王碩,梁婷,羅磊,劉永清,方勇,李森*,管驍

1(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院,上海,200093)2(國家糧食產(chǎn)業(yè)(城市糧油保障)技術(shù)創(chuàng)新中心,上海,200093) 3(南京財經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 南京,210023)

近年來,氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥在神經(jīng)疾病中的作用受到廣泛關(guān)注。氧化應(yīng)激是指機體對活性氧(reactive oxygen species, ROS)的清除效率低于其產(chǎn)生效率,導(dǎo)致機體、組織及細胞受到氧化損傷[1]。生物體內(nèi)與氧代謝有關(guān)的含氧自由基和易形成自由基的過氧化物統(tǒng)稱為ROS。其含有不成對的電子,因而具有較高的化學(xué)反應(yīng)活性。為了防止氧化損傷,機體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)會消除ROS的毒性影響,抗氧化系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和過氧化氫酶(catalase, CAT)等抗氧化酶和非酶類抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione, GSH)等[2]。健康機體的細胞行使正常功能需要ROS和抗氧化系統(tǒng)處于一個相對平衡的狀態(tài),過量的ROS會導(dǎo)致細胞大分子(DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì))受損[3],當打破這一平衡,ROS會攻擊細胞膜導(dǎo)致細胞分子結(jié)構(gòu)改變從而造成細胞功能障礙,也可以使蛋白質(zhì)交聯(lián)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性及酶的失活。

氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥是兩種病理狀態(tài),但它們相互關(guān)聯(lián)并相互影響[4]。當機體的還原和氧化反應(yīng)處于平衡狀態(tài)時,炎癥反應(yīng)可以作為一種防御機制發(fā)揮作用。ROS水平過高時,氧化應(yīng)激會造成能量代謝受損、細胞信號傳導(dǎo)和細胞周期改變、細胞轉(zhuǎn)運機制受損及生物活性功能失調(diào),產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[5]。ROS可以進一步引起主要大分子的修飾,在復(fù)雜的生物體中,氧化的蛋白質(zhì)可能通過形成細胞毒性聚集體而獲得毒性功能。氧化后的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等大分子直接影響關(guān)鍵神經(jīng)炎癥介質(zhì),而神經(jīng)炎癥可以誘導(dǎo)NADPH氧化酶的表達及其活性的增加,導(dǎo)致產(chǎn)生高度氧化的環(huán)境[6]。另外,ROS的積累和線粒體功能障礙與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病有關(guān)[7]。過度的氧化應(yīng)激可能會使大腦功能喪失,TELEANU等[4]發(fā)現(xiàn)ROS與抗氧化劑之間的不平衡以及氧化應(yīng)激通過影響細胞穩(wěn)態(tài)、Aβ和р-tau的形成上調(diào)來影響阿爾茲海默癥的發(fā)生。

植物多酚是一種廣泛存在于植物中的次生代謝物,具有極好的抗氧化能力。有研究表明,多酚及其衍生的代謝產(chǎn)物能夠有效地減少氧化應(yīng)激和炎癥,改善神經(jīng)系統(tǒng)疾病[8-9]。另外,前期研究發(fā)現(xiàn)小米多酚通過抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮神經(jīng)保護作用,而奎寧酸是小米多酚的主要成分之一[10]。雖然奎寧酸已被廣泛的用于合成具有抗氧化和抗菌作用的藥物[11],但對于奎寧酸在神經(jīng)細胞中的抗氧化功能和抗炎作用并沒有太多的報道。因此本研究采用H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激損傷模型驗證奎寧酸的抗氧化活性和神經(jīng)保護作用,為進一步探討奎寧酸在預(yù)防和治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病中的作用機制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y,中國科學(xué)院;奎寧酸,上海源葉生物科技有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、DMEM-F12培養(yǎng)基、青霉素鏈霉素、胰酶、引物序列(Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計)、PIPA裂解液,上海生工生物工程股份有限公司;H2O2,上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司;BCA蛋白濃度試劑盒、動物RNA抽提試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、GSH試劑盒、MTT細胞增殖及細胞毒性測定試劑盒、SOD試劑盒、BeyoColorTM彩色預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標準(10～170 kDa)、聚偏二氟乙烯膜、鼠抗腫瘤壞死因子(TNF-α)、兔抗白介素-1β(IL-1β)、極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix、HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper),南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MCO-20AIC型CO2細胞培養(yǎng)箱,日本三洋;BSC-1300IIA2型超凈工作臺,江蘇凈化設(shè)備有限公司;HH-W-600水浴鍋,金壇市江南儀器廠;S1000TM Thermal Cycler梯度PCR儀、ChemiDocTMImaging System凝膠成像系統(tǒng),美國BIO-RAD;TGL-25M高速冷凍離心機,美國ALPHA公司;Thermo Lifetech ABI QuantStudio3,美國Thermo;Synergy HTX多功能酶標儀,美國Berten;WH-861渦旋混合器,太倉華立達公司;碎花冰制冰機,松下冷鏈(大連)有限公司;電泳儀,北京六一生物科技有限公司;脫色搖床,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;LE104E/02電子天平,梅特勒-托力多儀器(上海)有限公司;PH-140A電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SH-SY5Y細胞的培養(yǎng)

在37 ℃下,SH-SY5Y細胞在5%(體積分數(shù))CO2的細胞培養(yǎng)箱中生長至對數(shù)期。培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM-F12培養(yǎng)基。另外,SH-SY5Y細胞具有中等水平的多巴胺β羥化酶活性,其起源于神經(jīng)母細胞瘤。在用于后續(xù)的實驗前應(yīng)用10 μmol/L全反式維甲酸(all-transretinoic acid,ATRA)誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞48 h,使其向神經(jīng)元分化,細胞形態(tài)及生理功能等隨之發(fā)生改變,與成熟的神經(jīng)細胞非常相似。

1.3.2 H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型的建立及奎寧酸處理

實驗分為空白對照組(Control)、過氧化氫組(H2O2)、奎寧酸組(H2O2+Quinic)。參考文獻[12]中方法,H2O2+Quinic組先用奎寧酸(50、100、200、300 μg/mL)誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞12 h 后,再用300 μmol/L的H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞15 h,建立氧化應(yīng)激模型。對照組不經(jīng)任何處理,H2O2組僅用300 μmol/L的H2O2處理。

1.3.3 細胞活力測定

通過3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)細胞增殖及細胞毒性測試評估奎寧酸對H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞活力的影響。將生長密度為90%的細胞先用Hanks洗滌,然后使用胰蛋白酶將其消化,并按數(shù)量為104個細胞/孔接種在細胞96孔板中,培養(yǎng)24 h使其完全貼壁。根據(jù)MTT說明書方法,MTT與SH-SY5Y細胞反應(yīng)后,通過酶標儀測定其在570 nm處的吸光度。最后結(jié)果為實驗組與對照組相比得出。

1.3.4 SH-SY5Y細胞內(nèi)抗氧化指標的測定

將培養(yǎng)至對數(shù)期的SH-SY5Y細胞轉(zhuǎn)移至6孔板中,用10 μmol/L全反式維甲酸處理48 h后,再更換新的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。按照1.3.2節(jié)的方法經(jīng)奎寧酸和H2O2處理后收集細胞,按照相應(yīng)的試劑盒說明書測定MDA、GSH含量和SOD活性。

1.3.5 RNA提取及實時熒光定量PCR分析

采用實時熒光定量PCR檢測不同組SH-SY5Y細胞抗氧化酶因子和炎癥因子的相對表達量。將培養(yǎng)好的SH-SY5Y細胞棄去培養(yǎng)基,加入適量的Hanks清洗兩遍,使用RNA提取試劑盒提取各SH-SY5Y細胞總RNA,依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進行后續(xù)的實時熒光定量PCR檢測。內(nèi)參基因為β-actin,抗氧化酶Sod1、Sod2、Cat、Gpx2以及炎癥因子IL-1β和TNF-α等基因的引物序列(5′-3′)見表1,ΔΔCt用于計算基因的相對表達量。

表1 實時定量PCR引物序列Table 1 Real time quantitative PCR primer sequence

1.3.6 蛋白印跡分析細胞炎癥因子表達

采用蛋白免疫印跡法檢測不同分組中SH-SY5Y細胞炎癥因子TNF-α和IL-1β的蛋白表達情況。H2O2造模結(jié)束后的SH-SY5Y細胞,使用RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白,用BCA試劑盒測定細胞蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性10 min。按照之前報道的方法進行Western blot檢測[13]。配制SDS-PAGE用于分離各樣品中等量的蛋白質(zhì)。濃縮電壓為80 V,分離電壓為120 V。200 mA×1.5 h轉(zhuǎn)膜后,使用50 g/L脫脂牛奶將聚偏二氟乙烯膜封閉2 h。封閉結(jié)束后,分別與β-actin、TNF-α和IL-1β抗體(稀釋倍數(shù)為1∶1 000)在4 ℃冰箱孵育過夜。孵育結(jié)束后TBST每10 min洗膜1次,3次過后,與對應(yīng)的二抗(稀釋倍數(shù)為1∶10 000)室溫孵育2 h,TBST緩沖液洗膜3次后使用極超敏ECL發(fā)光試劑盒對蛋白條帶呈像,并利用Image J軟件計算灰度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究采用3次重復(fù)實驗,使用GraphPadTMPrism 8.0版和SPSS Statistics 25等軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析和處理,最終結(jié)果以平均值±標準差表示,以P<0.05表示組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 奎寧酸可提高SH-SY5Y細胞在氧化應(yīng)激下的活力

H2O2是一種強氧化劑,低濃度的H2O2是一種信號分子可以調(diào)控細胞的生長,而一定量的H2O2可以使SH-SY5Y細胞的細胞膜脂質(zhì)過氧化,可導(dǎo)致細胞凋亡。在細胞實驗中,作為重要的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)物,H2O2對細胞模型中的氧化應(yīng)激機制的研究具有重要的意義[14]。因此,建立H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞以評估奎寧酸的保護作用。

如圖1所示,在300 μmol/L H2O2處理細胞15 h后,檢測細胞活力,發(fā)現(xiàn)H2O2組細胞活力顯著降低(P<0.01),說明H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞氧化應(yīng)激模型建立成功。而當利用不同濃度奎寧酸處理后細胞活力有顯著上升,其中經(jīng)過100 μg/mL奎寧酸處理的SH-SY5Y細胞的活力最強,但更高質(zhì)量濃度(200、300 μg/mL)的奎寧酸處理并沒有顯著的作用,說明100 μg/mL是奎寧酸的最適質(zhì)量濃度。該實驗結(jié)果表明,奎寧酸預(yù)處理可抑制氧化應(yīng)激引起的細胞活性下降,對SH-SY5Y細胞起到保護作用。

圖1 不同濃度奎寧酸對H2O2誘導(dǎo)下SH-SY5Y 細胞活力的影響Fig.1 Effect of different concentrations of quinic acid on the cell viability of SH-SY5Y under the inducation of H2O2

2.2 奎寧酸對H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞抗氧化功能的影響

抗氧化劑的抗氧化能力取決于分子結(jié)構(gòu),其苯環(huán)上的—OH位置和數(shù)量決定了清除自由基的能力,自由基可以從酚羥基得到氫原子或單個電子,使其失去氧化性,變成穩(wěn)定的自由基[15]。有研究證明奎寧酸衍生物具有發(fā)揮抗氧化活性的主要官能團及對各種自由基的清除能力[16]。除了抗氧化劑外,機體自身的抗氧化能力也是對抗氧化應(yīng)激損傷的重要防御系統(tǒng)。抗氧化酶活力的高低代表著清除體內(nèi)自由基的能力,其中抗氧化酶活力越高,抗氧化能力越強,能夠有效地清除體內(nèi)的自由基。另外,當體內(nèi)MDA含量開始降低時,則表明機體的抗氧化狀態(tài)得到了改善。

為了進一步研究奎寧酸對細胞抗氧化能力的影響,本研究測定了在100 μg/mL奎寧酸處理下,SH-SY5Y細胞中SOD、GSH和MDA的含量(圖2)。實驗結(jié)果顯示,H2O2抑制了細胞中SOD的活性,降低了GSH在細胞中的水平(圖2-a、圖2-b),并增加了MDA含量(圖2-c),表明H2O2使SH-SY5Y細胞的氧化應(yīng)激水平增加、抗氧化能力下降;而奎寧酸預(yù)處理顯著上調(diào)了SOD的活性和GSH的水平,并降低了MDA水平,說明奎寧酸預(yù)處理抑制了H2O2引起的SH-SY5Y細胞氧化應(yīng)激水平的升高并加強了細胞的抗氧化能力。

a-SOD;b-MDA;c-GSH

對于氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達水平的檢測也進一步證實了奎寧酸對神經(jīng)細胞抗氧化能力的調(diào)控作用(圖3)。Sod1、Sod2、Cat、Gpx2的相對表達量在H2O2處理后降低,而奎寧酸預(yù)處理恢復(fù)了Sod1、Sod2、Cat、Gpx2的表達水平。以上結(jié)果表明,奎寧酸可顯著提高神經(jīng)細胞面對氧化應(yīng)激的抗氧化能力,在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中發(fā)揮了重要的抗氧化作用。

圖3 細胞抗氧化相關(guān)基因表達水平的變化Fig.3 Changes in the expression levers of antioxidant-related genes in cells

2.3 奎寧酸對H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞中炎癥因子表達的影響

由于氧化應(yīng)激的增加會使氧反應(yīng)性物質(zhì)(oxygen reactive substance,ORS)和氮反應(yīng)性物質(zhì)(nitrogen reactive substance,NRS)水平升高,從而進一步刺激促炎因子和趨化因子在細胞中得到釋放,引起細胞炎癥水平升高,加重神經(jīng)損傷[17]。已有研究證明小米多酚的攝入具有抗炎作用[9],因此本研究利用實時熒光定量PCR進一步研究了奎寧酸對H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞中炎癥因子表達的調(diào)控作用。結(jié)果表明,H2O2誘導(dǎo)使SH-SY5Y細胞中促炎因子IL-1β和TNF-α的表達顯著升高,而奎寧酸處理則顯著抑制了促炎因子的表達(圖4)。

圖4 SH-SY5Y細胞炎癥因子表達水平的變化Fig.4 Change of the expression level of inflammatory factors in SH-SY5Y cells

對炎癥因子的蛋白水平免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比,經(jīng)H2O2處理后,炎癥因子TNF-α和IL-1β在蛋白水平上的表達量相比于Control組有顯著性提高(P<0.05),而經(jīng)過奎寧酸預(yù)處理后,均明顯降低(P<0.05)(圖5)。以上結(jié)果表明,奎寧酸可以通過抑制氧化應(yīng)激引起的炎癥對神經(jīng)細胞起到保護作用。

a-Western blot檢測TNF-α、IL-1β蛋白水平;b-IL-1β定量分析;c-TNF-α定量分析

3 結(jié)論與討論

多酚是膳食中重要的功能因子,具有優(yōu)異的抗氧化性能。關(guān)于小米多酚中重要活性物質(zhì)-奎寧酸及其衍生物的炎癥抑制作用已有報道。例如,?KESSON等[18]和AHN等[19]發(fā)現(xiàn)奎寧酸及其衍生物可以抑制NF-κB活化來抑制炎癥的發(fā)生。PERO等[20]研究表明奎寧酸可以通過胃腸道菌群轉(zhuǎn)化為色氨酸和煙酰胺,最終抑制NF-κB的活性,并使得DNA修復(fù)增強。1,5-二咖啡?？鼘幩峥梢酝ㄟ^抑制α-synuclein的過度表達來減輕PC12細胞的氧化應(yīng)激[21],部分奎寧酸代謝物可以抑制小膠質(zhì)細胞的活化從而起到神經(jīng)保護作用[22]。而目前缺乏奎寧酸對神經(jīng)細胞的保護作用的直接證據(jù),奎寧酸單體對神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激和炎癥的抑制作用仍需進一步研究。

本研究以小米多酚中的奎寧酸為研究對象,采用H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞,通過MTT細胞增殖及細胞毒性測試,發(fā)現(xiàn)在加入奎寧酸培養(yǎng)后,面對H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,SH-SY5Y細胞的活力與H2O2組相比顯著升高。對于奎寧酸的抗氧化功能的研究發(fā)現(xiàn),奎寧酸提高了SH-SY5Y細胞中抗氧化酶SOD的活性、GSH水平并降低MDA的含量,并且提高了抗氧化相關(guān)基因Sod1,Sod2,Cat和Gpx的表達水平,增強了SH-SY5Y細胞的抗氧化能力。同時,奎寧酸可通過抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的表達來抑制氧化應(yīng)激引起的炎癥水平升高,起到對SH-SY5Y細胞的神經(jīng)保護作用。

綜上,本研究的實驗結(jié)果表明了奎寧酸的抗氧化和神經(jīng)保護作用,為奎寧酸在預(yù)防和治療氧化應(yīng)激相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了理論基礎(chǔ)。