張書力 馮 丹 （武漢市第一醫(yī)院疼痛科，武漢 430022）

糖尿病神經(jīng)病理性疼痛（diabetic neuropathic pain，DNP）是臨床上常見的糖尿病并發(fā)癥之一，以肢端誘發(fā)或自發(fā)性痛覺超敏為主，夜間疼痛加劇，造成患者失眠、煩躁、精神差，極大影響其工作效率與生活質(zhì)量，是如今醫(yī)學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)［1-2］。高糖引發(fā)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)在DNP的發(fā)生和病情進(jìn)展過程中起到關(guān)鍵作用，積極抗炎、減輕軀體神經(jīng)組織受損是很有前景的DNP治療策略［3-4］。槲皮素是普遍存在于植物中的黃酮類化合物，是一種天然抗氧化劑，具有降低血糖、消炎止痛、抗衰老等多種生物學(xué)活性，可通過降低血糖及抗氧化作用減輕糖尿病大鼠神經(jīng)損傷，促使神經(jīng)元存活［5］；還能夠以劑量依賴性方式降低紫杉醇誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)，減輕大鼠神經(jīng)病理學(xué)疼痛［6］。由此可知，槲皮素對(duì)DNP具有很大的治療潛力。激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)激活會(huì)促進(jìn)病理性炎癥產(chǎn)生并進(jìn)行放大，參與介導(dǎo)糖尿病視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病理性疼痛等疾病發(fā)病過程。而緩激肽B1受體（bradykinin B1 receptor，BDKRB1）是調(diào)控激肽系統(tǒng)的重要受體蛋白，在糖尿病患者體內(nèi)過度表達(dá)，對(duì)其進(jìn)行抑制可限制炎癥發(fā)展，治療高糖引發(fā)的視網(wǎng)膜疾病，并改善神經(jīng)病理性疼痛癥狀［7-8］。但槲皮素是否可以通過下調(diào)BDKRB1表達(dá)減輕糖尿病導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛尚未有明確闡述。本文通過構(gòu)建DNP大鼠模型對(duì)此問題進(jìn)行研討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 78只SPF級(jí)SD雄性大鼠購(gòu)自北京科興中維生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SYXK（京）2020-0054，體質(zhì)量180～210 g。于武漢市第一醫(yī)院動(dòng)物中心的屏障環(huán)境動(dòng)物房中適應(yīng)飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)，分籠飼養(yǎng)，5～6只/籠，采用明暗各12 h循環(huán)交替進(jìn)行光照，溫度22.5～25.0 ℃，濕度55%～60%，通風(fēng)設(shè)為9～12次/h。本研究經(jīng)武漢市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

1.1.2 主要試劑與儀器 槲皮素（純度：HPLC≥98%，貨號(hào)：SQ8030）、大鼠白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17） ELISA試劑盒（貨號(hào)：SEKR-0007）、總RNA提取試劑盒（貨號(hào)：R1200）、大鼠IL-18 ELISA試劑盒（貨號(hào)：SEKR-0054）、大鼠環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase，COX-2）ELISA試劑盒（貨號(hào)：SEKR-0075）、OCT冰凍切片包埋劑（貨號(hào)：4583）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒、空載質(zhì)粒、BDKRB1與GAPDH引物、一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒（貨號(hào)：B639277-0100）、RIPA裂解液（貨號(hào)：C500005-0050）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；兔源Anti-BDKRB1一抗（貨號(hào)：ABR-011）購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；大鼠二步法免疫組織化學(xué)試劑盒（貨號(hào)：ZLI-9017）購(gòu)自北京中杉金橋公司；兔源Anti-β-Tubulin一抗（貨號(hào)：ab21058）、兔源Anti-LFA-1一抗（貨號(hào)：ab186873）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（貨號(hào)：P0012S）、羊抗兔二抗（貨號(hào)：A0277）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Von Frey纖毛機(jī)械刺激針購(gòu)自意大利UGO公司；ZH-YLS-6B智能熱板儀購(gòu)自上海珂淮儀器有限公司；ND-2000C超微量核酸分析儀、Multiskan FC多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；CFX96 Touch Deep Well熒光定量PCR儀、PowerPac Universal電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；CM1950冰凍切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；CX23光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；eBlot L1快速濕轉(zhuǎn)儀購(gòu)自南京貝登醫(yī)療股份有限公司；JS-1070P化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自上海培清科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNP大鼠模型的制備及分組給藥 SD大鼠給予60 mg/kg的鏈脲佐菌素（溶于生理鹽水）腹腔注射，同時(shí)以Von Frey纖毛機(jī)械刺激針檢測(cè)大鼠后足機(jī)械性縮足閾值，作為基礎(chǔ)值，1周后取尾靜脈血測(cè)量空腹血糖，選用連續(xù)2次測(cè)量值均＞16.7 mmol/L的大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，3周后再次檢測(cè)大鼠后足機(jī)械性縮足閾值，當(dāng)其＜80%基礎(chǔ)值時(shí)，表明DNP模型建立成功［9］。本研究造模65只，共成功60只，將其以隨機(jī)數(shù)表法平均分為5組：模型組、槲皮素（100 mg/kg）組、BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組、空載質(zhì)粒組、槲皮素（100 mg/kg）+BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組，另選12只大鼠，腹腔注射等劑量生理鹽水，作為對(duì)照組。

將槲皮素加入生理鹽水中溶解混勻，得到10 mg/ml的藥液，槲皮素+BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組大鼠以10 ml/kg劑量灌胃藥液，使槲皮素給藥劑量達(dá)到100 mg/kg，1次/d［10］。同時(shí)參照文獻(xiàn)［11］及說明書尾靜脈注射BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒，給藥劑量為10 nmol，2次/周；槲皮素組大鼠每日灌胃100 mg/kg槲皮素1次，同時(shí)以與槲皮素+BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組相同的劑量尾靜脈注射生理鹽水，2次/周；BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組、空載質(zhì)粒組大鼠參照文獻(xiàn)［9］及說明書尾靜脈注射BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒與空載質(zhì)粒，給藥劑量均為10 nmol，每周2次，同時(shí)每日以與槲皮素+BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組相同的劑量灌胃生理鹽水1次；對(duì)照組與模型組大鼠以與槲皮素+BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組相同的劑量尾靜脈注射生理鹽水，每周2次，同時(shí)每日以與槲皮素+BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組相同的劑量灌胃生理鹽水1次，各組大鼠均給藥干預(yù)3周。

1.2.2 檢測(cè)大鼠痛覺超敏癥狀 最后一次給藥后24 h，取出各組大鼠進(jìn)行安撫，待其安靜后，以Von Frey纖毛機(jī)械刺激針刺大鼠右側(cè)后足至爪輕度彎曲，探針克數(shù)由小至大分別針刺6 s，記錄大鼠產(chǎn)生縮足或舔爪疼痛反應(yīng)時(shí)的探針克數(shù)，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值，即得到機(jī)械縮足閾值。

機(jī)械性刺激痛覺檢測(cè)結(jié)束后，將大鼠安撫至安靜，智能熱板儀的溫度設(shè)為43～45 ℃，待溫度達(dá)標(biāo)后，分別將大鼠置于熱板上，記錄大鼠產(chǎn)生舔爪或撤回后足疼痛反應(yīng)的所用時(shí)間，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值，即得到熱縮足潛伏期，為避免大鼠受傷，熱縮足潛伏期最長(zhǎng)為60 s。

熱刺激痛覺檢測(cè)結(jié)束后，將大鼠安撫至安靜，于其后足皮膚上滴加0.1 ml丙酮，大鼠出現(xiàn)抬足行為時(shí)開始計(jì)時(shí)，至其放下抬起的后足，計(jì)時(shí)結(jié)束，共重復(fù)3次，得到的時(shí)間取平均值，即為冷刺激抬足時(shí)間。

1.2.3 采集標(biāo)本并檢測(cè)大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況 痛覺超敏檢測(cè)結(jié)束后，大鼠吸入異氟醚麻醉，采集頸動(dòng)脈血4 ℃離心，吸出上清、分組標(biāo)記后-80 ℃保存?zhèn)溆?。頸椎脫臼處死大鼠，解剖取出脊髓背根神經(jīng)節(jié)，以手術(shù)剪取下0.4 g組織塊保存在液氮中備用；以同樣方法再次取脊髓背根神經(jīng)節(jié)組織0.5 g，剪碎，冰水浴勻漿，4 ℃離心，吸出上清，BCA測(cè)量蛋白總濃度，分組標(biāo)記后于-80 ℃保存?zhèn)溆?；剩余脊髓背根神?jīng)節(jié)組織經(jīng)生理鹽水漂洗、30%蔗糖脫水沉底、OCT包埋、液氮冰凍成塊、切片后，選出沒有破損且厚薄均勻的切片復(fù)溫5 min后浸入冰丙酮中固定，滴加LFA-1一抗孵育后洗滌，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后拍照，鏡下觀察，Image J軟件分析計(jì)算背根神經(jīng)節(jié)LFA-1陽性細(xì)胞比例（%）=LFA-1陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 測(cè)定大鼠血清炎癥介質(zhì)IL-17、COX-2、IL-18水平 取1.2.3中凍存的血清，冰水浴解凍，參照試劑盒說明書測(cè)量其中IL-17、COX-2、IL-18水平。

1.2.5 檢測(cè)大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1 mRNA表達(dá)水平 取1.2.3中凍存的脊髓背根神經(jīng)節(jié)組織，置研缽中加入總RNA提取試劑研碎，參照試劑盒說明書提取組織中RNA后，超微量核酸分析儀測(cè)量其濃度，熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件按照說明書設(shè)定，得到各組基因Ct值，以2-ΔΔCt法分析計(jì)算，GAPDH做內(nèi)參對(duì)照，最終獲得BDKRB1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，引物序列見表1。

表1 基因引物序列Tab.1 Gene primer sequences

1.2.6 檢測(cè)脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1蛋白表達(dá)自液氮中取出1.2.3中的脊髓背根神經(jīng)節(jié)組織蛋白樣品液，根據(jù)分子量測(cè)定結(jié)果各組均取總蛋白20 μg，煮沸變性（100 ℃，6 min）、上樣電泳（恒壓120 V，60 min）、濕轉(zhuǎn)（穩(wěn)流40 mA，70 min），以脫脂奶粉溶液封閉分離后蛋白的非特異位點(diǎn)，然后將目的蛋白BDKRB1、β-Tubulin自硝酸纖維膜上剪下，孵育一抗（4 ℃，10 h）、TBST洗滌（3次，5 min/次）、孵育二抗（37.5 ℃，90 min）、TBST洗滌（3次，5 min/次）、化學(xué)發(fā)光法顯色、拍照，使用軟件Image J定量圖片中蛋白條帶灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后獲得其相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用±s表示，作為計(jì)量資料輸入SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)；多組間差異比較采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)大鼠疼痛的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠機(jī)械性縮足閾值降低，熱敏潛伏期顯著縮短（P＜0.05），冷刺激抬足時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）；與模型組、槲皮素+BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組分別比較，槲皮素組大鼠機(jī)械性縮足閾值增大，熱敏潛伏期均延長(zhǎng)（P＜0.05），冷刺激抬足時(shí)間縮短（P＜0.05）；BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組大鼠機(jī)械性縮足閾值降低，熱敏潛伏期均縮短（P＜0.05），冷刺激抬足時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.05）；空載質(zhì)粒組大鼠機(jī)械性縮足閾值、冷刺激抬足時(shí)間、熱敏潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠機(jī)械性縮足閾值、冷刺激抬足時(shí)間、熱敏潛伏期（±s，n=12）Tab.2 Mechanical paw withdrawal threshold， cold stimulation foot lift time and heat sensitivity latency of rats in each group （±s，n=12）

表2 各組大鼠機(jī)械性縮足閾值、冷刺激抬足時(shí)間、熱敏潛伏期（±s，n=12）Tab.2 Mechanical paw withdrawal threshold， cold stimulation foot lift time and heat sensitivity latency of rats in each group （±s，n=12）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid group， 3）P＜0.05.

Groups Control Model Quercetin BDKRB1 overexpression plasmid Empty plasmid Quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid Mechanical paw withdrawal threshold/g 22.46±2.61 8.57±1.271）20.01±3.152）3）Cold stimulation paw lift time/s 2.43±0.36 13.05±1.431）3.01±0.392）3）Heat sensitivity latency/s 59.32±0.67 11.03±1.121）56.58±6.402）3）1.23±0.302）3）20.67±3.602）3）1.81±0.422）3）8.72±1.46 12.87±1.15 11.72±1.45 7.98±1.52 12.34±1.76 12.24±1.73

2.2 槲皮素對(duì)大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)LFA-1陽性細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05）；與模型組、槲皮素+BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組分別比較，槲皮素組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)LFA-1陽性細(xì)胞比例均降低（P＜0.05）；BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)LFA-1陽性細(xì)胞比例均升高（P＜0.05）；空載質(zhì)粒組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)LFA-1陽性細(xì)胞比例差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表3。

圖1 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（×200）Fig.1 Lymphocyte infiltration in spinal dorsal root ganglion of rats in each group was detected by immunohistochemical staining （×200）

表3 各組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)LFA-1陽性細(xì)胞比例（±s，n=12）Tab.3 Proportion of LFA-1 positive cells in spinal dorsal root ganglion of rats in each group （±s，n=12）

表3 各組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)LFA-1陽性細(xì)胞比例（±s，n=12）Tab.3 Proportion of LFA-1 positive cells in spinal dorsal root ganglion of rats in each group （±s，n=12）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid group， 3）P＜0.05.

Proportion of LFA-1 positive cells/%1.84±0.51 24.53±3.921）2.72±0.462）3）39.86±5.132）3）25.15±4.61 22.47±4.18 Groups Control Model Quercetin BDKRB1 overexpression plasmid Empty plasmid Quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid

2.3 槲皮素對(duì)大鼠血清炎癥介質(zhì)IL-17、COX-2、IL-18水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-17、COX-2、IL-18水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組、槲皮素+BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組分別比較，槲皮素組大鼠血清IL-17、COX-2、IL-18水平均降低（P＜0.05）；BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組大鼠血清IL-17、COX-2、IL-18水平均升高（P＜0.05）；空載質(zhì)粒組大鼠血清IL-17、COX-2、IL-18水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠血清炎癥介質(zhì)IL-17、COX-2、IL-18水平（±s，n=12）Tab.4 Levels of serum inflammatory mediators IL-17，COX-2 and IL-18 of rats in each group （±s，n=12）

表4 各組大鼠血清炎癥介質(zhì)IL-17、COX-2、IL-18水平（±s，n=12）Tab.4 Levels of serum inflammatory mediators IL-17，COX-2 and IL-18 of rats in each group （±s，n=12）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid group， 3）P＜0.05.

Groups Control Model Quercetin BDKRB1 overexpression plasmid Empty plasmid quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid IL-17/（pg·ml-1）9.13±1.25 43.74±5.611）10.84±1.372）3）COX-2/（ng·ml-1）0.92±0.13 6.03±1.291）1.18±0.362）3）IL-18/（pg·ml-1）48.63±5.72 115.42±13.561）51.72±6.342）3）71.23±8.122）3）11.24±2.182）3）194.26±25.812）3）44.09±6.40 6.15±1.53 116.35±15.13 40.98±6.04 5.69±1.05 112.06±15.40

2.4 槲皮素對(duì)大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1 mRNA表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組、槲皮素+BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組分別比較，槲皮素組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1 mRNA表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；空載質(zhì)粒組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1 mRNA表達(dá)水平（±s，n=12）Tab.5 Expression level of BDKRB1 mRNA in spinal dorsal root ganglion of rats in each group （±s，n=12）

表5 各組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1 mRNA表達(dá)水平（±s，n=12）Tab.5 Expression level of BDKRB1 mRNA in spinal dorsal root ganglion of rats in each group （±s，n=12）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group，2）P＜0.05； compared with quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid， 3）P＜0.05.

BDKRB1/GAPDH 0.97±0.12 1.78±0.361）1.08±0.152）3）2.46±0.412）3）1.83±0.32 1.49±0.24 Groups Control Model Quercetin BDKRB1 overexpression plasmid Empty plasmid Quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid

2.5 槲皮素對(duì)大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1蛋白表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組、槲皮素+BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組分別比較，槲皮素組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05）；BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；空載質(zhì)粒組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表6。

圖2 免疫印跡檢測(cè)各組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of BDKRB1 protein in spinal dorsal root ganglion of rats in each group was detected by Western blot

表6 各組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1蛋白相對(duì)表達(dá)水平（±s，n=12）Tab.6 Relative expression level of BDKRB1 protein in spinal dorsal root ganglion of rats in each group（±s，n=12）

表6 各組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)BDKRB1蛋白相對(duì)表達(dá)水平（±s，n=12）Tab.6 Relative expression level of BDKRB1 protein in spinal dorsal root ganglion of rats in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid group， 3）P＜0.05.

BDKRB1/β-Tubulin 0.63±0.11 1.29±0.281）0.70±0.132）3）1.82±0.322）3）1.31±0.27 1.15±0.19 Groups Control Model Quercetin BDKRB1 overexpression plasmid Empty plasmid Quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid

3 討論

我國(guó)糖尿病患者眾多，臨床資料顯示其中大多數(shù)會(huì)發(fā)生DNP，是造成患者肢端疼痛和步態(tài)障礙，甚至殘疾的重要因素，因此積極探索有效的治療藥物極具臨床價(jià)值［12］。本研究以腹腔注射60 mg/kg鏈脲佐菌素方法建立DNP大鼠模型，結(jié)果顯示，大鼠注射鏈脲佐菌素后，其血糖顯著升高，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子IL-17、COX-2及IL-18大量產(chǎn)生釋放，可引發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而造成外周神經(jīng)損傷［13］。LFA-1作為淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原，是反映組織炎癥中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況的重要標(biāo)志物［14］。本實(shí)驗(yàn)中造模大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)中LFA-1陽性細(xì)胞比例明顯升高，提示高糖誘導(dǎo)的炎癥因子過量表達(dá)導(dǎo)致了炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)脊髓神經(jīng)組織，引發(fā)了嚴(yán)重的外周神經(jīng)炎癥損傷，造成大鼠機(jī)械性刺激與冷、熱刺激痛覺超敏，表明DNP模型建立成功。

目前DNP的臨床治療方法不多，主要以維生素營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、抗炎止痛及降低血糖等為主，但患者預(yù)后并不理想，如今中醫(yī)藥中含有的天然化合物在DNP的治療中越來越受到重視［15-16］。槲皮素作為一種天然抗炎抗氧化劑，常用于改善糖尿病、關(guān)節(jié)炎、慢性前列腺炎等多種炎癥性疾病的治療，可明顯抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)和分泌，減輕慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛綜合征大鼠痛覺超敏，并顯著改善紫杉醇所致的神經(jīng)病理學(xué)疼痛［6，17-18］。因此，槲皮素可作為防治DNP的潛在藥物。本實(shí)驗(yàn)以槲皮素處理DNP大鼠，可顯著降低炎癥因子IL-17、COX-2及IL-18水平及LFA-1陽性細(xì)胞比例，阻礙炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)脊髓背根神經(jīng)節(jié)，減弱大鼠機(jī)械性刺激與冷、熱刺激痛覺超敏，表明槲皮素可抑制炎癥因子表達(dá)，阻礙炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及脊髓神經(jīng)組織炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減輕DNP大鼠疼痛，與既往研究結(jié)果相似，具有很強(qiáng)的消炎鎮(zhèn)痛功效，在DNP的治療中具有很大的發(fā)展前景。

BDKRB1是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的重要調(diào)控蛋白，在糖尿病、谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性、神經(jīng)疼痛等病理過程中均過表達(dá)，下調(diào)BDKRB1表達(dá)或拮抗其活性可抑制高糖引發(fā)的炎癥，改善谷氨酸導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，并通過阻礙炎癥進(jìn)展減輕創(chuàng)傷引起的慢性疼痛，提示BDKRB1是DNP的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)［7，19-20］。本研究探討了下調(diào)BDKRB1表達(dá)是否為槲皮素改善DNP疼痛癥狀的分子機(jī)制，結(jié)果顯示，以BDKRB1過表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)DNP大鼠BDKRB1表達(dá)，可促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子分泌，加重炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，最終加劇大鼠疼痛；當(dāng)其與槲皮素合用時(shí)，可拮抗槲皮素對(duì)炎癥因子表達(dá)與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的抑制作用，并減弱對(duì)大鼠痛覺超敏的改善作用，最終逆轉(zhuǎn)槲皮素對(duì)DNP大鼠的鎮(zhèn)痛作用。

綜上，本研究證實(shí)槲皮素可通過下調(diào)BDKRB1表達(dá)減少炎癥因子的生成分泌，抑制炎性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，抵抗脊髓背根神經(jīng)炎癥，減弱DNP大鼠疼痛超敏癥狀，最終發(fā)揮顯著的消炎止痛功效。本研究為DNP的臨床治療提供了新的參考，對(duì)槲皮素的推廣應(yīng)用做出了一定貢獻(xiàn)。