尹星 邢艷麗 常歡 周陽 付民 尹先哲 （南陽市第二人民醫(yī)院腫瘤科一病區(qū)，南陽 473000）

食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和致死率逐年升高，我國食管癌發(fā)病率已躍居所有腫瘤第三位，病死率位居第四［1-2］。根據病理特征，食管癌可分為食管腺癌和食管鱗狀細胞癌，食管鱗狀細胞癌主要發(fā)病于中國等亞洲國家，目前食管癌治療主要包括外科手術、放療和化療等傳統(tǒng)治療方式，雖然治療效果逐漸提高，但總體預后較差，復發(fā)和轉移嚴重［3-4］。因此，探究食管癌的發(fā)病機制對其治療和藥物設計至關重要。缺氧是實體腫瘤微環(huán)境的主要特征，缺氧環(huán)境可誘導腫瘤生長和轉移［5］。腫瘤外泌體是一類由腫瘤分泌的納米級囊泡，可調控腫瘤生長、血管新生、免疫逃逸等，而缺氧條件下腫瘤細胞分泌的外泌體亦可通過多種途徑影響腫瘤發(fā)生發(fā)展［6］，如缺氧誘導的腫瘤外泌體調控PTEN/PI3Kγ誘導M2型巨噬細胞極化進而促進胰腺癌生長和轉移，而缺氧誘導的卵巢癌外泌體可通過調控STAT3/Rab促進卵巢癌化療耐藥［7-8］。已有研究表明，缺氧誘導的神經膠質瘤外泌體可通過增強自噬促進腫瘤相關巨噬細胞形成［9］。本研究探討了低氧條件下食管癌細胞分泌的外泌體對巨噬細胞分化和自噬的影響，旨在為臨床研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 食管癌細胞Eca-109、食管上皮細胞HEEC、人外周血單核細胞THP-1均購自中國科學院上海細胞庫；佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA，美國Sigma公司）；PKH-26染料（美國SIGMA-ALDRICH公司）；IL-1β、IL-12、TNF-α、Arg1、IL-10、TGF-β ELISA檢測試劑盒（天津安諾瑞康生物技術有限公司）；Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）；Fast Quant RT Kit和Real Universal Color PreMix（美國TIANGEN公司）；CD9、CD63、CD81、CD14、CD206抗體（Cell Signaling Technology公司）；p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、PI3K、Akt、mTOR、GAPDH、山羊抗兔IgG、CD14、CD206抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 食管癌細胞Eca-109和食管上皮細胞HEEC均培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，人外周血單核細胞THP-1培養(yǎng)于含12%FBS+1%青霉素-鏈霉素+50 μmol/L β-巰基乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)于含5%CO2、37 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱，低氧誘導的Eca-109細胞培養(yǎng)于含0.2%O2、5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱，細胞密度達80%～90%時傳代，隔天更換培養(yǎng)基。

1.2.2 外泌體提取、鑒定與攝取 將各組Eca-109和HEEC細胞培養(yǎng)基更換為含10%無外泌體胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后收集細胞培養(yǎng)液，超速離心法提取細胞培養(yǎng)液中的外泌體：細胞培養(yǎng)液2 000 g離心10 min，收集上清，1 000 g離心30 min去除死細胞和細胞碎片，100 000 g超高速離心70 min，所得沉淀用無菌PBS溶液重懸后再次100 000 g超高速離心70 min，所得沉淀即為外泌體，400 μl PBS重懸外泌體，-80 ℃保存。HEEC細胞、Eca-109細胞、低氧條件下Eca-109細胞分泌的外泌體分別記為HEEC-exo、Nom-Eca-109-exo、Hypo-Eca-109-exo。透射電鏡下觀察外泌體的形態(tài)結構，Western blot檢測外泌體標志蛋白CD9、CD63、CD81表達。巨噬細胞攝取外泌體檢測：用PKH-26染料試劑盒將外泌體標記為紅色熒光，將1×104個M0型巨噬細胞接種至激光共聚焦培養(yǎng)皿，DAPI染料標記M0型巨噬細胞的細胞核，將帶有紅色熒光的外泌體10 μg/ml與M0型巨噬細胞共孵育2 h，取出培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，無水甲醛固定30 min，清洗后于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 巨噬細胞誘導分化與共孵育 50 ng/ml PMA誘導1×106個THP-1細胞48 h分化為M0型巨噬細胞。THP-1細胞為懸浮細胞，M0型巨噬細胞為貼壁細胞，細胞貼壁即為誘導成功。共孵育：將誘導分化的M0型巨噬細胞分別加入Nom-Eca-109-exo、Hypo-Eca-109-exo、HEEC-exo及等體積PBS，各組共孵育體系中外泌體濃度均為10 μg/ml，共孵育48 h后收集細胞進行后續(xù)研究。

1.2.4 流式細胞術 收集與各組外泌體共孵育的M0型巨噬細胞，每組5×105個，每組細胞用預冷PBS洗滌1次，用100 μl含10%FBS的無菌PBS溶液重懸，各組細胞加入1 μg FITC-CD14抗體和1 μg PECD206抗體，設置單獨加入FITC-CD14抗體和PECD206抗體的組別調補償，空白管調電壓，將細胞與抗體4 ℃避光孵育30 min，收集細胞用300 μl PBS重懸，流式細胞儀檢測各組細胞CD14和CD206表達。

1.2.5 ELISA檢測細胞因子 采用ELISA試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液炎癥因子IL-1β、IL-12、TNF-α、Arg1、IL-10和TGF-β水平：96孔板內包被一抗，加入40 μl待測樣品和10 μl生物素標記抗體，室溫靜置30 min后加入100 μl辣根過氧化物酶標記抗體，37 ℃孵育75 min，清洗3次，加入顯色液顯色，450 nm處測吸光度，根據標準曲線計算各細胞因子含量。

1.2.6 qRT-PCR 使用Trizol試劑盒提取各組細胞RNA，核酸定量儀定量，Fast Quant RT Kit試劑盒合成mRNA的cDNA，Real Universal Color PreMix試劑盒進行qRT-PCR，2-ΔΔCt計算相對表達量，引物序列見表1。

表1 各組基因引物序列Tab.1 Primer sequences of genes in each group

1.2.7 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 Transwell小室中每孔接種50 μl Matrigel膠檢測細胞侵襲，小室中接種無血清RPMI1640重懸的1×104個Eca-109細胞，置于24孔板，接種用含10%FBS RPMI1640重懸的1×104個M0型巨噬細胞，分別加入Nom-exo、Hypo-exo、HEEC-exo及等體積PBS，各組外泌體濃度為10 μg/ml，共培養(yǎng)72 h，清洗各組小室底部，無水甲醛固定30 min，結晶紫染色10 min，清洗晾干后顯微鏡下觀察拍照，比較各組細胞侵襲和遷移數。

1.2.8 Western blot 收集各組與外泌體共孵育的巨噬細胞，RIPA蛋白提取試劑盒提取細胞或外泌體總蛋白，BCA定量，各組蛋白取10 μg進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后5%BSA封閉，清洗，與1∶1 000稀釋的p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、PI3K、Akt、mTOR、GAPDH、CD9、CD61、CD81、LC3-Ⅱ、p62、Beclin 1一抗孵育過夜，與山羊抗兔IgG二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗膜，ECL試劑盒曝光拍照，Image J軟件對曝光結果進行定量。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，GraphPad Prism軟件繪制圖形，所有數據以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 外泌體鑒定結果 透射電鏡觀察外泌體形態(tài)結構，結果顯示（圖1A）：HEEC-exo、Nom-Eca-109-exo、Hypo-Eca-109-exo粒徑為30～100 nm，雙層膜結構，形態(tài)呈“杯托”樣，Western blot檢測結果顯示（圖1B），HEEC-exo、Nom-Eca-109-exo、Hypo-Eca-109-exo均表達外泌體標志蛋白CD9、CD63、CD81，說明提取的外泌體符合其生物學特征。

2.2 外泌體攝取結果 紅色PKH-26染料標記外泌體，藍色DAPI染料標記巨噬細胞的細胞核，共孵育后檢測發(fā)現，DAPI染料標記的巨噬細胞的細胞核附近出現紅色熒光，說明外泌體可被巨噬細胞攝取（圖2）。

圖2 外泌體攝取鑒定結果（×20）Fig.2 Identified results of exosomal uptaking （×20）

2.3 低氧誘導的食管癌外泌體促進M2型巨噬細胞分化 qRT-PCR檢測結果（圖3A）顯示，與各組外泌體共孵育后，相比于PBS組，HEEC-exo組M1和M2型巨噬細胞標志蛋白表達均無顯著差異（P＞0.05），而Nom-Eca-109-exo和Hypo-Eca-109-exo組M1型標志蛋白CCR7和TLR2表達顯著下調（P＜0.01），M2型巨噬細胞標志蛋白CD206和CD14表達顯著上調（P＜0.001），說明Nom-Eca-109-exo和Hypo-Eca-109-exo可顯著誘導M2型巨噬細胞極化，而Hypo-Eca-109-exo組細胞CD206和CD14表達顯著高于Nom-Eca-109-exo組（P＜0.001），說明低氧條件下Eca-109細胞外泌體能促進M2型巨噬細胞極化。流式細胞術進一步鑒定結果顯示（圖3B），Nom-Eca-109-exo和Hypo-Eca-109-exo組CD206+CD14+細胞比例顯著升高（P＜0.001），且Hypo-Eca-109-exo組CD206+CD14+細胞比例高于Nom-Eca-109-exo組，進一步說明低氧誘導的食管癌外泌體能促進M2型巨噬細胞極化。

圖3 Hypo-Eca-109-exo促進M2型巨噬細胞分化Fig.3 Hypo-Eca-109-exo promotes differentiation of M2 type macrophages

2.4 低氧誘導的食管癌外泌體促進M2型巨噬細胞炎癥因子分泌 ELISA檢測結果（圖4）顯示，相比于PBS組，HEEC-exo組巨噬細胞分泌的炎癥因子無顯著變化（P＞0.05），Nom-Eca-109-exo和Hypo-Eca-109-exo組細胞分泌的IL-1β、IL-12、TNF-α顯著減少（P＜0.05），Arg1、IL-10和TGF-β分泌顯著增加（P＜0.001），Hypo-Eca-109-exo組IL-1β、IL-12、TNF-α分泌顯著少于Nom-Eca-109-exo組（P＜0.05），Arg1、IL-10和TGF-β分泌顯著多于Nom-Eca-109-exo組（P＜0.05），IL-1β、IL-12、TNF-α由M1型巨噬細胞分泌，Arg1、IL-10和TGF-β由M2型巨噬細胞分泌，說明Hypo-Eca-109-exo可促進M2型巨噬細胞分化。

2.5 低氧誘導的食管癌外泌體促進M2型巨噬細胞自噬 Western blot檢測結果（圖5）顯示，與Nom-Eca-109-exo和Hypo-Eca-109-exo共孵育后，巨噬細胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1表達顯著高于PBS組和HEEC-exo組（P＜0.001），p62表達顯著低于PBS組和HEEC-exo組（P＜0.001），且Hypo-Eca-109-exo組細胞LC3-Ⅱ和Beclin-1表達顯著高于Nom-Eca-109-exo組（P＜0.01），p62表達顯著低于Nom-Eca-109-exo組（P＜0.001），LC3-Ⅱ和Beclin-1表達與細胞自噬水平呈正相關，p62表達與細胞自噬呈負相關，說明Hypo-Eca-109-exo可顯著促進M2型巨噬細胞自噬。

圖5 Hypo-Eca-109-exo調控自噬相關基因的蛋白表達Fig.5 Hypo-Eca-109-exo regulates protein expressions of autophagy-related genes

2.6 低氧條件下食管癌外泌體誘導的巨噬細胞可促進食管癌細胞遷移和侵襲 外泌體和M0型巨噬細胞共孵育后檢測發(fā)現（圖6），Nom-Eca-109-exo和Hypo-Eca-109-exo組細胞遷移和侵襲數均顯著高于PBS組和HEEC-exo組（P＜0.05），而Hypo-Eca-109-exo組細胞遷移和侵襲數顯著高于Nom-Eca-109-exo組（P＜0.001），說明Hypo-Eca-109-exo可促進巨噬細胞M2型分化，從而促進食管癌遷移和侵襲。

圖6 Hypo-Eca-109-exo誘導的M2型巨噬細胞極化影響食管癌細胞遷移和侵襲（×10）Fig.6 Hypo-Eca-109-exo-induced polarization of M2 macrophages affects migration and invasion of esophageal cancer cells （×10）

2.7 低氧條件下食管癌外泌體激活PI3K/Akt/mTOR信號通路 Western blot檢測結果（圖7）顯示，與Nom-Eca-109-exo和Hypo-Eca-109-exo共孵育后，巨噬細胞中PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平均顯著高于PBS組和HEEC-exo組（P＜0.01），Hypo-Eca-109-exo組細胞PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平均顯著高于Nom-Eca-109-exo組（P＜0.001），說明Hypo-Eca-109-exo可顯著激活PI3K/Akt/mTOR信號通路。

圖7 Hypo-Eca-109-exo激活巨噬細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路Fig.7 Hypo-Eca-109-exo activates macrophage PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

3 討論

腫瘤微環(huán)境是腫瘤賴以生存和發(fā)展的必要條件，在食管癌腫瘤微環(huán)境中，巨噬細胞、成纖維細胞、內皮細胞等對其生長、代謝和轉移發(fā)揮重要調控作用［10］。其中腫瘤相關巨噬細胞能夠通過PD-1信號通路調控食管癌免疫逃逸，腫瘤浸潤的巨噬細胞與食管癌化療耐藥和患者預后相關［11-12］。缺氧是實體腫瘤微環(huán)境的重要特征，是誘導腫瘤生長和轉移的重要因素，缺氧誘導因子激活可促進腫瘤血管新生、轉移、耐藥等［13］。研究表明低氧可誘導食管鱗狀細胞癌生長和上皮-間質轉化，低氧誘導的miR-10b-3p通過靶向TSGA10促進食管鱗狀細胞癌生長和轉移［14-15］。

外泌體是一類由多種活細胞分泌的納米級囊泡，粒徑為30～100 nm，內含多種母細胞遺傳物質，調控遠端靶組織和靶器官，腫瘤外泌體由腫瘤細胞分泌至腫瘤微環(huán)境作用于免疫細胞、基質細胞及腫瘤干細胞等［16-17］。巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中的重要免疫細胞，可分為M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞，M1型巨噬細胞具有促炎功能，有抗腫瘤活性，M2型巨噬細胞是免疫抑制細胞表型，誘導腫瘤發(fā)生和發(fā)展，腫瘤相關巨噬細胞與M2型巨噬細胞相似，可誘導腫瘤血管新生、促進免疫逃逸等［18］。研究表明腫瘤相關巨噬細胞可富集于缺氧部位［19］。亦有研究表明，缺氧環(huán)境中的腫瘤細胞外泌體對腫瘤發(fā)展有顯著促進作用。本研究分別提取了食管上皮細胞HEEC、食管癌細胞Eca-109及低氧誘導的Eca-109細胞分泌的外泌體，檢測發(fā)現與Hypo-Eca-109-exo共孵育后巨噬細胞CCR7和TLR2表達顯著下調，CD206和CD14表達顯著上調，且細胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-12、TNF-α分泌顯著減少，Arg1、IL-10和TGF-β分泌顯著增加，CCR7和TLR2為M1型巨噬細胞標志蛋白，CD206和CD14為M2型巨噬細胞標志蛋白，IL-1β、IL-12、TNF-α為M1型巨噬細胞分泌的細胞因子，Arg1、IL-10和TGF-β為M2型巨噬細胞分泌的炎癥因子，說明低氧條件下食管癌細胞分泌的外泌體可顯著促進M2型巨噬細胞分化。WANG等［7］研究表明，缺氧條件下胰腺癌外泌體miR-301a可通過激活PTEN/PI3Kγ信號通路誘導M2型巨噬細胞極化，進而誘導腫瘤生長和轉移。推測低氧條件下食管癌細胞分泌的外泌體也可通過調控巨噬細胞極化影響食管癌生物學功能。

自噬是一種依賴溶酶體的自我保護機制，主要通過清除不必要或有害的物質以及不同應激反應中損壞的細胞器維持正常細胞內環(huán)境［20］。LC3-Ⅱ、Beclin-1和p62是參與自噬的重要蛋白，LC3-Ⅱ則由LC3-Ⅰ經泛素樣加工修飾而成，Beclin-1和LC3-Ⅱ表達與自噬小體數量成正比，p62蛋白可使泛素化底物在自噬溶酶體內降解，p62表達與自噬呈負相關［21］。本研究發(fā)現與Hypo-Eca-109-exo共孵育后巨噬細胞LC3-Ⅱ、Beclin-1表達顯著上調，p62表達顯著下調，說明低氧條件下食管癌細胞分泌的外泌體可顯著促進M2型巨噬細胞自噬。將Eca-109細胞與外泌體誘導的巨噬細胞共孵育后發(fā)現，與Hypo-Eca-109-exo共孵育的巨噬細胞可顯著誘導Eca-109細胞遷移和侵襲，說明低氧條件下食管癌細胞分泌的外泌體促進M2型巨噬細胞分化或自噬而誘導腫瘤轉移。CHEN等［22］研究表明，自噬介導的巨噬細胞分化有腫瘤治療潛力，提示食管癌外泌體調控巨噬細胞極化和自噬或可作為腫瘤治療靶點，其臨床應用還需進一步探究。

PI3K/Akt/mTOR信號通路是調控自噬和巨噬細胞分化的重要信號通路，研究表明，結直腸癌分泌的EGF可通過調控PI3K/Akt/mTOR信號通路促進M2型巨噬細胞極化［23］。調控PI3K/Akt/mTOR信號通路亦可調控巨噬細胞自噬［24］。miR-125a可通過調控PI3K/Akt/mTOR信號通路調控巨噬細胞自噬［25］。本研究發(fā)現，與Hypo-Eca-109-exo共孵育的巨噬細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路顯著激活，說明Hypo-Eca-109-exo可通過調控PI3K/Akt/mTOR信號通路促進巨噬細胞M2型極化和自噬。

綜上，低氧條件下，食管癌細胞外泌體可誘導巨噬細胞M2型分化和自噬而促進食管癌遷移和侵襲，其機制可能為激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，為食管癌的發(fā)生發(fā)展機制提供了補充，但食管癌外泌體能否成為其臨床治療和診斷靶點還需進一步探究。