)量、保留時(shí)間以及二級(jí)碎裂譜圖,對(duì)西蘭花樣品代謝物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,等級(jí)均在Level 2以內(nèi)。發(fā)酵西蘭花樣品中共鑒定出977種代謝物,其中正離子模式鑒定到的代謝物589種,負(fù)離子模式388種。合并正離子模式和負(fù)離子模式下的所有代謝產(chǎn)物,并統(tǒng)計(jì)其分類后發(fā)現(xiàn)占比最高的前3個(gè)分別是脂質(zhì)和脂類化合物、有機(jī)酸及其衍生物、有機(jī)雜環(huán)化合物(表2)。同樣有研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)戊糖片球菌發(fā)酵西蘭花汁后有49.47%的非揮發(fā)性代謝物被分類為脂質(zhì)和脂類化合物分子[18]。

表2 正、負(fù)離子模式下鑒定到的發(fā)酵西蘭花 樣品中的代謝物分類Table 2 Metabolite classification identified in fermented broccoli samples in positive and negative ion modes.

單變量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)合多維統(tǒng)計(jì)分析是代謝組最常使用的一種組間顯著性差異代謝物的篩選方法。對(duì)西蘭花樣品中基于單變量統(tǒng)計(jì)分析方法檢測(cè)到的所有代謝產(chǎn)物進(jìn)行差異性分析,差異改變倍數(shù)(Fold Change,FC)取log2,采用火山圖的形式按照FC>1.5或FC<0.67,P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異代謝物,結(jié)果顯示,與Raw相比,發(fā)酵48 h后的西蘭花內(nèi)共鑒定出327個(gè)下調(diào)代謝物和162個(gè)上調(diào)代謝物,結(jié)果如圖3-a所示。進(jìn)一步對(duì)發(fā)酵西蘭花組間進(jìn)行正交偏最小二乘分析。每個(gè)分析模型均通過(guò)了置換檢驗(yàn)且Q2>5,選取變量權(quán)重值大于1、P<0.05的差異代謝物為顯著性差異代謝物,如圖3-b所示。從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),在所有的上調(diào)代謝物中,具有顯著性差異代謝物有山梨醇、L-3-苯基乳酸、3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙酸、丙氨酰苯丙氨酸、新綠原酸、山柰酚、L-乳酸、色氨酸、琥珀酸等;多次出現(xiàn)的下調(diào)顯著性差異代謝物有L-蘋果酸、泛糖苷、鳥(niǎo)苷、葡萄糖酸、尿苷、古龍酸、D-葡萄糖等。山梨醇被發(fā)現(xiàn)能提高蔬菜的貨架期[19]并發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后顯著上調(diào)。L-乳酸則是乳酸菌的主要產(chǎn)物,有報(bào)道指出乳酸菌能消耗大量蘋果酸并生成乳酸[20],結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后L-乳酸上調(diào),而L-蘋果酸為下調(diào)。山萘酚具有抗氧化和抗炎的效果[21],并發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后為上調(diào)的顯著性差異代謝物。有報(bào)道指出古龍酸是西蘭花中的一種酚酸類化合物[22],并發(fā)現(xiàn)它在發(fā)酵后下調(diào),這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相符[23]。

對(duì)顯著性差異代謝物進(jìn)行層次聚類分析并繪制熱圖,其結(jié)果如圖3-c所示,圖中不同色塊顏色表示對(duì)應(yīng)代謝物的相對(duì)表達(dá)量,聚在不同簇內(nèi)的代謝物具有不同的表達(dá)模式,這可能由于西蘭花在發(fā)酵前后,乳酸菌的發(fā)酵作用導(dǎo)致部分功能差異化,進(jìn)而激發(fā)了不同的代謝過(guò)程或細(xì)胞通路,最終引起代謝產(chǎn)物的差異。

為了進(jìn)一步直觀地體現(xiàn)出各代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)換關(guān)系,圖3-d展示了相關(guān)性系數(shù)|r|>0.8且P<0.05的代謝物分子對(duì)。圖中外圈上不同顏色的短弧線分別表示代謝產(chǎn)物所屬化學(xué)分類,內(nèi)圈起點(diǎn)代表各顯著性差異代謝物的種類和數(shù)量,相連接的線條表示各個(gè)代謝物之間的轉(zhuǎn)換關(guān)系相關(guān)性。從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),相較于未發(fā)酵的西蘭花樣品,經(jīng)過(guò)乳酸菌發(fā)酵后的部分代謝產(chǎn)物產(chǎn)生了顯著的轉(zhuǎn)化情況,這充分說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程對(duì)于西蘭花的代謝途徑具有明顯的改變作用,這種改變可以促進(jìn)具有功能性的小分子產(chǎn)生更高的表達(dá),賦予發(fā)酵食品更多的功能特性。

a-代謝產(chǎn)物火山圖;b-顯著性差異種類;c-聚類分析;d-代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)換情況

2.4 蘿卜硫素含量

根據(jù)蘿卜硫素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=8.862 5x+8 865.8,R2=0.988 0),分別測(cè)定未發(fā)酵西蘭花的蘿卜硫素含量為(869.1±56.1) μg/mL,這個(gè)結(jié)果略高于文獻(xiàn)報(bào)道的(724.61±8.24) μg/mL[24],這可能是品種的差異造成的。西蘭花樣品發(fā)酵48 h后含量為(1 768.9±12.9) μg/mL,含量顯著提高到未發(fā)酵樣品的203.53%(P<0.01)。蘿卜硫素是硫代葡萄糖苷的分解產(chǎn)物,推測(cè)蘿卜硫素含量的增加可能是由于西蘭花在乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中蘿卜硫素轉(zhuǎn)化率的提高所致。硫代葡萄糖苷根據(jù)反應(yīng)條件和其結(jié)構(gòu),經(jīng)歷復(fù)雜的酶促和非酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為各種產(chǎn)物。在黑芥子酶作用下,硫代葡萄糖苷解離生成葡萄糖和不穩(wěn)定的糖苷配基,隨后發(fā)生Lossen重排反應(yīng)分別生成異硫氰酸酯、腈類和其他降解產(chǎn)物[25]。乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中,環(huán)境pH值由于乳酸的產(chǎn)生導(dǎo)致下降,這可能是有利于蘿卜硫素產(chǎn)量提高的一個(gè)原因[25]。此外,也可能由于內(nèi)源微生物細(xì)胞壁降解酶的作用,在非發(fā)酵組織中不能正常反應(yīng)的硫代葡萄糖苷得以釋放最終轉(zhuǎn)化為蘿卜硫素[13]。

3 結(jié)論

本研究利用內(nèi)源乳酸菌對(duì)西蘭花泥進(jìn)行發(fā)酵,對(duì)比了發(fā)酵前后基本營(yíng)養(yǎng)指標(biāo),結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)含量基本不變,總還原糖含量顯著下降;使用非靶向代謝組學(xué)技術(shù),共鑒定出977種代謝物,其中代謝物化學(xué)分類占比最高的為脂質(zhì)和脂類化合物,明確了發(fā)酵對(duì)西蘭花代謝產(chǎn)物豐度的影響;最后測(cè)定西蘭花中蘿卜硫素在乳酸菌發(fā)酵后顯著提高至未發(fā)酵樣品的2倍。本研究的開(kāi)展為拓展西蘭花發(fā)酵產(chǎn)品在功能性食品中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。