張怡 侯仙明 張拴成 周曉紅 劉璐瑤 王澤超 高維娟

（河北中醫(yī)藥大學(xué)，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050091）

腦卒中是世界范圍內(nèi)引發(fā)人類死亡和殘疾的常見病。近年來，盡管腦卒中的發(fā)病率有所下降，但其相關(guān)病死率在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家都居高不下［1］。流行病學(xué)調(diào)查顯示腦卒中已經(jīng)成為全球第二位、我國首位致死原因，其中缺血性腦卒中占比較大，約占全部腦血管病的87%［2-3］。腦組織極易受缺血影響，腦血流完全中斷5 min后就會觸發(fā)神經(jīng)元大量死亡，因此亟需通過血流的再通恢復(fù)腦組織氧氣和營養(yǎng)的供應(yīng)，但血流恢復(fù)后，有時(shí)也會由于自由基的過量產(chǎn)生和炎癥細(xì)胞的異常募集等造成腦組織二次損傷，即腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷。最新研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡在腦I/R損傷中具有重要作用，是干預(yù)腦I/R損傷的最新靶點(diǎn)［4］。黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ）從中藥黃芪中提取，是黃芪的主要活性成分之一。大量研究表明，黃芪甲苷可有效緩解包括腦I/R損傷在內(nèi)的多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］。課題組前期研究證實(shí)，黃芪甲苷可通過調(diào)控細(xì)胞自噬和凋亡緩解腦I/R損傷［6］，但其對I/R損傷后神經(jīng)細(xì)胞焦亡的作用及具體機(jī)制鮮有報(bào)道。因此，依托前期基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)通過大鼠大腦中動脈阻塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型研究黃芪甲苷對Caspase-1經(jīng)典焦亡信號通路的影響，從抑制細(xì)胞焦亡角度，探討其緩解腦I/R損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性清潔級SD大鼠60只，體質(zhì)量240～280 g，8～10周齡，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2016-0011。本研究經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物管理和倫理委員會審核（編號：DWLL202203020），受試動物實(shí)驗(yàn)過程符合醫(yī)學(xué)倫理要求。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及主要試劑 黃芪甲苷，規(guī)格：20 mg，純度＞98%，購于上海源葉生物科技有限公司。TTC染色液（2%）由北京索萊寶科技有限公司提供；NLRP3單克隆抗體（ab270449）、IL-18單克隆抗體（ab207323）均購于Abcam公司；IL-1β多克隆抗體（A11369）由Abclonal公司提供；Cleaved Caspase-1多克隆抗體（AF4005）購自Affinity公司；HE染色試劑盒、小鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體、TUNEL試劑盒均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 多功能小動物手術(shù)臺購自Kent公司；體式顯微鏡（SMZ745）購自NIKON公司；組織包埋機(jī)（EG11508）、全自動輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（RM2265）、熒光顯微鏡（DM5000B）均為Leica公司產(chǎn)品；雙色紅外激光成像系統(tǒng)（Odyssey clx）購自Licor公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備與給藥方法 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將SD大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組（Sham）、模型組（MCAO/R）、溶劑對照組（DMSO）和黃芪甲苷組（AS-Ⅳ）（20 mg/kg）。大鼠腦I/R損傷模型按照如下方法制備：戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉提前禁食禁水的大鼠，麻醉后的大鼠采用仰臥位固定于小動物手術(shù)臺上，并將體溫保持在（37±0.5） ℃。將大鼠沿頸部中線切開皮膚，小心分離頸外動脈，然后將線栓從頸外動脈插入頸內(nèi)動脈并抵達(dá)大腦中動脈的起點(diǎn)，從而閉塞大腦中動脈，實(shí)現(xiàn)腦組織缺血［7］。阻塞大腦中動脈2 h后，拔出線栓恢復(fù)腦血流，完成大鼠腦組織I/R。假手術(shù)組大鼠除不進(jìn)行插線外，其他步驟與模型組相同。黃芪甲苷溶于DMSO中，于再灌注的同時(shí)腹腔注射給藥，藥物濃度為20 mg/kg［8］。

1.2.2 Zea Longa神經(jīng)功能學(xué)評分 在大鼠手術(shù)蘇醒后和腦I/R 24 h，由對實(shí)驗(yàn)分組不明的研究人員對大鼠進(jìn)行Zea Longa神經(jīng)功能學(xué)評分，評估大鼠的神經(jīng)功能缺陷［9］。

1.2.3 TTC染色 I/R 24 h后，每組隨機(jī)選擇3只大鼠，麻醉后斷頭取腦，腦組織置于-20 ℃冰箱冷凍10 min后，分解為2 mm厚的冠狀切片，37 ℃下采用2%TTC染液對腦組織切片進(jìn)行染色，終止染色后使用相機(jī)對腦組織切片進(jìn)行拍照。其中白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)，紅色區(qū)域表示正常組織。

1.2.4 HE染色 腦組織石蠟切片脫蠟至水后，按試劑盒說明進(jìn)行HE染色，鏡下觀察腦組織病理損傷并進(jìn)行拍照。

1.2.5 Caspase-1和TUNEL免疫熒光雙染色 將腦組織石蠟切片脫蠟至水，滴加Proteinase K工作液，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min；按照Recombinant TdT enzyme∶FITC-12-dUTP Labeling Mix∶Equilibration Buffer=1 μl∶5 μl∶50 μl（1∶5∶50）比例配制TdT孵育緩沖液；滴加50 μl TdT孵育緩沖液，孵育Caspase-1一抗（1∶50），4 ℃過夜，孵育二抗，DAPI工作液37 ℃染核，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察拍照，Caspase-1呈紅色熒光，TUNEL呈綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。陽性細(xì)胞為3色重疊細(xì)胞，使用Image-Pro Plus 6.0軟件對細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.2.6 Western blot測定腦組織焦亡通路相關(guān)蛋白表達(dá) 分離缺血側(cè)腦組織并勻漿，12 000 r/min、4 ℃離心收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，滴加NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-18及IL-1β抗體，稀釋濃度均為1∶1 000， 4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜。二抗稀釋濃度為1∶3 000，搖床輕搖，室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯影條帶，條帶分析應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用xˉ±s表示，不同實(shí)驗(yàn)組間的比較應(yīng)用單因素方差分析和多重比較的dunnett′s方法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷顯著改善MCAO/R大鼠神經(jīng)功能缺損 如圖1所示，腦I/R 24 h導(dǎo)致大鼠神經(jīng)功能學(xué)評分顯著升高，出現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損情況（P＜0.01）；黃芪甲苷治療后，大鼠神經(jīng)缺損情況明顯緩解，神經(jīng)功能學(xué)評分顯著降低（P＜0.01）；溶劑對照組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評分與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠腦I/R 24 h神經(jīng)功能缺損情況Fig.1 Neurological deficit of rats at 24 h after I/R in each group

2.2 黃芪甲苷有效縮小MCAO/R大鼠腦梗死體積 如圖2所示，假手術(shù)組大鼠腦組織全域紅染，無明顯梗死灶；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織出現(xiàn)大范圍白色梗死區(qū)域（P＜0.01）；黃芪甲苷治療后，大鼠腦梗死體積同模型組相比顯著縮?。≒＜0.01）；溶劑對照組大鼠腦梗死體積與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠腦I/R 24 h腦組織梗死體積Fig.2 Infarct volume of rats measured at 24 h after cerebral I/R in each group

2.3 黃芪甲苷顯著緩解MCAO/R大鼠腦組織病理損傷 如圖3所示，假手術(shù)組大鼠腦組織細(xì)胞數(shù)量豐富且形態(tài)正常；模型組及溶劑對照組大鼠腦組織細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分細(xì)胞核濃縮、染色變深，或見細(xì)胞核溶解、消失，細(xì)胞體變小，排列紊亂，部分壞死細(xì)胞溶解消失（黑色箭頭所示）；黃芪甲苷治療后，大鼠腦組織病理損傷顯著緩解，細(xì)胞數(shù)量相對豐富，細(xì)胞水腫、胞質(zhì)呈空泡狀（黑色箭頭所示）。

圖3 各組大鼠腦組織形態(tài)（×200）Fig.3 Morphology of brain tissue of rats in each group（×200）

2.4 黃芪甲苷有效減輕MCAO/R大鼠腦組織細(xì)胞焦亡 如圖4所示，假手術(shù)組腦組織可見個(gè)別紅、綠、藍(lán)三色重疊細(xì)胞；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織三色重疊細(xì)胞（綠色箭頭所示）明顯增多，細(xì)胞焦亡顯著增多（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組大鼠腦組織陽性細(xì)胞（綠色箭頭所示）顯著減少，細(xì)胞焦亡有所緩解（P＜0.01）；溶劑對照組大鼠腦組織焦亡細(xì)胞數(shù)與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 黃芪甲苷顯著降低MCAO/R大鼠腦組織經(jīng)典焦亡途徑相關(guān)蛋白NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β及IL-18表達(dá) 如圖5所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β及IL-18蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪甲苷組大鼠腦組織NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β及IL-18蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01），溶劑對照組各蛋白表達(dá)與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 各組大鼠腦組織NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β及IL-18蛋白表達(dá)Fig.5 Expressions of NLRP3， Cleaved Caspase-1，IL-1β and IL-18 in brain tissue of rats in each group

3 討論

I/R損傷是缺血性腦卒中通過溶栓或手術(shù)恢復(fù)血流供應(yīng)后的常見并發(fā)癥，可引發(fā)一系列有害的細(xì)胞反應(yīng)，最終通過細(xì)胞死亡導(dǎo)致腦功能衰竭［10］。最新研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡是腦I/R損傷的重要病理生理過程，可引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷或死亡，調(diào)控細(xì)胞焦亡成為干預(yù)腦I/R損傷的最新靶點(diǎn)［11］。

細(xì)胞焦亡是一類程序性、溶解性細(xì)胞死亡方式，以質(zhì)膜快速破裂，隨后釋放細(xì)胞內(nèi)容物和促炎介質(zhì)為特征，其中經(jīng)典焦亡途徑依賴于Caspase-1介導(dǎo)［12］。大量研究顯示，Caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典焦亡途徑參與了腦I/R后神經(jīng)元損傷，阻斷Caspase-1表達(dá)能顯著緩解I/R后腦組織損傷［13］。Caspase-1的激活由一系列能形成炎性小體的模式識別受體觸發(fā)。NLRP3是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的炎性小體，由NLRP3、ASC和Caspase-1組成［14］。腦I/R損傷發(fā)生后，受損腦組織細(xì)胞線粒體迅速產(chǎn)生活性氧，并啟動氧化應(yīng)激等程序［15］?；钚匝蹩纱龠M(jìn)NLRP3、ASC、pro Caspase-1寡聚，進(jìn)而激活NLRP3炎性小體。活化的NLRP3炎性小體促進(jìn)pro Caspase-1自切割為成熟的Caspase-1。成熟的Caspase-1具有兩種功能：①切割GSDMD并產(chǎn)生GSDMD-NT片段，GSDMD-NT片段可與質(zhì)膜中的磷酸肌醇結(jié)合，在細(xì)胞膜形成寡聚孔，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生焦亡；②催化pro-IL-18和pro-IL-1β成熟為IL-18和IL-1β，它們被釋放到細(xì)胞外基質(zhì)，引起炎癥反應(yīng)［16］。因此，尋找能夠安全有效緩解細(xì)胞焦亡、抑制炎癥反應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)劑成為神經(jīng)科學(xué)界亟待解決的問題。本研究顯示，大鼠腦I/R后，神經(jīng)功能嚴(yán)重缺損，腦組織大范圍梗死，神經(jīng)細(xì)胞焦亡顯著，NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β及IL-18蛋白表達(dá)明顯升高，Caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典焦亡通路被激活。

大量研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用。其中黃芪為諸多醫(yī)家治療腦卒中的首選藥。名醫(yī)王肯堂曾提出：“卒仆、偏枯之癥，雖有多因……黃芪為必用之君藥”。黃芪，出自《神農(nóng)本草經(jīng)》，從古至今被廣泛應(yīng)用于腦卒中的臨床治療，其具有皂苷、多糖等200多種化學(xué)成分，其中黃芪甲苷為黃芪的質(zhì)控標(biāo)志物。黃芪甲苷是提取自黃芪的純化小分子皂苷，藥理學(xué)研究證實(shí)，黃芪甲苷具有調(diào)節(jié)能量代謝、抗炎、抑制氧化應(yīng)激和控制細(xì)胞凋亡等作用，是具有良好應(yīng)用前景的神經(jīng)保護(hù)劑［17-18］。過去幾十年，許多不同臨床前研究在動物模型中證實(shí)了黃芪甲苷對局灶性腦I/R損傷的干預(yù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能夠有效減輕大鼠因腦I/R造成的神經(jīng)功能缺損癥狀，顯著緩解腦組織梗死，改善腦組織神經(jīng)細(xì)胞壞死、丟失情況。本研究進(jìn)一步探求其具體作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能夠顯著降低Caspase-1與TUNEL共表達(dá)細(xì)胞數(shù)，緩解細(xì)胞焦亡；降低大鼠腦組織NLRP3、Cleaved Caspase-1、IL-1β和IL-18等經(jīng)典焦亡通路蛋白表達(dá)。

綜上所述，黃芪甲苷可能通過調(diào)控Caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典焦亡途徑抑制細(xì)胞焦亡，對I/R損傷后腦組織發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用（圖6）。但細(xì)胞焦亡途徑眾多，黃芪甲苷是否可通過其他焦亡途徑發(fā)揮抗腦I/R損傷的作用，仍待進(jìn)一步探索。

圖6 黃芪甲苷緩解腦I/R損傷的作用機(jī)制Fig.6 Mechanisms of astragaloside Ⅳ alleviating cerebral I/R injury