南蕾 玄紅運 米焱 王彩麗 （包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，包頭 014010）

特發(fā)性模型腎?。╥diopathic membranous nephropathy，IMN）是原發(fā)性腎病綜合征中較常見的類型，發(fā)病率逐年升高，大量蛋白尿和低蛋白血癥是其主要臨床表現(xiàn)，易發(fā)生靜脈栓塞、感染等并發(fā)癥，激素和免疫抑制劑治療效果較差，且多數(shù)患者會進展為終末期腎衰竭。近年研究發(fā)現(xiàn)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat protein 3，NLRP3）在腎臟炎癥反應過程中具有重要作用，其表達及分布異常是導致蛋白尿和炎癥反應的重要機制。本研究選取不同時期未經(jīng)腎上腺皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療的原發(fā)性IMN患者作為研究對象，觀察IMN患者腎臟組織Caspase-1、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）、NLRP3及NF-κB、p-ERK1/2、p-p38、p-JNK等因子表達，探討NLRP3炎癥小體在IMN發(fā)病中的作用及其激活機制。

1 資料與方法

1.1 資料 收集2012年1月至2017年1月就診于包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科行腎穿刺活組織檢查術(shù)診斷為IMN的患者135例，其中Ⅰ期IMN患者66例，Ⅱ期IMN患者38例，Ⅰ～Ⅱ期IMN患者26例，Ⅱ～Ⅲ期IMN患者5例，符合IMN診斷標準［1］。所有患者排除糖尿病、狼瘡腎炎、過敏性紫癜腎炎、骨髓瘤腎病、腎淀粉樣變性、腫瘤相關(guān)腎病、乙肝腎炎等，且所有患者腎穿刺前均未進行腎上腺皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療。選取同期入住包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科10例因腎結(jié)核及腎腫瘤行腎切除患者的腎臟組織作為正常對照組，選取的完整腎臟組織為腎腫瘤切除后病變周邊組織。本研究經(jīng)包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（20210005），患者知情同意。收集患者臨床數(shù)據(jù)，包括性別、年齡、尿素氮（urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、肌酐清除率（creatinine clearance rate，Ccr）、24 h尿蛋白定量等，腎組織蠟塊存放于包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院。

1.2 方法

1.2.1 病理學檢查 本研究所有腎臟組織均進行了光鏡和電鏡檢查。穿刺的腎臟組織病理檢測由北京大學第一醫(yī)院腎內(nèi)科病理實驗室和電鏡實驗室完成。

1.2.2 免疫組化 固定對照組和病例組腎臟組織并進行石蠟包埋，日本羽毛R-35一次性刀片進行切片，烤片，脫蠟和抗原修復后經(jīng)3%過氧化氫室溫孵育15 min，PBS沖洗阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清室溫封閉30 min；加TRAF6、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、p-NF-κB、p-p38、p-ERK1/2、p-JNK一抗4 ℃過夜；加HRP標記的山羊抗兔/小鼠二抗37 ℃孵育20 min，顯色，蘇木素復染細胞核，脫水透明，封片。所有切片在顯微鏡下觀察或采集圖像，Imagine-pro-plus 6.0圖像分析軟件測定TRPC6、TRAF6、NLRP3免疫組化圖片光密度，每張切片選取3張圖片進行光密度分析，分別測定面積、積分光密度（IOD）、平均光密度，平均光密度=積分光密度/面積，總平均光密度=3張平均光密度之和/3，黃色或棕黃色為陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進行分析。所有計量資料均符合正態(tài)分布和方差齊性，以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用成組t檢驗，Pearson用于相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般臨床資料分析 各期IMN患者24 h尿蛋白較對照組顯著升高（P＜0.001），Ⅰ期、Ⅰ～Ⅱ期及Ⅱ期IMN患者血肌酐水平明顯高于對照組（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001）。IMN組患者和對照組年齡、性別、尿肌酐及尿素氮差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05，表1）。

表1 IMN患者一般臨床資料（±s）Tab.1 General clinical data of patients with IMN （±s）

表1 IMN患者一般臨床資料（±s）Tab.1 General clinical data of patients with IMN （±s）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.01， 2）P＜0.001.

IMN Ⅱ～Ⅲ5 3/2 46.00±18.00 4.31±3.542）72.80±23.06 65.72±47.55 5.96±1.57 Clinical parameters Number Gender（Male/Female）Age 24 h-urine protein/g Scr/（μmol·L-1）Ccr/（ml·min-1）BUN/（mmol·L-1）Control 10 6/4 37.00±6.70 0.03±0.04 60.50±8.00 95.30±10.02 4.53±1.72 IMN Ⅰ66 44/22 50.00±13.00 3.86±1.972）78.73±24.801）98.26±38.74 5.55±2.05 IMN Ⅰ～Ⅱ26 16/10 49.00±13.00 4.19±2.032）80.08±16.632）90.58±24.24 5.17±1.37 IMN Ⅱ38 24/14 51.00±14.00 4.70±1.722）82.74±18.912）94.21±30.52 5.18±1.68

2.2 腎臟組織病理形態(tài)

2.2.1 腎組織光鏡 Ⅰ期IMN患者光鏡下可見腎小球系膜細胞和基質(zhì)輕度節(jié)段增生，基底膜空泡變性，輕度增厚，上皮下嗜復紅蛋白沉積，腎小管上皮顆粒變性，小灶狀萎縮，腎間質(zhì)小灶狀纖維化，小動脈管壁增厚（圖1A、a）；Ⅰ～Ⅱ期IMN患者光鏡下可見腎小球系膜細胞和基質(zhì)輕度節(jié)段增生，基底膜輕度增厚，上皮下嗜復紅蛋白沉積，節(jié)段性釘突形成；腎小管上皮顆粒變性，灶狀萎縮，腎間質(zhì)灶狀淋巴和單核細胞浸潤伴纖維化，小動脈管壁增厚（圖1B、b）；Ⅱ期IMN患者光鏡下可見腎小球系膜細胞和基質(zhì)輕度增生，基底膜彌漫增厚，上皮下嗜復紅蛋白沉積，釘突形成，腎小管上皮空泡及顆粒變性，灶狀萎縮，腎間質(zhì)灶狀淋巴和單核細胞浸潤伴纖維化，小動脈管壁增厚（圖1C、c）；Ⅱ～Ⅲ期IMN患者光鏡下可見腎小球系膜細胞和基質(zhì)輕至中度增生，基底膜彌漫增厚，上皮下嗜復紅蛋白沉積，基底膜呈環(huán)狀改變，腎小管上皮空泡及顆粒變性，灶狀萎縮，腎間質(zhì)灶狀淋巴和單核細胞浸潤伴纖維化，小動脈無明顯病變（圖1D、d）。

圖1 各期IMN患者腎臟組織病理形態(tài)Fig.1 Histopathological manifestations of kidney in patients with IMN in various stages

2.2.2 患者腎組織電鏡 Ⅰ期IMN患者電鏡下可見上皮下多數(shù)塊狀電子致密物沉積，上皮細胞足突廣泛融合（圖2A、a）；Ⅰ～Ⅱ期IMN患者腎小球基底膜增厚伴釘突樣增生，上皮下多數(shù)塊狀電子致密物沉積，上皮足突廣泛融合（圖2B、b）；Ⅱ期IMN腎小球基底膜大部分增厚伴釘突樣增生，上皮下多數(shù)塊狀電子致密物沉積上皮足突廣泛融合（圖2C、c）；Ⅱ～Ⅲ期IMN患者腎小球基底膜彌漫增厚伴釘突樣增生，部分包裹電子致密物，上皮下、基底膜內(nèi)多數(shù)塊狀電子致密物沉積，上皮足突廣泛融合（圖2D、d）。

圖2 各期IMN患者腎臟組織電鏡下病理形態(tài)（×10 000）Fig.2 Pathological morphological manifestations of renal tissue in patients with various stages of IMN under electron microscope （×10 000）

2.3 腎臟組織TRAF6/NLRP3/Caspase-1蛋白表達 NLRP3在對照組腎組織腎小球上皮細胞少量表達或不表達，在腎小管上皮細胞表達，在腎間質(zhì)細胞少量表達或不表達，在IMN患者腎小球上皮細胞、基底膜、內(nèi)皮細胞、腎間質(zhì)細胞表達，在腎小管上皮細胞明顯表達。與對照組比較，Ⅰ期、Ⅰ～Ⅱ期、Ⅱ期、Ⅱ～Ⅲ期IMN患者腎臟NLRP3表達明顯增強（P＜0.01）。Caspase-1在對照組腎組織腎小球上皮細胞、內(nèi)皮細胞、腎小管上皮細胞、腎間質(zhì)細胞表達或少量表達，在IMN患者腎小球上皮細胞、基底膜、內(nèi)皮細胞、腎間質(zhì)細胞表達，在腎小管上皮細胞明顯表達。與對照組比較，Ⅰ期、Ⅰ～Ⅱ期、Ⅱ期、Ⅱ～Ⅲ期IMN患者腎臟Caspase-1表達明顯增強（P＜0.01，圖3）。

圖3 各期IMN患者腎臟組織TRAF6/NLRP3/Caspase-1蛋白分布（×400）Fig.3 Distribution of TRAF6/NLRP3/Caspase-1 proteins in kidney tissues of IMN in different stages （×400）

2.4 腎臟組織炎癥因子IL-1β和TNF-α蛋白表達IL-1β在正常腎組織腎小球上皮細胞、腎小管上皮細胞表達或少量表達，在IMN患者腎小球上皮細胞、基底膜、內(nèi)皮細胞及腎間質(zhì)細胞表達或少量表達，在腎小管上皮細胞明顯表達。TNF-α在正常腎組織腎小球內(nèi)皮細胞、系膜細胞少量表達或不表達，在IMN患者腎小球上皮細胞、基底膜、內(nèi)皮細胞、系膜細胞及腎間質(zhì)細胞表達或少量表達，在腎小管上皮細胞明顯表達（圖4）。與正常腎組織比較，Ⅰ期、Ⅰ～Ⅱ期、Ⅱ期、Ⅱ～Ⅲ期IMN患者腎臟IL-1β表達明顯增強（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.000 1，P＜0.01），TNF-α表達明顯增強（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05，表2）。

表2 各期IMN腎臟組織中炎癥因子IL-1β和TNF-α表達（±s，n=12，U/L）Tab.2 IL-1β and TNF-α expressions in renal tissues of patients with IMN in various stages （±s，n=12，U/L）

表2 各期IMN腎臟組織中炎癥因子IL-1β和TNF-α表達（±s，n=12，U/L）Tab.2 IL-1β and TNF-α expressions in renal tissues of patients with IMN in various stages （±s，n=12，U/L）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01， 3）P＜0.001， 4）P＜0.000 1.

TNF-α 0.018 9±0.000 5 0.046 8±0.007 32）0.025 3±0.000 93）0.131 4±0.025 82）0.010 2±0.004 91）Groups Control IMNⅠIMNⅠ～ⅡIMNⅡIMNⅡ～ⅢIL-1β 0.010 2±0.004 9 0.032 4±0.001 72）0.032 2±0.000 92）0.165 0±0.014 64）0.034 7±0.006 22）

圖4 各期IMN患者腎臟組織IL-1β和TNF-α表達（×400）Fig.4 Expressions of IL-1β and TNF-α in renal tissue of patients with IMN （×400）

2.5 IMN腎臟組織TRAF6與NF-κB/p-ERK1/2/p-p38/p-JNK信號通路激活 TRAF6在對照組腎組織腎小球上皮細胞、基底膜、內(nèi)皮細胞、腎小管上皮細胞表達或少量表達，在IMN患者腎小球上皮細胞、基底膜、內(nèi)皮細胞、腎小管上皮細胞明顯表達。與對照組比較，Ⅰ期、Ⅰ～Ⅱ期、Ⅱ期、Ⅱ～Ⅲ期IMN患者腎臟TRAF6表達明顯增強（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01）。NF-κB p65在對照組腎臟組織腎小球上皮細胞、腎小管上皮細胞少量表達，IMN患者腎小球上皮細胞少量表達，腎小管上皮細胞明顯表達。Ⅰ期、Ⅰ～Ⅱ期、Ⅱ期及Ⅱ～Ⅲ期IMN腎臟組織NF-κB p65蛋白表達均高于對照組（均P＜0.001）；Ⅰ和Ⅱ期IMN患者腎臟組織NF-κB p65蛋白表達顯著高于Ⅰ～Ⅱ期和Ⅱ～Ⅲ期（均P＜0.001）。對照組受試者腎小球上皮細胞、腎小管上皮細胞少量表達或不表達p-p38，IMN患者腎小球上皮細胞少量表達或不表達，腎小管上皮細胞明顯表達p-p38。Ⅰ期、Ⅰ～Ⅱ期、Ⅱ期IMN患者腎臟組織p-p38蛋白表達均明顯高于正常組（均P＜0.001）；Ⅰ期和Ⅱ期IMN患者腎臟組織p-p38蛋白表達均高于Ⅰ～Ⅱ期（均P＜0.001）。p-ERK1/2蛋白在對照組腎小球上皮細胞、腎小管上皮細胞少量表達或不表達，IMN患者腎小球上皮細胞少量表達或不表達，腎小管上皮細胞明顯表達。Ⅰ期、Ⅰ～Ⅱ期、Ⅱ期及Ⅱ～Ⅲ期IMN患者均高表達p-ERK1/2（均P＜0.001）。Ⅰ期和Ⅰ～Ⅱ期IMN患者腎組織p-ERK1/2表達均低于Ⅱ期和Ⅱ～Ⅲ期（均P＜0.001，圖5D）。p-JNK在對照組受試者腎小球上皮細胞、腎小管上皮細胞少量表達或不表達，IMN患者腎小球上皮細胞少量表達或不表達，腎小管上皮細胞明顯表達，Ⅰ期、Ⅰ～Ⅱ期、Ⅱ期IMN患者腎臟組織均高表達p-JNK，且均高于Ⅱ～Ⅲ期表達（均P＜0.001，圖5）。

2.6 IMN患者24 h尿蛋白量與腎臟NLRP3、TRAF6、Caspase-1、IL-1β、TNF-α相關(guān)性分析 IMN患者24 h尿蛋白與腎臟組織NLRP3蛋白表達呈正相關(guān)（r=0.689，P＜0.01），與Caspase-1蛋白呈正相關(guān)（r=0.614，P＜0.000 1）；與IL-1β呈正相關(guān)（r=0.708，P＜0.000 1），與TNF-α呈正相關(guān)（r=0.594，P＜0.01）。TRAF6與NLRP3呈正相關(guān)（r=0.490，P＜0.01，圖6）。

圖6 NLRP3、Caspase-1、TRAF6、IL-1β、TNF-α與24 h尿蛋白和TRAF6與NLRP3相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between NLRP3， Caspase-1，TRAF6， IL-1β， TNF-α and 24-hour urine protein，TRAF6 and NLRP3

3 討論

IMN是成人腎病綜合征常見病理類型之一，約占成人腎病綜合征的1/3。IMN一般起病隱匿，很少有前驅(qū)感染，大部分患者有腎病綜合征臨床表現(xiàn)，少數(shù)患者僅有單純性蛋白尿，或伴有高血壓和血尿等癥狀［2］。近年膜性腎病發(fā)病機制研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應發(fā)揮重要作用。炎癥反應無論是在原發(fā)性腎小球疾病還是在糖尿病腎病、尿酸引起的腎病等繼發(fā)性腎病的發(fā)病機制中具有重要作用，越來越多的研究將原發(fā)性腎小球疾病研究聚焦于NLRP3炎癥小體，NLRP3炎癥小體既可感受各種感染性刺激，也可感受非感染性刺激，同時對外源性微生物及其內(nèi)源性危險信號分子產(chǎn)生應答。

本研究觀察135例IMN患者腎臟組織炎癥小體表達及其可能的激活通路發(fā)現(xiàn)，NLRP3和Caspase-1在IMN患者腎臟組織中高表達，同時伴有炎癥因子TNF-α和IL-1β高表達，TRAF6、NF-κB p65、MAPK信號通路相關(guān)蛋白p-ERK1/2、p-p38及p-JNK活化。此外，NLRP3、Caspase-1、TNF-α和IL-1β均與24 h尿蛋白呈正相關(guān)，NLRP3與TRAF6呈正相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)炎癥小體在腎臟疾病發(fā)生過程中具有關(guān)鍵作用，NLRP3炎癥小體最具代表性。NLRP3炎癥小體是炎癥的重要分子介質(zhì)。近年NLRP3炎癥小體在腎臟疾病中的激活備受關(guān)注［3-5］。NLRP3炎癥小體是炎癥的中心分子介質(zhì)，通過激活Caspase-1促進炎癥細胞因子IL-1β和IL-18等分泌，導致氧化應激和慢性炎癥。REN等［6］研究發(fā)現(xiàn)抑制NLRP3炎癥小體活化可改善早期肥胖相關(guān)腎小球病腎損傷。WEN等［7］發(fā)現(xiàn)連續(xù)注射血管緊張素的WT小鼠腎臟中腎小管上皮細胞及其線粒體均明顯受損，同時伴有大量蛋白尿。LIU等［8］發(fā)現(xiàn)膜性腎病大鼠腎臟NLRP3炎癥小體被激活，同時產(chǎn)生炎癥因子引起足細胞損傷。本研究觀察了IMN患者腎臟組織NLRP3炎癥小體分布情況，證實NLRP3蛋白在IMN患者腎小球上皮細胞、基底膜、內(nèi)皮細胞、腎間質(zhì)細胞中表達，腎小管上皮細胞表達最為明顯，尤其是在Ⅱ期IMN患者腎臟中NLRP3表達最多。同時，Caspase-1蛋白在IMN患者腎組織中廣泛分布，在各期IMN中的表達趨勢與NLRP3一致，與HUTTON等［3］研究NLRP3炎癥小體在腎臟病中的作用機制結(jié)論一致。本研究提示NLRP3炎癥小體激活可能與IMN腎小管損傷緊密相關(guān)。

NLRP3炎癥小體激活包括兩步。第一步，NF-κB激活誘導pro-IL-1β、pro-IL-18和NLRP3合成和積累［9］。第二步，NLRP3炎癥小體激活劑，如細菌、細胞外ATP、尿酸結(jié)晶均刺激NLRP3表達，導致IL-1β和IL-18成熟和分泌，誘導全身炎癥并進一步激活NFκB通路［10］。因此，NF-κB被認為是NLRP3炎癥小體的上游激活劑［11］。研究表明NF-κB和NLRP3炎癥小體參與急性和慢性腎臟疾病炎癥反應［12-13］。此外，2型糖尿病大鼠中發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB通路同時抑制NLRP3炎癥小體激活［14］。目前對IMN中NF-κB與NLRP3間的分子調(diào)控機制研究甚少。本研究中，NF-κB通路在IMN患者腎臟組織中被激活，尤其是Ⅰ期IMN患者腎臟組織NF-κB p65高表達，IMN患者腎臟組織NLRP3、Caspase-1和構(gòu)成NLRP3炎癥小體的IL-1β表達增加，表明NF-κB通路和NLRP3炎癥小體激活可能參與IMN發(fā)展。

TRAF6作為一種銜接分子參與多種信號通路傳導，大量證據(jù)表明TRAF6可介導NF-κB及JNK等信號通路激活［15］。XING等［16］在野生型和TRAF6-/-小鼠中發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠NLRP3表達明顯升高，而TRAF6-/-小鼠中NLRP3表達明顯降低，且TRAF6通過TLR和IL-1R誘導NLRP3激活。GUO等［17］研究顯示TRAF6與糖尿病腎病發(fā)生有一定關(guān)系，糖尿病腎病發(fā)生過程中存在NF-κB激活，同時NF-κB激活與TLR-MyD88信號通路相關(guān)?？梢奣RAF6是NFκB激活的重要蛋白分子，同時與NLRP3炎癥小體活化有關(guān)，可能與腎臟病發(fā)生有關(guān)。本研究顯示，IMN患者腎臟組織高表達TRAF6，且TRAF6與NLRP3相關(guān)，NLRP3表達增加同時與TRAF6增加有關(guān)，且炎癥因子IL-1β和TNF-α蛋白表達增加，提示IMN中NLRP3炎癥小體激活及炎癥因子產(chǎn)生由TRAF6介導。同時，IMN各期患者高表達NF-κB p65蛋白，MAPK信號通路激活，即p-ERK1/2、p-p38和p-JNK蛋白顯著表達，提示TRAF6通過激活NFκB-MAPK信號通路誘導NLRP3炎癥小體活化，從而參與IMN發(fā)展。丁麗紅［18］報道在人體系膜增生性腎小球腎炎中，免疫組化檢測到TLR2/TLR4、NF-κB、NLRP3明顯增加，下游因子pro-IL-1β、pro-IL-18、TNF-α表達增強，且高蛋白尿組上述因子表達更強，表明腎臟炎癥發(fā)生可能通過TLR2-MyD88-NF-κB信號通路誘導NLRP3激活，從而導致TNF-α釋放和IL-1β、IL-18成熟，為本研究認為TRAF6激活NLRP3炎癥小體參與腎臟疾病進展的觀點提供了支持。目前IMN發(fā)生過程中未見TRAF6與NLRP3活化相關(guān)報道。而本研究在IMN患者中發(fā)現(xiàn)TRAF6通過激活MAPK信號通路活化NLRP3炎癥小體，誘發(fā)蛋白尿，參與IMN進展，為IMN治療提供了新思路。

炎癥小體激活與尿蛋白有關(guān)，DING等［19］在白蛋白負荷大鼠模型中檢測到NLRP3表達顯著增加，觀察到腎小管出現(xiàn)萎縮、擴張和空泡形成，腎小球系膜細胞擴張，腎間質(zhì)伴有炎癥細胞浸潤，降低尿蛋白后上述改變明顯減輕，同時蛋白尿與IL-1β顯著相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)IMN患者24 h尿蛋白與NLRP3、Caspase-1、IL-1β及TNF-α呈正相關(guān)。此外，免疫組化結(jié)果表明NLRP3炎癥小體及下游因子主要在腎小管中表達增多，同時IMN患者24 h尿蛋白、血肌酐明顯增加，說明NLRP3炎癥小體可能參與IMN發(fā)展，其激活可能誘導尿蛋白產(chǎn)生和加重。IMN中NLRP3炎癥小體激活是否僅由尿蛋白刺激導致尚未闡明，需進一步研究。

綜上，本研究表明NF-κB-MAPK通路和NLRP3炎癥小體參與IMN發(fā)病機制，主要通過NF-κBMAPK通路和NLRP3炎癥小體激活引起腎小管損傷。