李靜靜 王雪琦 孫婭順 趙思琪 劉春龍 鐘成 （.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；.天津市侵襲性真菌病精準(zhǔn)診斷技術(shù)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300467）

近年來(lái)，侵襲性真菌病的發(fā)病致死率不斷升高，調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，其中80%的感染由侵襲性念珠菌病引起［1］。此外，血源性感染是醫(yī)院中最易發(fā)生的感染狀況，其中念珠菌是主要致病菌，血源性感染引起的致死率在使用抗真菌相關(guān)的治療手段后仍高居40%［2］。念珠菌是典型的條件致病菌，在人體腸道、口腔、陰道黏膜等常與其他微生物共存，當(dāng)機(jī)體免疫力降低或外界環(huán)境對(duì)其進(jìn)行給藥活動(dòng)時(shí)可能發(fā)展為致病菌，在情況嚴(yán)重時(shí)，念珠菌病會(huì)侵染到機(jī)體各組織及器官，最終導(dǎo)致生命受到威脅，在已發(fā)現(xiàn)的念珠菌種類中有超過(guò)15種會(huì)引發(fā)機(jī)體感染，而大多數(shù)念珠菌感染均由白色念珠菌、光滑念珠菌及熱帶念珠菌引起［3］。侵襲性念珠菌病的易感因素包括念珠菌定植、接受廣譜抗菌藥治療、使用中央靜脈導(dǎo)管、住院時(shí)間延長(zhǎng)、入住ICU、燒傷、早產(chǎn)、中性粒細(xì)胞減少、全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、HIV感染及糖尿病等［4］。目前，關(guān)于念珠菌抗原與抗體檢測(cè)的相關(guān)研究逐漸增多，歐洲臨床微生物與感染性疾病學(xué)會(huì)于2012年提出：β-D葡聚糖（Beta-D-glycan，BDG）與甘露聚糖均可作為念珠菌病臨床相關(guān)的輔助診斷標(biāo)志物［5］。BDG主要存在于大部分致病真菌細(xì)胞壁中，在檢測(cè)念珠菌時(shí)的特異度和靈敏度均為75%左右，但在念珠菌病的早期診斷中假陽(yáng)性檢出率仍較高［6-7］；甘露聚糖則存在于常見(jiàn)念珠菌屬的細(xì)胞壁外側(cè)，當(dāng)人體受念珠菌侵染后，甘露聚糖具備的強(qiáng)抗原性激發(fā)人體免疫系統(tǒng)識(shí)別甘露聚糖產(chǎn)生抗甘露聚糖抗體，抗甘露聚糖抗體應(yīng)用于念珠菌病的檢測(cè)時(shí)其特異度可達(dá)到90%以上［8-9］。因此，建立一種高效的方法檢測(cè)念珠菌甘露聚糖抗體對(duì)診斷念珠菌病在臨床上具有重要意義。

目前，侵襲性念珠菌病的檢測(cè)方法主要有真菌培養(yǎng)、組織病理學(xué)檢查、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、PCR技術(shù)、G試驗(yàn)以及影像學(xué)檢查，但微生物培養(yǎng)技術(shù)仍舊存在培養(yǎng)周期較長(zhǎng)、靈敏度低等缺陷；PCR技術(shù)雖然能特異性檢測(cè)出樣本中的真菌核酸成分并有效區(qū)分所感染菌屬種類，但該技術(shù)由于儀器昂貴、檢驗(yàn)過(guò)程缺乏標(biāo)準(zhǔn)化及敏感性過(guò)高易產(chǎn)生假陽(yáng)性等缺點(diǎn)而在臨床早期診斷方面受限；ELISA檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的技術(shù)要求較高，并且檢測(cè)耗費(fèi)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（通常＞2 h）；G試驗(yàn)檢測(cè)僅能判定是否為真菌感染，對(duì)念珠菌特定甘露聚糖抗體的敏感特異度較低；影像學(xué)檢查費(fèi)用昂貴，并不能作為對(duì)念珠菌病的早期快速診斷技術(shù)而普及［10-12］。近年來(lái)，化學(xué)發(fā)光技術(shù)不斷發(fā)展，在體外診斷領(lǐng)域中由于其檢測(cè)靈敏度高、線性范圍寬、光信號(hào)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、實(shí)驗(yàn)誤差小以及安全性能高等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用［13-14］。相較傳統(tǒng)檢測(cè)手段而言，化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)能夠在短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)樣本中特定物質(zhì)的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)較簡(jiǎn)單，不需要對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，有效避免了檢測(cè)過(guò)程中人為引起的誤差［15］。

基于以上背景，本研究建立了一種快速檢測(cè)血清樣本中念珠菌甘露聚糖IgG抗體的條式化學(xué)發(fā)光技術(shù)。相對(duì)于裸磁珠體系，鏈霉親和素-磁微粒能夠與生物素-念珠菌甘露聚糖相結(jié)合并放大發(fā)光信號(hào)值；此外，該檢測(cè)體系聯(lián)合使用間接法與“兩步兩清洗”檢測(cè)有效避免了免疫檢測(cè)時(shí)易發(fā)生的鉤狀效應(yīng)（HOOK效應(yīng)）。建立該檢測(cè)體系后對(duì)相關(guān)性能指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，為臨床上侵襲性念珠菌病的早期診斷提供一種更加快速高效的輔助檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究所用念珠菌甘露聚糖抗原、羊抗人IgG抗體、念珠菌IgG抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）、樣本稀釋液、發(fā)光底物及試劑條等均由丹娜（天津）生物科技股份有限公司提供；鏈霉親和素-磁微粒、N-羥基丁二酰亞胺（N-Hydroxy succinimide， NHS）活化生物素和堿性磷酸酶購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；血紅蛋白、膽紅素、三酰甘油及其他鹽類試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。本研究所用樣本收集于四川大學(xué)華西醫(yī)院。本研究經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院臨床試驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，［2021年臨床試驗(yàn)（器械）審（41）號(hào)］，采集時(shí)間為2022年，對(duì)采集樣本進(jìn)行編號(hào)后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（成都宜樂(lè)芯生物科技有限公司，lumilite8）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（TECAN迪肯酶標(biāo)儀，Infinite M200）。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法的建立 生物素標(biāo)記念珠菌甘露聚糖抗原：使用0.02 mol/L pH=7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）將念珠菌甘露聚糖抗原稀釋至1 mg/ml，以摩爾比1∶40加入相應(yīng)的NHS活化生物素，振蕩混勻后避光置于室溫反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后用0.02 mol/L pH=7.4 PBS透析純化反應(yīng)產(chǎn)物，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗人IgG抗體：將堿性磷酸酶以10 mg/ml濃度溶于0.1 mol/L pH=6.8的PBS中，加入戊二醛使得終濃度為1.25%，室溫過(guò)夜反應(yīng)后透析以除去過(guò)量戊二醛；將羊抗人IgG抗體以10 mg/ml濃度溶于0.5 mol/L pH=9.5的碳酸鹽緩沖液（CBS）中，將活化的酶溶液以（每4 mg酶加入1 mg抗體比例）加入上述抗體溶液，4 ℃過(guò)夜反應(yīng)；采用0.2 mol/L賴氨酸- CBS溶液（0.5 mol/L pH=9.5）加入反應(yīng)體系，4 ℃反應(yīng)1 h終止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用0.02 mol/L pH=7.4 PBS透析純化后加入50%甘油，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用標(biāo)記完成的生物素-念珠菌甘露聚糖抗原（bCA）與鏈霉親和素-磁微?；旌戏磻?yīng)，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG抗體（AP-IgG）后檢測(cè)不同陰陽(yáng)性樣本以驗(yàn)證生物素與念珠菌甘露聚糖是否成功標(biāo)記，進(jìn)而確定本研究方法最適的bCA與AP-IgG反應(yīng)濃度［選取bCA不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml）與AP-IgG不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml）進(jìn)行正交試驗(yàn)］，最終建立一種檢測(cè)血清樣本中念珠菌甘露聚糖IgG抗體的方法。

1.2.2 分析靈敏度 依據(jù)參考指南Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures；Approved Guideline-Second Edition（EP17-A02）對(duì)檢測(cè)體系的分析靈敏度進(jìn)行評(píng)估驗(yàn)證。

空白限（limit of blank， LoB）評(píng)估方法：選取5例空白樣本，同時(shí)使用2臺(tái)全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀持續(xù)測(cè)試3 d，其中每個(gè)空白樣本每天均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)試完成后評(píng)估檢測(cè)方法的LoB。檢出限（limit of detection，LoD）評(píng)估方法：確定LoB，選取5例低濃度樣本（1～1.5 LoB），同時(shí)使用2臺(tái)全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，持續(xù)測(cè)試3 d，每天每個(gè)樣本均需進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)試完成后評(píng)估檢測(cè)方法的LoD。

1.2.3 精密度與重復(fù)性 使用雙因子嵌套方差分析方法對(duì)本研究方法重復(fù)性及精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。選取5個(gè)不同濃度樣本以及2個(gè)質(zhì)控品持續(xù)測(cè)試10 d，使用2批次試劑每天對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行6次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)，最終使用標(biāo)準(zhǔn)差SD值與變異系數(shù)%CV值表示精密度及重復(fù)性。

1.2.4 分析特異性 隨機(jī)選取高、中、低濃度曲霉IgG抗體（GM-IgG）、結(jié)核分枝桿菌IgG抗體（TBIgG）、肺炎支原體IgG抗體（MP-IgG）以及肺炎衣原體IgG抗體（CP-IgG）陽(yáng)性樣本數(shù)例，使用本研究所建立方法進(jìn)行檢測(cè)判定體系是否存在交叉反應(yīng)。

選取高、低濃度陽(yáng)性樣本與陰性樣本，分別加入不同劑量血紅蛋白、三酰甘油和膽紅素進(jìn)行測(cè)試，將加入不同干擾因子后的測(cè)試濃度與加入前濃度進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算相對(duì)偏差（RD）對(duì)本研究建立體系的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.5 方法學(xué)對(duì)比 使用念珠菌IgG抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）與本研究建立方法分別對(duì)150例臨床樣本進(jìn)行檢驗(yàn)分析，參照CLSI EP12-A2指南推薦方法、回歸分析與偏差分析對(duì)兩種方法以及一致性程度的95%置信區(qū)間進(jìn)行評(píng)價(jià)；并計(jì)算Kappa值以描述兩種方法一致性強(qiáng)度（一致性強(qiáng)度分區(qū)為極強(qiáng)：0.81＜Kappa值＜1.00，較強(qiáng)：0.41＜Kappa值＜0.80，弱：0.21＜Kappa值＜0.40，較弱：0＜Kappa值＜0.20，極弱：0＜Kappa值［16-17］）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究數(shù)據(jù)處理均使用Med-Calc、Minitab 18和Excel 2019軟件進(jìn)行分析。檢測(cè)方法所使用標(biāo)準(zhǔn)曲線由最小二乘法進(jìn)行線性擬合得到。樣本濃度均使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀中四參數(shù)Logisitic擬合曲線進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)體系建立 使不同濃度的bCA與AP-IgG進(jìn)行正交試驗(yàn)，并記錄陰陽(yáng)性樣本信號(hào)值比值（P/N值）如圖1所示，生物素與念珠菌甘露聚糖成功標(biāo)記產(chǎn)生有效光信號(hào)值，在圖1中表明不同濃度bCA與AP-IgG反應(yīng)時(shí)P/N值會(huì)隨之變化；經(jīng)驗(yàn)證確定bCA與AP-IgG濃度均為1 μg/ml時(shí)，樣本P/N值呈現(xiàn)較高峰值（P/N=25.06）。在最優(yōu)條件下，使用濃度為10、25、50、100、250、500 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品建立該檢測(cè)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，念珠菌甘露聚糖IgG抗體檢測(cè)體系線性回歸方程為y=1.74×107-1.74×107/［1+（x/199 71.03）］，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.998 7，符合臨床應(yīng)用技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 不同濃度bCA與AP-IgG對(duì)樣本P/N值的影響Fig.1 Effect of different concentrations of bCA and APIgG on P/N values of samples

圖2 檢測(cè)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for testing system

因此，本研究方法所使用生物素與多糖類標(biāo)記方法可行，基于化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)檢測(cè)樣本中念珠菌甘露聚糖IgG抗體的方法初步建立。

2.2 靈敏度分析 根據(jù)EP17-A2指南所述方法計(jì)算并驗(yàn)證檢測(cè)體系LoB與LoD，確定本研究建立體系LoB為5.20 AU/ml，LoD為5.50 AU/ml。

2.3 精密度與重復(fù)性 使用雙因子嵌套方差分析方法，評(píng)價(jià)本研究建立體系精密度與重復(fù)性，結(jié)果如表1所示，以SD值與CV值表示的重復(fù)性評(píng)價(jià)中，CV值均＜10%，證明在外界因素盡可能相同的情況下，使用本研究所建立體系檢測(cè)同一樣本時(shí)具有較高一致性。另一方面，室內(nèi)精密度與批間精密度評(píng)估結(jié)果CV值同樣均＜10%，表明所建立體系在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行時(shí)不同批次間存在的變異性較小。因此，關(guān)于精密度與重復(fù)性的分析結(jié)果表明本研究方法能夠滿足臨床相關(guān)輔助診斷技術(shù)的要求；同時(shí)，該分析方法也可以應(yīng)用于相關(guān)檢測(cè)儀器的故障排除工作中，從而進(jìn)一步提高相關(guān)輔助診斷技術(shù)的臨床準(zhǔn)確性。

表1 精密度與重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Precision and repeatability test results

2.4 分析特異性

2.4.1 交叉反應(yīng) 對(duì)臨床診斷過(guò)程中易發(fā)生交叉反應(yīng)的特異性病原體樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果證明（圖3）使用本研究建立體系所測(cè)含有不同特異性抗體陽(yáng)性樣本濃度值基本與念珠菌IgG抗體陰性（CAIgG）樣本檢測(cè)結(jié)果一致。因此，常見(jiàn)特異性抗體對(duì)本研究方法不存在交叉影響。

圖3 本研究體系檢測(cè)可能存在交叉反應(yīng)特異性抗體結(jié)果Fig.3 Testing system detects possible cross-reactive specific antibody results

2.4.2 干擾因素 臨床診斷時(shí)樣本會(huì)出現(xiàn)病理性溶血或技術(shù)性溶血，進(jìn)而導(dǎo)致樣本檢測(cè)結(jié)果受到干擾，見(jiàn)表2。當(dāng)血紅蛋白濃度＜0.5 mg/ml時(shí)會(huì)出現(xiàn)肉眼不可見(jiàn)的非顯性溶血現(xiàn)象；當(dāng)濃度＞5 mg/ml時(shí)則會(huì)出現(xiàn)重度溶血現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同濃度樣本中添加血紅蛋白含量高達(dá)7 mg/ml時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果仍無(wú)顯著干擾。正常人血清樣本中三酰甘油最高可達(dá)1.7 mmol/L，本研究結(jié)果證明，在不同濃度樣本中添加三酰甘油含量高達(dá)7.5 mmol/L時(shí)，檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)偏差均＜10%。因此，樣本中添加三酰甘油對(duì)本研究所建立體系的檢測(cè)結(jié)果并無(wú)干擾。臨床檢驗(yàn)時(shí)血清樣本中總膽紅素正常含量范圍為2.98～10.00 mg/L，重度黃疸患者總膽紅素含量范圍為200～300 mg/L。檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)各濃度樣本中膽紅素含量達(dá)到300 mg/L時(shí)，檢測(cè)結(jié)果RD仍低于10%。因此，樣本中膽紅素含量＜300 mg/L時(shí)對(duì)本研究體系檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。

表2 添加不同含量常見(jiàn)干擾物質(zhì)后對(duì)本研究方法檢測(cè)結(jié)果的影響Tab.2 Effects of adding different contents of common interfering substances on detection results of this research method

2.5 方法學(xué)對(duì)比 參照指南分別使用ELISA法與本研究方法對(duì)臨床來(lái)源樣本進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行回歸分析與偏差分析。兩種方法的回歸分析表明二者相關(guān)程度較高（R2=0.989 8，圖4），初步證明兩種檢測(cè)體系一致性較好。此外，如圖5，在檢測(cè)結(jié)果偏差分析中設(shè)定95%置信區(qū)間為檢測(cè)上下限，結(jié)果表明96%的本研究方法與ELISA法在一致性范圍內(nèi)，即兩方法的最大差異性在臨床檢測(cè)可允許發(fā)生范圍內(nèi)。

圖4 兩種方法學(xué)回歸分析（n=150）Fig.4 Two methods of regression analysis （n=150）

圖5 檢測(cè)結(jié)果偏差分析Fig.5 Deviation analysis of detection results

使用2×2列聯(lián)表與Kappa值對(duì)兩種方法檢測(cè)的一致性強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估，檢測(cè)結(jié)果如表3所示，兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性符合率為87.5%，陰性符合率為90.8%，總體符合率為90%；根據(jù)Kappa值公式計(jì)算出兩方法的Kappa值為0.80，即二者具有較強(qiáng)的一致性強(qiáng)度。綜上所述，本研究建立檢測(cè)體系與現(xiàn)有檢測(cè)方法具有較好一致性，可以將本研究方法應(yīng)用于念珠菌病的臨床輔助診斷。

表3 本研究方法與ELISA法檢測(cè)150例臨床樣本結(jié)果Tab.3 This method and ELISA were used to detect results of 150 clinical samples

3 討論

目前，關(guān)于念珠菌病的檢測(cè)試劑盒主流市場(chǎng)多為ELISA法與PCR檢測(cè)方法，其中ELISA法的應(yīng)用雖具有較高認(rèn)可度，但在檢測(cè)過(guò)程中也存在不可避免的劣勢(shì)：①檢測(cè)過(guò)程中對(duì)操作人員技術(shù)要求較高，易出現(xiàn)人為因素引起的誤差；②檢測(cè)時(shí)平行性與時(shí)效性較差。而PCR檢測(cè)手段則存在技術(shù)要求高且試驗(yàn)儀器較昂貴等弊端。因此，較于現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)，本研究建立一種基于化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的念珠菌甘露聚糖IgG抗體檢測(cè)方法，其具備靈敏度高、信號(hào)值持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、分析方法便捷、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定且誤差小以及安全性高等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光平臺(tái)多使用裸磁珠體系與大型全自動(dòng)發(fā)光設(shè)備，但因其設(shè)備較大、管路清洗復(fù)雜導(dǎo)致檢測(cè)重復(fù)性差等缺陷在使用上存在限制性。

綜合考慮上述問(wèn)題，本研究選用小型化學(xué)發(fā)光平臺(tái)與獨(dú)立條式樣品架以解決設(shè)備占用面積大、管路清洗復(fù)雜而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果等問(wèn)題；在此基礎(chǔ)上選用鏈霉親和素-磁微粒為載體，生物素標(biāo)記抗原與其多位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)一步增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)值。對(duì)本研究所建立檢測(cè)方法進(jìn)行系列性能評(píng)估，經(jīng)分析評(píng)價(jià)確定檢測(cè)方法LoB為5.20 AU/ml，LoD為5.50 AU/ml，較現(xiàn)有ELISA檢測(cè)技術(shù)（分析靈敏度為17.50 AU/ml）有所提高；精密度與重復(fù)性方面，CV值均＜10%表明檢測(cè)方法可行性的同時(shí)實(shí)驗(yàn)誤差較??；對(duì)于所建立檢測(cè)方法的分析特異度方面，常見(jiàn)干擾物質(zhì)與易發(fā)生交叉反應(yīng)的特異性抗體對(duì)其均無(wú)顯著性影響。此外，對(duì)確診臨床樣本使用本研究所建立方法進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，使用所建立檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)陰、陽(yáng)性樣本符合率均＞85%；在方法學(xué)一致性分析方面，本研究體系與ELISA法具有較強(qiáng)的一致性強(qiáng)度，且本研究方法與ELISA法的檢測(cè)差值符合95%置信區(qū)間浮動(dòng)的要求，回歸分析中二者相關(guān)系數(shù)R2=0.989 8＞0.975 0也證明兩種方法具有較高一致性，均滿足臨床檢測(cè)需求。

因此，根據(jù)相關(guān)性能評(píng)價(jià)與分析，以鏈霉親和素-磁微粒為載體，與生物素標(biāo)記念珠菌甘露聚糖相結(jié)合，在堿性磷酸酶偶聯(lián)羊抗人IgG抗體作為發(fā)光標(biāo)志物與發(fā)光底物進(jìn)行檢測(cè)的方法成功建立。同時(shí)，該檢測(cè)方法相關(guān)性能指標(biāo)均符合臨床診斷技術(shù)的要求，與現(xiàn)有產(chǎn)品一致性強(qiáng)度較高，為未來(lái)念珠菌病的臨床診斷提供了一種更加高效且便捷的檢測(cè)技術(shù)。