孫敏 任虹 （連云港市第一人民醫(yī)院皮膚科，連云港 222000）

銀屑病是一種常見(jiàn)的慢性、易復(fù)發(fā)的皮膚炎癥性疾病，影響世界2%～3%人口，嚴(yán)重時(shí)可降低患者生活質(zhì)量［1］。銀屑病主要表現(xiàn)為角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生和分化、免疫細(xì)胞過(guò)度浸潤(rùn)、炎癥因子釋放等［2-3］。IL-22是免疫細(xì)胞產(chǎn)生的在皮膚中僅作用于角質(zhì)形成細(xì)胞的一種炎癥因子，在銀屑病患者患病組織和血清中表達(dá)增多，且與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)［4］。體外常用IL-22刺激角質(zhì)形成細(xì)胞模擬銀屑病模型［5-6］。miRNAs是由約22個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈非編碼RNAs，在包括銀屑病在內(nèi)的多種疾病中發(fā)揮重要作用［7-8］。miR-410-3p不僅可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，還可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞炎癥反應(yīng)［9-10］。如miR-410-3p可調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎小鼠軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥以及吸煙誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺疾病中支氣管上皮細(xì)胞增殖和凋亡［11-12］?？紤]到炎癥和角質(zhì)形成細(xì)胞增殖在銀屑病中的重要作用，以及miR-410-3p可參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞生長(zhǎng)，本研究推測(cè)miR-410-3p可能與銀屑病發(fā)生存在某種聯(lián)系。因此，本研究檢測(cè)miR-410-3p在銀屑病患者血清中的表達(dá)，并利用IL-22處理人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT建立體外銀屑病模型，探討miR-410-3p對(duì)IL-22誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及可能分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床樣本 收集2020年10月至2020年12月就診于連云港市第一人民醫(yī)院的12例尋常型銀屑病患者空腹靜脈血作為實(shí)驗(yàn)組，年齡23～59歲，男7例，女5例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①既往無(wú)心腦血管疾病和其他自身免疫性疾病等；②樣本采集前2個(gè)月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素類(lèi)、甲氨蝶呤、維A酸類(lèi)、環(huán)孢素類(lèi)等全身治療藥物以及依那西普等生物制劑；③采樣前至少1個(gè)月內(nèi)未接受紫外線照射治療；④不在妊娠期和哺乳期。另外收集連云港市第一人民醫(yī)院同期體檢的年齡、性別無(wú)差異的12例健康志愿者空腹靜脈血作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象均知情同意。本研究經(jīng)連云港市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（2020-005）。將收集的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血液樣本放入含肝素的抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，分離血清樣本。

1.1.2 主要試劑 人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；DMEM培養(yǎng)基和胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自南京貝博生物；Annexin VFITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Trizol試劑、RIPA裂解液、BCA試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；TaqMan microRNA assay試劑盒購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；Lipofecatmine 3000轉(zhuǎn)染試劑、M-MLV Reverse Transcriptase購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；SYBR?Green PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Yes相關(guān)蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）、GAPDH兔單克隆抗體以及HRP標(biāo)記的抗兔IgG抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；miR-410-3p及其對(duì)照序列（miR-NC）、PCR引物均由上海吉瑪公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 使用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)胰酶消化，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞分為4組：對(duì)照組、IL-22組、miR-NC組和miR-410-3p組。除對(duì)照組外，其余3組均用IL-22刺激，建立體外銀屑病模型，刺激濃度和時(shí)間參考文獻(xiàn)［13］：將完全培養(yǎng)基更換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基饑餓處理24 h，加入100 ng/ml IL-22刺激24 h。miR-NC組和miR-410-3p組加入IL-22刺激前48 h時(shí)根據(jù)Lipofectamine 3000試劑說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-410-3p。將HaCaT細(xì)胞分為3組：miR-410-3p組、miR-410-3p+pcDNA3.1組和miR-410-3p+YAP1組。miR-410-3p組處理方法同前，miR-410-3p+pcDNA3.1組和miR-410-3p+YAP1組轉(zhuǎn)染miR-410-3p同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒和構(gòu)建的pcDNA3.1-YAP1質(zhì)粒。

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè) CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力：將細(xì)胞接種于96孔板，2.5×103個(gè)/孔，按1.2.1分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。加入IL-22后24 h分別檢測(cè)細(xì)胞活力：各孔加入10 μl CCK-8試劑，37 ℃放置2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處吸光度。BrdU檢測(cè)細(xì)胞增殖：各組細(xì)胞接種至24孔板，每孔添加BrdU繼續(xù)孵育12 h，棄培養(yǎng)液，甲醇固定10 min，2 mol/L HCl變性5 min，加入3%BSA封閉1 h，加入BrdU一抗4 ℃孵育12 h，加入二抗室溫孵育1 h，DAPI染核，熒光顯微鏡拍照后計(jì)算BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將HaCaT細(xì)胞按5×105個(gè)/孔接種于6孔板，按1.2.1轉(zhuǎn)染miRNA和進(jìn)行IL-22刺激，IL-22刺激24 h后胰酶消化，收集細(xì)胞至離心管，1 000 g離心5 min，去除上清，PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ml。1 000 g離心5 min，去除上清，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加5 μl Annexin V-FITC與細(xì)胞混勻，再加入10 μl碘化丙啶（PI）染色液混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)miR-410-3p和YAP1 mRNA表達(dá) Trizol試劑提取患者血清和HaCaT細(xì)胞總RNA，參考試劑說(shuō)明書(shū)操作。用相應(yīng)試劑盒將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用PCR試劑盒進(jìn)行qRTPCR檢測(cè)miR-410-3p和YAP1 mRNA表達(dá)，結(jié)果用2-ΔΔCt分析，分別以U6和GAPDH為內(nèi)參。引物序列miR-410-3p F：5'-ACACTCCAGCTGGGAATATAACACAGATG-3'；R：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；YAP1 F：5'-TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA-3'；R：5'-TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT-3'；GAPDH F：5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'；R：5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'。

1.2.5 YAP1蛋白水平檢測(cè) 收集細(xì)胞，使用冰冷的含PMSF的RIPA裂解液裂解30 min。離心收集上清，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，各樣品取30 μg總蛋白，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入YAP1和GAPDH一抗4 ℃過(guò)夜孵育，洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，拍照，Image J軟件分析各條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算YAP1蛋白表達(dá)。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因分析miR-410-3p與YAP1的靶向關(guān)系 PCR擴(kuò)增含miR-410-3p結(jié)合序列的YAP1野生型和突變型3'端非編碼區(qū)序列，將這兩段序列分別插入pmirGLO載體，構(gòu)建YAP1野生型（YAP1-WT）與YAP1突變型（YAP1-MUT）質(zhì)粒。將HaCaT細(xì)胞接種于24孔板，過(guò)夜常規(guī)培養(yǎng)后轉(zhuǎn)染20 nmol/L miR-410-3p或miR-NC和50 ng構(gòu)建的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48 h，按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料用±s表示。采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析，使用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-410-3p在各組血清樣品中的表達(dá) qRTPCR檢測(cè)血清miR-410-3p表達(dá)（圖1）：健康對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組銀屑病患者血清miR-410-3p表達(dá)分別為1.00±0.16和0.44±0.11。與健康對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組銀屑病患者血清miR-410-3p表達(dá)降低（t=10.09，P＜0.05）。

圖1 健康志愿者和銀屑病患者血清miR-410-3p表達(dá)Fig.1 miR-410-3p expression in serum of healthy and psoriasis patients

2.2 各組細(xì)胞miR-410-3p表達(dá) 對(duì)照組、IL-22組、miR-NC組和miR-410-3p組中miR-410-3p表達(dá)分別為1.00±0.04、0.42±0.09、0.43±0.11、1.37±0.13。IL-22組miR-410-3p表達(dá)低于對(duì)照組，miR-410-3p組miR-410-3p表達(dá)高于IL-22組（均P＜0.05，圖2）。

圖2 各組細(xì)胞miR-410-3p表達(dá)Fig.2 miR-410-3p expression in cells of different groups

2.3 過(guò)表達(dá)miR-410-3p抑制IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖 CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞活力，對(duì)照組、IL-22組、miR-NC組和miR-410-3p組細(xì)胞450 nm處吸光度分別為0.61±0.06、0.90±0.07、0.92±0.08和0.69±0.06。IL-22組細(xì)胞活力較對(duì)照組增強(qiáng)，miR-410-3p組細(xì)胞活力較IL-22組減弱（均P＜0.05，圖3A）。對(duì)照組、IL-22組、miR-NC組和miR-410-3p組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞占比分別為（22.67±2.52）%、（74.67±7.09）%、（72.00±6.01）%、（33.65±4.16）%。IL-22組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞多于對(duì)照組，miR-410-3p組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞少于IL-22組（均P＜0.05，圖3B、C）。

圖3 過(guò)表達(dá)miR-410-3p抑制IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖Fig.3Overexpression of miR-410-3p inhibits proliferation of HaCaT cells induced by IL-22

2.4 過(guò)表達(dá)miR-410-3p促進(jìn)HaCaT細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡（圖4）：對(duì)照組、IL-22組、miR-NC組和miR-410-3p組細(xì)胞凋亡率分別為（26.11±2.09）%、（7.79±1.30）%、（8.12±0.90）%和（22.91±1.58）%。IL-22組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組降低，miR-410-3p組細(xì)胞凋亡率較IL-22組升高（均P＜0.05）。

圖4 過(guò)表達(dá)miR-410-3p促進(jìn)HaCaT細(xì)胞凋亡Fig.4 Overexpression of miR-410-3p increases apoptosis of HaCaT cells

2.5 IL-22刺激的HaCaT細(xì)胞中miR-410-3p可靶向調(diào)節(jié)YAP1表達(dá) Starbase生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-410-3p有多個(gè)潛在靶基因，YAP1是這些基因中的一個(gè)，結(jié)合序列見(jiàn)圖5A。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，YAP1-WT細(xì)胞中，miR-410-3p組熒光素酶活性低于miR-NC組（0.46±0.08vs1.00±0.06；t=10.07，P＜0.05）；但轉(zhuǎn)染YAP1-MUT的細(xì)胞中miR-410-3p組和miR-NC組熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.01±0.08vs0.98±0.12；t=0.31，P=0.77，圖5B）。對(duì)照組、IL-22組、miR-NC組和miR-410-3p組YAP1 mRNA表達(dá)分別為1.00±0.06、3.39±0.21、3.31±0.28和1.51±0.12（圖5C）。對(duì)照組、IL-22組、miR-NC組和miR-410-3p組YAP1蛋白水平分別為0.09±0.03、0.62±0.05、0.59±0.08和0.21±0.04（圖5D）。IL-22組YAP1 mRNA和蛋白水平均比對(duì)照組升高，miR-410-3p組YAP1 mRNA和蛋白水平均較IL-22組降低（均P＜0.05，圖5C、D）。

圖5 IL-22刺激的HaCaT細(xì)胞中miR-410-3p可靶向調(diào)節(jié)YAP1表達(dá)Fig.5 miR-410-3p targets YAP1 and regulates its expression in IL-22 stimulated HaCaT cells

2.6 過(guò)表達(dá)YAP1可逆轉(zhuǎn)miR-410-3p對(duì)IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖和凋亡的影響 miR-410-3p組、miR-410-3p+pcDNA3.1組和miR-410-3p+YAP1組細(xì)胞450 nm處吸光度分別為0.68±0.05、0.67±0.06和0.89±0.04；凋亡率分別為（22.91±1.58）%、（23.07±2.06）%和（12.31±2.22）%。與miR-410-3p組相比，miR-410-3p+YAP1組中細(xì)胞活力增強(qiáng)，凋亡率降低（均P＜0.05）；而miR-410-3p+pcDNA3.1組細(xì)胞活力和凋亡率與miR-410-3p組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，圖6）。

圖6 過(guò)表達(dá)YAP1可逆轉(zhuǎn)miR-410-3p對(duì)IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.6 Overexpression of YAP1 reverses influences of miR-410-3p on proliferation and apoptosis of HaCaT cells induced by IL-22

3 討論

越來(lái)越多的研究證實(shí)miRNAs表達(dá)異常與銀屑病發(fā)生密切相關(guān)。如miR-210在銀屑病患者和小鼠模型中均高表達(dá)，可通過(guò)誘導(dǎo)Th1和Th17細(xì)胞分化促進(jìn)銀屑病相關(guān)炎癥反應(yīng)［7］。WANG等［8］研究發(fā)現(xiàn)銀屑病小鼠皮膚組織中miR-383表達(dá)下調(diào)，銀屑病小鼠模型中過(guò)表達(dá)miR-383可通過(guò)靶向LCN2緩解銀屑病相關(guān)癥狀，抑制炎癥反應(yīng)和JAK3/STAT3通路活化，阻止角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。銀屑病患者皮膚組織和IL-22刺激的HaCaT細(xì)胞模型中miR-617表達(dá)上調(diào)。IL-22誘導(dǎo)的細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-617顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡［5］。miR-221-3p在銀屑病患者血清中表達(dá)顯著增加，血清中miR-221-3p表達(dá)與患者TNF-α、IL-17和IL-22表達(dá)呈正相關(guān)。HaCaT細(xì)胞模型中下調(diào)miR-221-3p可抑制細(xì)胞增殖和炎癥因子釋放。miR-410-3p在慢性阻塞性肺疾病患者血清中表達(dá)降低，且與細(xì)胞增殖和炎癥均相關(guān)［9-10，12］。因此，本課題探索了miR-410-3p在銀屑病患者血清中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在患者血清中含量顯著低于健康志愿者，表明miR-410-3p可能與銀屑病發(fā)生存在一定聯(lián)系。

IL-22在銀屑病中不僅可調(diào)控炎癥反應(yīng)，還可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，抑制其凋亡［14］。本研究也證實(shí)IL-22可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡。IL-22刺激的HaCaT細(xì)胞模型中也發(fā)現(xiàn)miR-410-3p表達(dá)下調(diào)，與其在銀屑病患者血清中的表達(dá)趨勢(shì)一致。本研究在細(xì)胞模型中進(jìn)一步探究了miR-410-3p對(duì)IL-22刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-410-3p顯著抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步證實(shí)miR-410-3p在銀屑病發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

研究顯示miRNAs通過(guò)靶向調(diào)控mRNA發(fā)揮生物學(xué)作用［8，15］。本研究進(jìn)一步探究了miR-410-3p的作用機(jī)制。YAP1是Hippo通路的關(guān)鍵分子，可調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡、組織生長(zhǎng)發(fā)育、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、胞內(nèi)接觸抑制和干細(xì)胞自我更新等多種生物學(xué)作用。由于這些作用，YAP1在多種腫瘤中是一個(gè)常見(jiàn)的促癌基因。近年研究發(fā)現(xiàn)YAP1在銀屑病患者皮膚和銀屑病小鼠模型中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)YAP可抑制HaCaT細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡［16］；且藥物可通過(guò)抑制YAP1表達(dá)在銀屑病小鼠和細(xì)胞模型中抑制表皮角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖［17］。本研究發(fā)現(xiàn)IL-22誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞中YAP1表達(dá)上調(diào)。Starbase生物信息學(xué)分析miR-410-3p的靶基因時(shí)發(fā)現(xiàn)YAP1是其潛在的靶基因。因此本研究進(jìn)一步檢測(cè)了miR-410-3p與YAP1的聯(lián)系，構(gòu)建YAP1野生型和突變型熒光質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)miR-410-3p可抑制轉(zhuǎn)染YAP1野生型質(zhì)粒的HaCaT細(xì)胞熒光素酶活性，但對(duì)轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒的熒光素酶活性幾乎無(wú)影響，且過(guò)表達(dá)miR-410-3p顯著抑制YAP1表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)YAP1是miR-410-3p的靶基因。此外，IL-22誘導(dǎo)的銀屑病細(xì)胞模型中，過(guò)表達(dá)YAP1可逆轉(zhuǎn)miR-410-3p對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖和凋亡的影響。miR-410-3p可能還存在其他靶基因，如Smad7等。JIA等［18］研究表明miR-410-3p可靶向Smad7。而Smad7可促進(jìn)銀屑病中角質(zhì)形成細(xì)胞增殖［19］。因此，miR-410-3p在銀屑病中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)miR-410-3p在銀屑病患者血清中表達(dá)降低，HaCaT細(xì)胞IL-22可抑制miR-410-3p表達(dá)，miR-410-3p可通過(guò)靶向YAP1抑制IL-22誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，促進(jìn)IL-22抑制的細(xì)胞凋亡，揭示了銀屑病發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制，為銀屑病治療提供了新靶點(diǎn)。