哈宗蘭 馬麗娜 馬瓊 甘桂芬

（1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，西寧 810000；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院放射科，西寧 810000）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）為胰酶異?；罨鸬囊认贀p傷及“炎癥瀑布效應(yīng)”，可累及肺、腎、腸等多器官引起功能損傷，導(dǎo)致患者死亡，其中肺是最易受AP影響的器官，AP中肺損傷發(fā)生率高達(dá)70%，是導(dǎo)致AP死亡的重要原因［1-2］。近年研究發(fā)現(xiàn)溶酶體缺陷引起的自噬效率降低，是AP“炎癥瀑布效應(yīng)”產(chǎn)生及肺損傷的根本因素，提高自噬效率，也可抑制IL-1β成熟及分泌，達(dá)到治療肺部炎癥損傷的目的［3-4］。

5'-單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）及自噬相關(guān)蛋白5（ATG5）是與炎癥-自噬相關(guān)的重要調(diào)節(jié)因子。AMPK活化可通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)總開(kāi)關(guān)，如核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）活化參與炎癥反應(yīng)［5］；另一方面可直接或間接促進(jìn)ATG5活化形成自噬泛素類復(fù)合物啟動(dòng)自噬［6］。自噬前期泛素化重要調(diào)節(jié)因子ATG5可影響炎癥性疾病，如哮喘、膿毒癥、動(dòng)脈粥樣硬化等炎癥性疾病預(yù)測(cè)、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后等過(guò)程，成為研究熱點(diǎn)和焦點(diǎn)［7］。AMPK/ATG5通路在AP后肺組織損傷過(guò)程中的調(diào)控作用未見(jiàn)報(bào)道。

茜草科植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa）具有清熱解毒、消腫止痛作用，為治療AP的中藥常用組方之一［8］?，F(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草的有效成分，如萜類、黃酮類、蒽醌類、甾醇類、有機(jī)酸類、多糖類及烷烴類等有廣泛的抗菌、抗炎及抗腫瘤作用，臨床可用于呼吸道感染、扁桃體炎、肺炎、膽囊炎、闌尾炎等疾病治療［9］。已有研究發(fā)現(xiàn)，含有白花蛇舌草的中藥組方可通過(guò)抑制自噬發(fā)揮抗癌作用［10］。但白花蛇舌草提取物是否也能通過(guò)調(diào)控自噬改善AP肺組織炎癥損傷還未見(jiàn)報(bào)道。本研究建立大鼠AP肺損傷模型，從炎癥-自噬相關(guān)通路AMPK/ATG5對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證，以期尋找緩解AP肺損傷的特異性藥物，為白花蛇舌草的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)SD大鼠90只，體質(zhì)量210～220 g，雌雄不限，購(gòu)自中山大學(xué)（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心東校區(qū)），生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2021-0029。本研究經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（IACUC-202101-07-013），符合3R原則。白花蛇舌草提取物（貨號(hào)：S27202，上海源葉生物科技有限公司，規(guī)格：100 g，純度：95%）；5%?；悄懰徕c（貨號(hào)：S16690，上海吉至生化科技有限公司）；AMPK激活劑（AICAR）（貨號(hào)：M00042-KDZ，北京百奧萊博科技有限公司）；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）（貨號(hào)：M9281，上海北諾生物科技有限公司）；淀粉酶（AMY）、IL-1β、IL-6、IL-18 ELISA試劑盒（貨號(hào)：CR102284、CR102864、CR102851、CR102866，無(wú)錫云萃生物科技有限公司）；AMPK、p-AMPK、ATG5、溶酶體相關(guān)膜蛋白2（LAMP2）、自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/Ⅰ、自噬底物p62、泛素特異性蛋白酶10（UPS10）、pro-IL-1β、胰蛋白酶原活化肽（TAP）抗體、HRP羊抗兔二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組 SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、提取物組、3-MA組、AICAR組、提取物+AICAR組，每組15只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均參照文獻(xiàn)［11］麻醉、暴露胰腺、穿刺膽胰管、按1 ml/kg勻速（0.2 ml/min）輸入5%?；悄懰徕c復(fù)制AP模型。假手術(shù)組僅暴露膽胰管，不穿刺注藥。大鼠均于清醒后開(kāi)始給藥。提取物組腹腔注射白花蛇舌草提取物溶液1 ml/kg（濃度1 g/ml），1次/d［12］；3-MA組手術(shù)造模前2 d腹腔注射3-MA溶液（100 mmol/L，2 μl/只）1次，手術(shù)造模后再給藥1次［13］；AICAR組造模前1 d腹腔注射AICAR（500 mg/kg），造模后再給藥1次［14］；提取物+AICAR組腹腔注射白花蛇舌草提取物同時(shí)腹腔注射AICAR；假手術(shù)組及模型組腹腔注射10 ml/kg生理鹽水。各組連續(xù)給藥14 d后觀察大鼠癥狀，并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 血清AMY、IL-1β、IL-6、IL-18水平檢測(cè) 末次給藥結(jié)束后12 h取成活大鼠，麻醉后取腹主動(dòng)脈血，ELISA檢測(cè)血清AMY及IL-1β、IL-6、IL-18水平。

1.2.3 腹水量及肺濕/干重比（W/D）檢測(cè) 各組隨機(jī)取6只大鼠，抽取腹水，量筒測(cè)量體積；處死大鼠，取左右兩肺及胰腺組織，左肺及胰腺組織于4%多聚甲醛固定24 h后制成石蠟切片（5 μm）備用；右肺組織精密稱重后作為濕重（W），60 ℃烘干至恒重后精密稱取重量作為干重（D），計(jì)算W/D。

1.2.4 HE染色觀察胰腺及肺組織病理?yè)p傷 取肺及胰腺組織石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察拍照，隨機(jī)取5個(gè)視野，采用Schmidt及Holfbauer評(píng)分法對(duì)胰腺及肺病理?yè)p傷進(jìn)行評(píng)分，均以0～4分為評(píng)分等級(jí)，0分為無(wú)病變，4分為整個(gè)視野內(nèi)出現(xiàn)病變［11］。

1.2.5 透射電鏡觀察胰腺及肺自噬狀況 各組剩余大鼠處死后，取新鮮胰腺及肺組織，剪取1 cm×1 cm組織塊，電鏡處理并觀察自噬小體及自噬泡形成狀況。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取新鮮胰腺及肺組織，分別剪碎、研磨、勻漿，提取蛋白，BCA法測(cè)定濃度，取60 μg行電泳及電轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，4 ℃下滴加1∶900稀釋的一抗（AMPK、p-AMPK、ATG5、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、UPS10、pro-IL-1β、LAMP2、TAP）、1∶1 300稀釋的內(nèi)參抗體β-actin孵育24 h，室溫滴加HRP羊抗兔二抗（1∶1 500）孵育40 min，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影曝光，Quantity One軟件檢測(cè)條帶相對(duì)灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，±s表示數(shù)據(jù)，獨(dú)立樣本分析行t檢驗(yàn)，組間比較行單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草提取物對(duì)大鼠一般行為變化的影響 假手術(shù)組大鼠無(wú)死亡，進(jìn)食及活動(dòng)正常。模型組有1只大鼠因肺部及胰臟糜爛壞死而死亡，成活大鼠攝食及飲水減少，毛發(fā)松亂，呼吸急促，大便少。提取物組及3-MA組大鼠攝食及飲水有所增多，呼吸逐漸平緩。AICAR組有2只大鼠死亡，解剖發(fā)現(xiàn)肺及胰腺粘連及壞死嚴(yán)重，攝食、飲水及呼吸狀況較模型組嚴(yán)重。提取物+AICAR組無(wú)死亡，攝食及飲水較模型組相近。

2.2 白花蛇舌草提取物對(duì)大鼠血清AMY、IL-1β、IL-6、IL-18水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清AMY、IL-1β、IL-6、IL-18水平升高（P＜0.05）。與模型組相比，提取物組、3-MA組大鼠血清AMY、IL-1β、IL-6、IL-18水平降低（P＜0.05），且提取物組改善效果優(yōu)于3-MA組（P＜0.05）。AICAR組大鼠血清AMY、IL-1β、IL-6、IL-18水平較模型組進(jìn)一步升高（P＜0.05）。提取物+AICAR組血清AMY、IL-1β、IL-6、IL-18水平高于提取物組（P＜0.05，表1）。

表1 大鼠血清AMY、IL-1β、IL-6、IL-18水平比較（±s）Tab.1 Comparison of serum AMY， IL-1β， IL-6 and IL-18 levels in rats （±s）

表1 大鼠血清AMY、IL-1β、IL-6、IL-18水平比較（±s）Tab.1 Comparison of serum AMY， IL-1β， IL-6 and IL-18 levels in rats （±s）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with extract group， 3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Extract 3-MA AICAR Extract+AICAR n IL-6/（pg·ml-1）IL-18/（pg·ml-1）12.15±1.20 128.90±8.801）33.29±3.212）54.00±6.012）3）198.82±10.722）3）98.97±9.802）3）15 14 15 15 13 15 AMY/（U·L-1）1 201.18±120.00 6 659.78±220.111）2 007.05±135.942）3 968.32±150.212）3）9 863.27±326.202）3）4 966.49±137.352）3）IL-1β/（pg·ml-1）24.28±2.32 126.74±9.121）56.99±5.602）70.55±7.232）3）216.22±20.242）3）90.07±9.332）3）30.05±3.01 120.64±10.021）40.09±4.012）50.15±5.032）3）250.62±20.042）3）80.67±8.032）3）

2.3 白花蛇舌草提取物對(duì)大鼠腹水量及肺W/D水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腹水量及肺W/D水平升高（P＜0.05）。與模型組相比，提取物組、3-MA組大鼠腹水量及肺W/D水平降低（P＜0.05），且提取物組改善效果優(yōu)于3-MA組（P＜0.05）。AICAR組大鼠腹水量及肺W/D水平較模型組進(jìn)一步升高（P＜0.05）。提取物+AICAR組腹水量及肺W/D水平高于提取物組（P＜0.05，表2）。

表2 大鼠腹水量及肺W/D水平比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of ascites volume and lung W/D level in rats （±s，n=6）

表2 大鼠腹水量及肺W/D水平比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of ascites volume and lung W/D level in rats （±s，n=6）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with extract group， 3）P＜0.05.

Lung W/D 4.28±0.82 7.74±1.121）4.79±0.602）6.05±0.932）3）9.92±1.242）3）6.37±0.732）3）Groups Sham operation Model Extract 3-MA AICAR Extract+AICAR Ascites volume/ml 0.48±0.06 10.48±1.111）2.05±0.642）5.32±1.012）3）16.23±2.202）3）8.49±1.252）3）

2.4 白花蛇舌草提取物對(duì)大鼠胰腺及肺組織病理?yè)p傷的影響 HE染色可見(jiàn)假手術(shù)組胰腺及肺組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)水腫及炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象；模型組大鼠可見(jiàn)胰腺腺泡水腫、小葉間隙增寬、片狀壞死及炎癥浸潤(rùn)明顯，肺間質(zhì)水腫、肺泡壁增厚及炎癥浸潤(rùn)明顯，胰腺及肺組織病理評(píng)分高于假手術(shù)組（P＜0.05）。提取物組及3-MA組大鼠胰腺及肺組織上述病理?yè)p傷較模型組減輕，胰腺及肺組織病理評(píng)分低于模型組（P＜0.05），且提取物組改善效果優(yōu)于3-MA組（P＜0.05）。AICAR組大鼠胰腺及肺組織病理評(píng)分較模型組進(jìn)一步升高（P＜0.05）。提取物+AICAR組胰腺及肺組織病理評(píng)分較提取物組升高（P＜0.05，圖1、表3）。

圖1 大鼠胰腺及肺組織HE染色（×400）Fig.1 HE staining of rat pancreas and lung tissues （×400）

表3 大鼠胰腺及肺組織病理學(xué)評(píng)分比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of histopathological scores of rat pancreas and lungs （±s，n=6）

表3 大鼠胰腺及肺組織病理學(xué)評(píng)分比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of histopathological scores of rat pancreas and lungs （±s，n=6）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with extract group， 3）P＜0.05.

Schmidt score of pancreas/point 0.17±0.05 3.50±0.281）1.17±0.322）1.67±0.282）3）4.17±0.322）3）2.83±0.262）3）Groups Sham operation Model Extract 3-MA AICAR Extract+AICAR Lung Holfbauer score/point 0.28±0.02 3.44±0.321）0.99±0.092）1.55±0.132）3）3.92±0.642）3）2.67±0.432）3）

2.5 白花蛇舌草提取物對(duì)大鼠胰腺自噬-胰蛋白酶活化-炎癥水平的影響 電鏡觀察可見(jiàn)假手術(shù)組胰腺組織中未見(jiàn)明顯自噬結(jié)構(gòu)。模型組可見(jiàn)大量雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體及空泡化自噬結(jié)構(gòu)，自噬結(jié)構(gòu)中包含大量未消化內(nèi)容物及胰蛋白酶原。提取物組及3-MA組可見(jiàn)自噬體及自噬空泡結(jié)構(gòu)減少。AICAR組自噬體及自噬空泡結(jié)構(gòu)進(jìn)一步增多。提取物+AICAR組自噬體及自噬空泡結(jié)構(gòu)較提取物組增多。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠胰腺組織自噬底物p62、TAP、pro-IL-1β表達(dá)升高（P＜0.05），溶酶體標(biāo)志蛋白LAMP2表達(dá)降低（P＜0.05）。與模型組相比，提取物組及3-MA組大鼠p62、TAP、pro-IL-1β表達(dá)降低（P＜0.05），LAMP2表達(dá)升高（P＜0.05），且提取物組改善效果優(yōu)于3-MA組（P＜0.05）。AICAR組大鼠胰腺組織p62、TAP、pro-IL-1β表達(dá)較模型組進(jìn)一步升高（P＜0.05），LAMP2表達(dá)較模型組進(jìn)一步降低（P＜0.05）。與提取物組相比，提取物+AICAR組大鼠胰腺組織p62、TAP、pro-IL-1β表達(dá)升高（P＜0.05），LAMP2表達(dá)降低（P＜0.05，圖2、圖3、表4）。

圖2 大鼠胰腺組織自噬結(jié)構(gòu)電鏡圖（×20 000）Fig.2 Electron microscopic observation of autophagy structure in rat pancreas （×20 000）

圖3 大鼠胰腺組織p62、TAP、pro-IL-1β、LAMP2蛋白表達(dá)免疫印跡圖Fig.3 Immunoblot of p62， TAP， pro-IL-1β， LAMP2 protein expressions in rat pancreas

表4 大鼠胰腺組織p62、TAP、pro-IL-1β、LAMP2蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.4 Comparison of p62， TAP， pro-IL-1β， LAMP2 protein expressions in rat pancreas （±s）

表4 大鼠胰腺組織p62、TAP、pro-IL-1β、LAMP2蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.4 Comparison of p62， TAP， pro-IL-1β， LAMP2 protein expressions in rat pancreas （±s）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with extract group， 3）P＜0.05.

Groups n p62/β-actin TAP/β-actin pro-IL-1β/β-actin LAMP2/β-actin Sham operation Model Extract 3-MA AICAR Extract+AICAR 9 8 9 9 7 9 1.16±0.09 0.33±0.031）1.00±0.092）0.79±0.072）3）0.19±0.012）3）0.67±0.072）3）1.13±0.07 2.10±0.191）1.36±0.122）1.79±0.162）3）2.79±0.232）3）1.80±0.182）3）1.00±0.11 2.29±0.201）1.44±0.132）1.89±0.192）3）2.95±0.212）3）1.89±0.182）3）1.09±0.08 2.43±0.211）1.49±0.112）1.91±0.202）3）2.99±0.222）3）1.90±0.182）3）

2.6 白花蛇舌草提取物對(duì)大鼠肺組織AMPK/ATG5通路及自噬-炎癥水平的影響 電鏡觀察可見(jiàn)假手術(shù)組大鼠肺組織板層小體豐富，有少量自噬體及溶酶體形成。模型組可見(jiàn)自噬小體及自噬空泡形成明顯，板層小體內(nèi)容物減少。提取物組及3-MA組大鼠肺組織板層小體內(nèi)容物逐漸豐富，自噬小體及自噬空泡明顯減少。AICAR組自噬體及自噬空泡進(jìn)一步增多。提取物+AICAR組自噬體及自噬空泡較提取物組增多。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織p-AMPK/AMPK、ATG5、LC3-Ⅱ/Ⅰ、UPS10、pro-IL-1β表達(dá)升高（P＜0.05），LAMP2表達(dá)降低（P＜0.05）。與模型組相比，提取物組及3-MA組大鼠p-AMPK/AMPK、ATG5、LC3-Ⅱ/Ⅰ、UPS10、pro-IL-1β表達(dá)降低（P＜0.05），LAMP2表達(dá)升高（P＜0.05），且提取物組改善效果優(yōu)于3-MA組（P＜0.05）。AICAR組大鼠肺組織p-AMPK/AMPK、ATG5、LC3-Ⅱ/Ⅰ、UPS10、pro-IL-1β表達(dá)較模型組進(jìn)一步升高（P＜0.05），LAMP2表達(dá)較模型組進(jìn)一步降低（P＜0.05）。與提取物組相比，提取物+AICAR組大鼠肺組織p-AMPK/AMPK、ATG5、LC3-Ⅱ/Ⅰ、UPS10、pro-IL-1β

表達(dá)升高（P＜0.05），LAMP2表達(dá)降低（P＜0.05，見(jiàn)表5、圖4、圖5）。

圖4 肺組織自噬結(jié)構(gòu)觀察圖（×10 000）Fig.4 Observation of autophagy structure in lung tissue（×10 000）

圖5 大鼠肺組織p-AMPK、AMPK、ATG5、LC3-Ⅱ/Ⅰ、UPS10、pro-IL-1β、LAMP2蛋白表達(dá)免疫印跡圖Fig.5 Immunoblot of p-AMPK， AMPK， ATG5， LC3-Ⅱ/Ⅰ， UPS10， pro-IL-1β， LAMP2 protein expressions in rat lung tissues

表5 大鼠肺組織p-AMPK/AMPK、ATG5、LC3-Ⅱ/Ⅰ、UPS10、pro-IL-1β、LAMP2蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.5 Comparison of p-AMPK/AMPK， ATG5， LC3-Ⅱ/Ⅰ， UPS10， pro-IL-1β， LAMP2 protein expressions in rat lung tissues（ ±s）

表5 大鼠肺組織p-AMPK/AMPK、ATG5、LC3-Ⅱ/Ⅰ、UPS10、pro-IL-1β、LAMP2蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.5 Comparison of p-AMPK/AMPK， ATG5， LC3-Ⅱ/Ⅰ， UPS10， pro-IL-1β， LAMP2 protein expressions in rat lung tissues（ ±s）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with extract group， 3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Extract 3-MA AICAR Extract+AICAR n 9 8 9 9 7 9 p-AMPK/AMPK ATG5/β-actin LC3-Ⅱ/Ⅰ/LC3-ⅠUPS10/β-actin pro-IL-1β/β-actin LAMP2/β-actin 1.19±0.09 0.30±0.031）0.99±0.092）0.60±0.062）3）0.10±0.012）3）0.59±0.052）3）1.04±0.10 2.29±0.221）1.22±0.122）1.70±0.212）3）2.73±0.232）3）1.84±0.222）3）1.03±0.12 2.38±0.241）1.26±0.142）1.65±0.162）3）2.94±0.202）3）1.97±0.172）3）0.23±0.05 1.22±0.121）0.41±0.062）0.68±0.112）3）1.45±0.092）3）0.94±0.122）3）1.14±0.08 2.36±0.191）1.40±0.132）1.84±0.182）3）2.90±0.232）3）1.90±0.192）3）1.07±0.07 2.47±0.201）1.50±0.122）1.87±0.182）3）2.83±0.202）3）1.98±0.182）3）

3 討論

AP并發(fā)肺損傷仍是困擾醫(yī)學(xué)界的重要問(wèn)題，對(duì)AP及肺并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制的探究也迫在眉睫。研究認(rèn)為AP患者胰蛋白酶原異常活化是導(dǎo)致胰腺細(xì)胞自我消化、腺泡破裂及炎癥介質(zhì)釋放的關(guān)鍵因素，而肺最易受炎癥攻擊及機(jī)體微循環(huán)改變的影響發(fā)生功能性改變［15］，解釋了AP患者最易因肺部急性損傷而死亡的重要原因。本研究建立大鼠AP模型發(fā)現(xiàn)，大鼠出現(xiàn)胰腺腺泡水腫、片狀壞死及炎癥浸潤(rùn)等胰腺病理?yè)p傷，血清AMY、炎癥因子IL-1β及IL-6、腹水量升高等AP癥狀出現(xiàn)同時(shí)，也出現(xiàn)肺水腫（肺W/D升高）、肺間質(zhì)炎癥浸潤(rùn)及肺泡壁增厚等肺組織結(jié)構(gòu)損傷現(xiàn)象，提示大鼠出現(xiàn)AP及肺組織炎癥損傷現(xiàn)象，表明造模成功。研究認(rèn)為抑制炎癥反應(yīng)可明顯緩解AP后肺功能損傷，并促進(jìn)患者存活［16］。大量研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)用清熱解毒、消癰散瘀方法可顯著改善AP及肺組織損傷［17］。白花蛇舌草有清熱解毒及消腫作用，是清熱解毒方劑中最常用的中藥之一，其提取物中的羥基蒽醌類、黃酮類、萜類等有效化合物有較好的抗炎、抗菌及抗腫瘤作用，可在短時(shí)間內(nèi)控制大鼠因細(xì)菌感染或化學(xué)誘變引起的熱勢(shì)增長(zhǎng)、炎癥病理狀態(tài)改變及免疫器官萎縮等作用［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，給予AP肺損傷大鼠一定劑量白花蛇舌草提取物后，大鼠血清炎癥因子及AMY水平降低，胰腺及肺組織炎癥浸潤(rùn)等病理?yè)p傷明顯緩解，提示白花蛇舌草可能是防治AP及肺組織炎癥損傷的潛在藥物。

自噬小體與自噬溶酶體結(jié)合形成的正常自噬可促進(jìn)腺泡細(xì)胞清除、降解衰老及受損細(xì)胞器，發(fā)揮保護(hù)胰腺細(xì)胞作用，另外胰腺腺泡細(xì)胞也依賴于溶酶體和胰蛋白酶原，形成自噬系統(tǒng)降解腺泡酶原顆粒，發(fā)揮正常生理功能［19］。但AP患者中關(guān)鍵的組織蛋白酶B加工成熟缺陷引起的溶酶體缺陷，如LAMP2表達(dá)減少，可導(dǎo)致“自噬體”不能與“溶酶體”結(jié)合，而在腺泡細(xì)胞內(nèi)積聚形成大液泡即“自噬性液泡”，并引起腺泡細(xì)胞空泡化、腺泡酶原顆粒積聚及活化，最終引發(fā)“炎癥瀑布效應(yīng)”活化［20］。另外，AP患者血清IL-6及IL-1β升高，也可促進(jìn)LC3Ⅰ及自噬體在肺泡胞漿內(nèi)積聚而激活自噬，且高效率的自噬可靶向隔離并降解pro-IL-1β，阻斷IL-1β成熟及分泌，緩解肺組織炎癥損傷［21］。本研究在AP大鼠胰腺及肺組織檢測(cè)到自噬效率降低（自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/Ⅰ及自噬底物p62升高、溶酶體相關(guān)蛋白LAMP2表達(dá)降低、自噬體及自噬空泡大量積聚），胰腺組織胰蛋白酶原活化（TAP升高），及胰腺和肺組織pro-IL-1β表達(dá)升高，而用自噬抑制劑3-MA抑制自噬體形成提高自噬效率后，大鼠AP癥狀及肺組織病理?yè)p傷均明顯減輕，提示提高自噬效率可能從根本上阻斷溶酶體缺陷引起的胰酶原活化、胰腺損傷及“炎癥瀑布效應(yīng)”，緩解AP及其并發(fā)癥。

AMPK及ATG5是與炎癥-自噬相關(guān)調(diào)節(jié)因子。研究證實(shí)IL-6、IL-18及IL-1β等炎癥因子升高可激活A(yù)MPK調(diào)控炎癥反應(yīng)總開(kāi)關(guān)，如NF-κB入核活化負(fù)調(diào)控炎癥因子釋放［22］，但AMPK磷酸化活化也可直接磷酸化ULK1，啟動(dòng)Ⅲ類磷脂酰肌3-激酶效應(yīng)器（Ptd Ins3P）效應(yīng)蛋白WIPI活化并招募ATG5形成泛素類復(fù)合物，啟動(dòng)自噬并介導(dǎo)自噬泡形成［23］。另外ATG5缺失可阻止IL-13刺激氣管上皮細(xì)胞分泌黏液緩解哮喘等炎癥疾病發(fā)展［24］。本研究在AP大鼠模型肺及胰腺組織檢測(cè)到AMPK及ATG5表達(dá)升高，用AMPK激活劑進(jìn)一步促進(jìn)AMPK激活后，大鼠表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的炎癥及自噬效率降低，提示AMPK及ATG5活化可能進(jìn)一步促進(jìn)自噬小體積累，使自噬效率進(jìn)一步減弱，大鼠表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。張浩瑞等［10］發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草除抗炎作用外，也可調(diào)控自噬，發(fā)揮抗癌作用。本研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草提取物處理后大鼠胰腺及肺組織出現(xiàn)自噬效率提高及炎癥IL-1β、pro-IL-1β表達(dá)降低，肺組織AMPK及ATG5活性抑制，且LAMP2表達(dá)升高及自噬效率提高，明顯優(yōu)于自噬抑制劑3-MA組，提示白花蛇舌草提取物可通過(guò)抑制AMPK及ATG5活性阻斷自噬體形成，并提高自噬效率，發(fā)揮抗AP及肺損傷炎癥損傷作用。AMPK激活劑可部分減弱白花蛇舌草提取物抑制AMPK及ATG5活性、提高自噬效率、抗AP及肺炎癥損傷作用。

綜上，白花蛇舌草提取物可通過(guò)抑制AMPK及ATG5活性阻斷自噬體形成，并提高自噬效率，發(fā)揮抗AP大鼠肺組織炎癥損傷作用，可能為闡明白花蛇舌草提取物抵御炎癥-自噬及防治AP并發(fā)癥的可能機(jī)制提供參考，但AMPK激活劑不能完全減弱白花蛇舌草提取物修復(fù)溶酶體缺陷、提高自噬效率及抗炎的作用，提示白花蛇舌草提取物還可能通過(guò)其他途徑修復(fù)AP溶酶體缺陷引起的自噬效率降低，具體機(jī)制有待后續(xù)探究。