吳旭東，張青祥，王宗敏，劉代新，朱蘭蘭

（1. 山東理工大學(xué)，山東淄博 255000；2. 三奇生物醫(yī)藥（山東） 有限公司，山東日照 276800）

0 引言

大黃魚因為其金色外觀和味道鮮美廣受消費者喜愛，是中國最大的海水養(yǎng)殖魚類之一，2021 年總產(chǎn)量約254 224 t[1]。大黃魚營養(yǎng)豐富，含有豐富的多不飽和脂肪酸（PUFA）、蛋白質(zhì)、必需氨基酸和礦物元素[2]。然而，大黃魚經(jīng)捕撈到零售之間的一系列處理加工，都伴隨著細(xì)菌繁殖、酶活動和其他自降解的化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致新鮮度下降[3-4]。與其他高蛋白食品相比，魚類和魚類產(chǎn)品對腐敗和食源性病原體生長的易感性更普遍，因此需要通過大黃魚冷藏期間的新鮮度變化采取相應(yīng)的方法來保證大黃魚的新鮮度。

對于水產(chǎn)品整個生產(chǎn)流程——從源頭到成品的各個環(huán)節(jié)來說，新鮮度起著重要的作用?，F(xiàn)有的物理、化學(xué)和生物保鮮方法已經(jīng)在水產(chǎn)品保鮮上有了廣泛的應(yīng)用。近年來，物理保鮮方法因其對水產(chǎn)品本身影響較小的優(yōu)勢，已經(jīng)成為了水產(chǎn)品加工保鮮領(lǐng)域的研究熱點，如微凍保鮮技術(shù)、深度冷凍保藏技術(shù)、超高壓技術(shù)、等離子體活化水技術(shù)等[5-7]。但是，這些技術(shù)需要專門的設(shè)備支持，成本高且難以被大規(guī)模利用。因此，4 ℃冷藏保鮮仍然是一種最經(jīng)濟、安全且可有效延長水產(chǎn)品質(zhì)量期限的方法。

研究探討了4 ℃冷藏條件下大黃魚死后肌肉的品質(zhì)變化規(guī)律，了解其在冷藏條件下的新鮮度變化規(guī)律，確定冷藏條件下大黃魚保藏貨架期，為保存和加工新鮮大黃魚提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大小均勻的大黃魚（每條質(zhì)量約為1 kg），購自當(dāng)?shù)厮a(chǎn)市場。

氧化鎂、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、乙醇、2 -硫代巴比妥酸、1,1,3,3 -四乙氧基丙烷（分析純）、瓊脂（生物純），上海麥克林生化科技有限公司提供；Ca2+-ATP 酶活性檢測試劑盒，南京建成生物公司提供；總巰基含量檢測試劑盒，北京索萊寶生物科技有限公司提供；緩沖液A（10 mmol/L Tris-HCl，pH 值7.2）、緩沖液B（10 mmol/L TrisHCl，0.6 mol/L NaCl，pH 值7.2），北京酷來搏科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

METTLER TOLEDO型pH 計，美國梅特勒托利多科技有限公司產(chǎn)品；LDZX-50FBS 型蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療機械廠產(chǎn)品；SFJ-10 型勻漿機，上海力辰儀器科技有限公司產(chǎn)品；K9840 型自動凱氏定氮儀，山東海能儀表科技有限公司產(chǎn)品；UV-1900i 型分光光度計，日本島津國際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；冷凍離心機，艾本德公司產(chǎn)品；電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；D1524R 型高速冷凍微量離心機，北京大龍興創(chuàng)試驗儀器有限公司產(chǎn)品；DK-8D 型恒溫水浴鍋，河南鞏義予華儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 TVB-N 值測定

按照GB/T 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》中自動凱氏定氮儀法方法測定。

1.3.2 TBA 值測定

TBA 值參考Sun X 等人[8]的方法并稍作修改。TBA 值以mg 丙二醛（MDA） / kg 樣品表示。

1.3.3 TVC 測定

TVC 采用傾注法測定。測定總需氧計數(shù)的孵育溫度為（30±1） ℃，孵育時間為72 h，TVC 值表示為lg CFU/g。

1.3.4 Ca2+-ATP 酶活性測定

根據(jù)文獻報道的方法[9-10]，將20 g 絞碎的魚肉加入4 倍體積的緩沖液A 中，并使用均質(zhì)機以轉(zhuǎn)速13 000 r/min 均質(zhì)3 次，然后在4 ℃條件下以轉(zhuǎn)速1 500 r/min 離心20 min。丟棄上清液，用5 倍的緩沖液B 均勻沉淀，離心。上清液用4 層濾布過濾，得到肌原纖維蛋白（Myofibrillary protein，MF） 溶液。將該溶液保存在4 ℃的冰箱中，2 d 內(nèi)用完。

根據(jù)Qiu S 等人[11]的方法測定MF 的Ca2+-ATP 酶活性，使用超微ATP 酶（Ca2+） 檢測試劑盒檢測MF Ca2+-ATP 酶活性。

1.3.5 總巰基含量的測定

按照總巰基含量試劑盒微量法進行測定。

1.3.6 pH 值的測定

參照GB 5009.237—2016《食品中pH 值的測定》，稱取5.0 g 魚肉樣品，加入50 mL 蒸餾水，浸漬30 min 后過濾。所得上清液用pH 計測其pH 值。

1.3.7 電導(dǎo)率的測定

稱取10.0 g 魚背部肌肉樣品，加入100 mL 蒸餾水，浸漬30 min 后過濾。所得上清液用電導(dǎo)率儀測定其電導(dǎo)率。

1.3.8 持水性的測定

從魚的背部取白肉，3 g 攪碎的魚肉在冷凍離心機中以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心10 min，離心后稱取樣品的質(zhì)量，得到離心后釋放出的水分含量。

1.3.9 蒸煮損失的測定

從魚背處取魚肉，將魚肉切成20 mm×20 mm×15 mm 的立方體，將魚肉稱量后放入保鮮袋中密封，然后在85 ℃水浴鍋中加熱15 min，室溫下冷卻3 min，用吸水紙擦干后再次稱量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個指標(biāo)對魚樣本重復(fù)3 次。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 進行單因素方差分析置信水平設(shè)置在95%（p<0.05），使用GraphPad Prism 9.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 ℃冷藏條件下大黃魚TVB-N 值變化規(guī)律

TVB-N 值是指魚或魚制品中由于酶和腐敗微生物的活性而產(chǎn)生的氨和胺類堿性氮化合物，它通常用于評估蛋白質(zhì)和胺的分解程度[12-13]。TVB-N 值能準(zhǔn)確揭示水產(chǎn)品新鮮狀況，且已被中國和許多國家作為評價水產(chǎn)品腐敗程度的標(biāo)準(zhǔn)[14]。

4 ℃冷藏條件下TVB-N 值的變化規(guī)律見圖1。

圖1 4 ℃冷藏條件下TVB-N 值的變化規(guī)律

圖1 顯示了大黃魚樣品在4 ℃溫度下貯藏8 d 期間觀察到的TVB-N 值水平變化。隨著貯藏時間的延長，TVB-N 值從8.05 mg/100 g 顯著升高至37.68 mg/100 g（p<0.05）。根據(jù)中國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 2733—2015），大黃魚樣品中TVB-N 值的允許限量為30 mg/100 g。在4 ℃條件下保存8 d 后，TVB-N 值增加到37.68 mg/100 g，超過了魚樣品的可接受腐敗水平。這一發(fā)現(xiàn)與Li T等人[15]研究的冷凍大黃魚TVB-N 值的變化規(guī)律一致。在貯藏期間，由于自溶、微生物活動及游離氨基酸和核苷酸的降解，TVB-N 值趨于增加[16]。

2.2 4 ℃冷藏條件下大黃魚TBA 值的變化規(guī)律

4 ℃冷藏條件下TBA 值的變化規(guī)律見圖2。

圖2 4 ℃冷藏條件下TBA 值的變化規(guī)律

TBA 值常被用于衡量水產(chǎn)品中脂質(zhì)氧化的程度。隨著貯藏時間的延長，TBA 值顯著升高（p<0.05）。冷藏初期，TBA 值為0.11 mg MDA/kg，這一結(jié)果與Jia Z 等人[17]的研究報告一致，指出了冷凍鮭魚的初始TBA 值為0.098 mg MDA/kg。隨著貯藏時間的延長，不飽和脂肪酸發(fā)生氧化作用，從而使TBA 值在貯藏末期上升至1.21 mg MDA/kg。根據(jù)Indergárd E等人[18]研究表明，對魚類使用低溫貯藏技術(shù)可以有效抑制脂質(zhì)氧化和分解過程。

2.3 4 ℃冷藏條件下大黃魚TVC 變化規(guī)律

4 ℃冷藏條件下TVC 變化規(guī)律見圖3。

圖3 4 ℃冷藏條件下TVC 變化規(guī)律

TVC 反映了冷藏期間大黃魚菌落總數(shù)的變化。大黃魚樣品的TVC 隨著貯藏時間的延長而顯著增加（p<0.05）。冷藏大黃魚初始TVC 為4.97 lg CFU/g，低于5.00 lg CFU/g。鮮魚中菌落總數(shù)可接受限度為7.00 lg CFU/g。試驗中，冷藏大黃魚第8 天的TVC為7.49 lg CFU/g，超過了海魚的最大可接受水平[17]。

2.4 4 ℃冷藏條件下大黃魚Ca2+-ATP 酶活性變化規(guī)律

ATP 酶是生物膜上的一種蛋白酶，其可以通過分解ATP 產(chǎn)生ADP 并釋放無機磷。Ca2+-ATP 酶活性與肌球蛋白的頭部結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系，由此被廣泛用于表征肌球蛋白的完整性和蛋白質(zhì)變性程度[19]。

4 ℃冷藏條件下Ca2+-ATP 酶活性變化規(guī)律見圖4。

圖4 4 ℃冷藏條件下Ca2+-ATP 酶活性變化規(guī)律

由圖4 可知，隨著貯藏時間的延長，Ca2+-ATP酶活性明顯減弱（p<0.05）。初始Ca2+-ATP 酶活性為0.46 μmol/mg 蛋白質(zhì)/ min，8 d 后降至0.15 μmol/mg蛋白質(zhì)/ min，下降幅度為72.52%。由于巰基氧化形成的二硫鍵的分子聚合、肌動球蛋白的變性及肌肉細(xì)胞間冰晶的機械損傷等原因，都可能導(dǎo)致Ca2+-ATP 酶活力減弱[11]。說明Ca2+-ATP 酶活性也可反映大黃魚的新鮮度。

2.5 4 ℃冷藏條件下大黃魚總巰基含量變化規(guī)律

4 ℃冷藏條件下總巰基含量變化規(guī)律見圖5。

圖5 4 ℃冷藏條件下總巰基含量變化規(guī)律

除了Ca2+-ATP 酶活性可以表征蛋白質(zhì)氧化程度，總羰基含量損失也可用來衡量蛋白質(zhì)氧化水平。由圖5 可知，在4 ℃冷藏期間總巰基含量逐漸降低，這與Li B 等人[20]研究中變化規(guī)律一致，這是因為蛋白質(zhì)在貯藏過程中發(fā)生變性[21]。從總巰基含量的變化情況可看出，在4 ℃冷藏條件下蛋白質(zhì)的損傷情況。新鮮大黃魚的巰基含量在2.50 μmol/g，第4 天后下降速度加快，從2.15 μmol/g 下降至1.84 μmol/g。第4 天后活性巰基被氧化，導(dǎo)致隱藏巰基裸露更容易被氧化，在貯藏末期達(dá)到1.75 μmol/g。

2.6 4 ℃冷藏條件下大黃魚pH 值變化規(guī)律

4 ℃冷藏條件下pH 值變化規(guī)律見圖6。

圖6 4 ℃冷藏條件下pH 值變化規(guī)律

由圖6 可知，在4 ℃冷藏期間pH 值呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢，具有顯著性差異（p<0.05），新鮮魚肉的初始pH 值為6.61。第2 天時pH 值下降，這可能是因為大黃魚在死后糖原發(fā)生降解產(chǎn)生酸性物質(zhì)導(dǎo)致pH 值短暫下降[22]。第2 天后持續(xù)上升，第8 天時達(dá)到了7.71。這是因為在微生物和酶的作用下，蛋白質(zhì)產(chǎn)生了堿性含氮物質(zhì)，導(dǎo)致pH 值上升。雖然pH 值可作為衡量魚類新鮮度的判斷指標(biāo)，但因為不同魚種之間存在差異，仍需結(jié)合其他指標(biāo)來共同判斷大黃魚在冷藏期間的新鮮度變化。

2.7 4 ℃冷藏條件下大黃魚電導(dǎo)率變化規(guī)律

當(dāng)肌肉組織發(fā)生損傷時，肌肉細(xì)胞內(nèi)的礦物質(zhì)就會變成游離態(tài)，具有流動性，導(dǎo)致肌肉導(dǎo)電性增強，電導(dǎo)率上升。因此，可用電導(dǎo)率的變化來衡量魚體內(nèi)體液平衡及肉品品質(zhì)。

4 ℃冷藏條件下電導(dǎo)率變化規(guī)律見圖7。

圖7 4 ℃冷藏條件下電導(dǎo)率變化規(guī)律

由圖7 可知，第0 天電導(dǎo)率為936 μs/cm，與Yao L 等人[23]描述即殺鯽魚的電導(dǎo)率為891 μs/cm 大致相似。隨著貯藏天數(shù)的增加，大黃魚肌肉組織逐漸降解增加了細(xì)胞內(nèi)體液的流動性，增加了魚肉制品的導(dǎo)電性，使電導(dǎo)率升高，貯藏末期（8 d） 時電導(dǎo)率達(dá)到1 246 μs/cm。

2.8 4 ℃冷藏條件下大黃魚持水性和蒸煮損失變化規(guī)律

持水性（WHC） 又稱保水性，是在當(dāng)機體受到外力作用時，肌肉可保持原有水分和添加新水分的能力。持水力是一個重要的品質(zhì)指標(biāo)，因而消費者往往會更傾向于高持水性的魚肉制品。持水力越高的產(chǎn)品口感越多汁、鮮嫩；持水力越低的產(chǎn)品口感越干硬，這是因為肌肉表面就會有水分滲出，可溶性營養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)就會損失，從而導(dǎo)致肌肉品質(zhì)下降[24]。肉的保水性還直接影響肉的滋味、多汁性、營養(yǎng)成分、嫩度、色度等食用品質(zhì)。因此，蒸煮損失是衡量肌肉保水性的指標(biāo)之一，因此兩者可作為反映魚肉新鮮程度的因素。

4 ℃冷藏條件下WHC 和蒸煮損失變化規(guī)律見圖8。

圖8 4 ℃冷藏條件下WHC 和蒸煮損失變化規(guī)律

由圖8 可知，蒸煮損失隨貯藏時間延長而升高，持水性隨貯藏時間延長而降低，魚肉制品持水性在0 d 時達(dá)到最高值，為82.3%，隨后下降。Nguyen M V 等人[25]研究表明，持水性的下降可能是由于蛋白變性導(dǎo)致水分從肌肉纖維中流失。這說明冷藏過程持水性的變化可能與魚肉質(zhì)構(gòu)特性有一定的相關(guān)性。直到貯藏末期，魚肉制品的持水性降低至61.9%。魚肉制品蒸煮損失在0 d 時最低，為14.3%，在第8 天時最高，為24.8%。

3 結(jié)論

隨著冷藏時間的延長，大黃魚的品質(zhì)逐漸惡化，新鮮度下降。在此過程中，菌落總數(shù)、TBA、TVB-N和蒸煮損失上升，Ca2+-ATP 酶活性及WHC 下降，并出現(xiàn)腥臭異味。大黃魚在冷藏8 d 時，菌落總數(shù)超過7.0 lg CFU/g，超過海水魚中菌落總數(shù)的最低限值，TBA 值達(dá)到1.21 mg MDA/kg，TVB-N 含量為37.68 mg/100 g，超過合格品所規(guī)定的30.00 mg/100 g。此時魚肉品質(zhì)下降，蒸煮損失達(dá)24.8%，持水性降低至61.9%，Ca2+-ATP 酶活性下降至0.15 μmol/mg 蛋白質(zhì)/ min，總巰基含量下降至1.75 μmol/g。綜合各項指標(biāo)的結(jié)果，在4 ℃的貯藏環(huán)境下，大黃魚貯藏2 d 為宜，此時大黃魚處于新鮮狀態(tài)，品質(zhì)保持較好；貯藏4 d 后大黃魚腐敗速度加快，各項指標(biāo)較差，品質(zhì)迅速惡化。