張婷 郭晗 鄭愛華 張愛紅 鄭全輝 （.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北省慢性疾病基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，唐山 060；.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，唐山 060；.唐山市工人醫(yī)院，唐山 06000）

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是長度為20～24個核苷酸的非編碼小RNA，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因中表達(dá)，其中，miR-150主要在機(jī)體免疫系統(tǒng)中表達(dá)。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-150缺失不影響傳統(tǒng)αβT細(xì)胞在胸腺中的產(chǎn)生和發(fā)育，但對自然殺傷性T細(xì)胞（nature killer T cells，NKT）的發(fā)育和功能發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究率先進(jìn)一步探討了miR-150對外周免疫器官和外周血中CD4 T、CD8 T細(xì)胞數(shù)量、活化表型分子和程序性細(xì)胞死亡分子1（programmed cell death 1，PD-1）表達(dá)的影響，進(jìn)而采用小鼠肺移植腫瘤模型，探討miR-150通過調(diào)控T細(xì)胞PD-1表達(dá)對腫瘤發(fā)展的影響。研究結(jié)果將為進(jìn)一步探索以miRNAs為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6背景的miR-150基因敲除（miR-150 knock-out，miR-150KO）小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室（Stock No：007750），以正常野生型（wild-type，WT） C57BL/6小鼠作為對照。小鼠在華北理工大學(xué)SPF級小鼠房內(nèi)飼養(yǎng)、繁殖，實(shí)驗(yàn)選取4～8周齡、性別匹配的小鼠進(jìn)行研究。小鼠實(shí)驗(yàn)操作按照華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理委員會規(guī)定進(jìn)行，動物倫理審查編號：2013-008。提取miR-150KO和WT小鼠尾DNA，根據(jù)Jackson實(shí)驗(yàn)室推薦的PCR擴(kuò)增程序和引物進(jìn)行基因型鑒定（protocol 28985），正向引物：5'-CAAGGACAGGAACCCTTCAGCA-3'；反向引物：5'-CCATGATGCCTGGAAGACATTTC-3'。miR-150KO鼠尾DNA擴(kuò)增產(chǎn)生262 bp片段，WT鼠尾DNA擴(kuò)增產(chǎn)生866 bp片段［1-3］。

1.1.2 細(xì)胞系 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞系（Lewis lung cancer cell line，LLC）于2020年購自華拓生物科技有限公司，在含10%胎牛血清及雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，條件為飽和濕度、37 ℃、5%CO2，2～3 d更換1次培養(yǎng)液。細(xì)胞總數(shù)達(dá)到95%融合時，用0.25%胰酶消化、傳代培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑 胎牛血清購自Life Technologies；雙抗（青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml）購自Gibco公司；高糖DMEM培養(yǎng)液購自HyClone公司；熒光標(biāo)記的抗小鼠CD4、CD8、CD69和PD-1抗體購自美國BD公司；小鼠PD-1封閉抗體anti-mouse CD279（PD-1）購自Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 miR-150KO小鼠的DNA鑒定 取 2～3 mm小鼠鼠尾組織，加入75 μl 鼠尾裂解液，98 ℃裂解1 h。待溫度降至室溫后，加入等體積鼠尾中和液，充分吸打混勻后，1 000 r/min離心3 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，行2%瓊脂糖凝膠電泳（107 V，45 min），采用凝膠成像顯影設(shè)備檢測DNA條帶，判斷小鼠基因型。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)分析 采用miR-150KO和WT小鼠，每組3～5只。分離各組小鼠脾臟、淋巴結(jié)細(xì)胞和外周血白細(xì)胞，采用熒光標(biāo)記的抗小鼠CD4、CD8、CD69和PD-1抗體進(jìn)行細(xì)胞表面染色（4 ℃30 min）。染色后洗滌細(xì)胞，采用Beckman流式細(xì)胞儀收集標(biāo)本，F(xiàn)low Jo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 荷瘤小鼠模型制備 消化、收集LLC細(xì)胞，離心去上清，用無菌PBS洗滌2次，將細(xì)胞懸浮于無菌PBS中，臺盼藍(lán)染色細(xì)胞活力大于95%。選取雌性miR-150KO和WT小鼠，每組3～5只，將1×106個LLC細(xì)胞懸浮于100 μl PBS中，接種到各組小鼠腋窩皮下。每隔1 d通過游標(biāo)卡尺測量腫瘤尺寸，并使用以下公式估計腫瘤體積：腫瘤體積（mm3）=長軸×短軸2×1/2。第21天處死小鼠，收集并分析外周血和淋巴結(jié)T細(xì)胞中PD-1的表達(dá)變化。

1.2.4 抗PD-1抗體治療 分組及制備miR-150KO和WT小鼠腫瘤模型同上，在注射LLC細(xì)胞系5 d后，采用抗PD-1抗體，根據(jù)文獻(xiàn)［4］以250 μg/小鼠（19～21 g）進(jìn)行腹腔注射。每隔1 d通過游標(biāo)卡尺測量各組小鼠腫瘤大小變化，持續(xù)觀察2周。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism v9軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，通過Student'st檢驗(yàn)評估統(tǒng)計顯著性，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-150敲除對T細(xì)胞數(shù)量的影響 PCR鑒定鼠尾DNA，miR-150KO小鼠產(chǎn)生262 bp擴(kuò)增片段，WT小鼠產(chǎn)生866 bp擴(kuò)增片段，小鼠基因型鑒定正確（圖1A）。分離miR-150KO和WT小鼠脾臟、淋巴結(jié)和外周血細(xì)胞，流式分析各組織CD4+T和CD8+T細(xì)胞數(shù)量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與WT小鼠相比，miR-150KO小鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞無明顯變化，CD4+T細(xì)胞比例和數(shù)量顯著升高（P＜0.01或P＜0.05，圖1B、C）；與WT小鼠相比，miR-150KO小鼠淋巴結(jié)中CD8+T細(xì)胞無顯明顯化，但CD4+T細(xì)胞比例和數(shù)量顯著升高（P＜0.01，圖1D、E）；與WT小鼠相比，miR-150KO小鼠外周血中CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.01，圖1F）。

圖1 miR-150KO小鼠T細(xì)胞比例和數(shù)量變化Fig.1 Changes in proportion and number of T cells in miR-150KO mice

2.2 miR-150敲除對T細(xì)胞活化的影響 流式分析miR-150KO和WT小鼠脾臟、淋巴結(jié)和外周血T細(xì)胞活化差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與WT小鼠相比，miR-150KO小鼠脾臟CD4 T和CD8 T細(xì)胞中CD69+細(xì)胞比例無顯著變化（圖2A）；與WT小鼠相比，miR-150KO小鼠淋巴結(jié)CD4 T和CD8 T細(xì)胞中CD69+細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05，圖2B）；與WT小鼠相比，miR-150KO小鼠外周血中CD4 T和CD8 T細(xì)胞CD69+細(xì)胞比例也顯著升高（P＜0.01或P＜0.05，圖2C）。

2.3 miR-150敲除對T細(xì)胞PD-1表達(dá)的影響 流式分析miR-150KO和WT小鼠淋巴結(jié)、外周血CD4 T和CD8 T細(xì)胞中PD-1的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與WT小鼠相比，miR-150KO小鼠淋巴結(jié)CD4 T和CD8 T細(xì)胞中PD-1+細(xì)胞比例無顯著變化（圖3A）；與WT小鼠相比，miR-150KO小鼠外周血CD4 T和CD8 T細(xì)胞中PD-1+細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.01，圖3B）。

圖3 miR-150KO小鼠T細(xì)胞PD-1表達(dá)變化Fig.3 Changes of PD-1 expression in T cells of miR-150 KO mice

2.4 miR-150敲除對小鼠肺腫瘤生長的影響 與WT小鼠相比，miR-150KO小鼠腫瘤生長明顯加快（圖4A、B）；流式分析miR-150KO和WT小鼠淋巴結(jié)和外周血CD4 T和CD8 T細(xì)胞中PD-1表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與WT荷瘤小鼠相比，miR-150KO荷瘤小鼠淋巴結(jié)CD4 T和CD8 T中細(xì)胞PD-1+細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.01，圖4C）；與WT荷瘤小鼠相比，miR-150 KO荷瘤小鼠外周血CD4 T和CD8 T細(xì)胞中PD-1+細(xì)胞比例也顯著升高（P＜0.01，圖4D）。

2.5 抗PD-1抗體處理對miR-150KO和WT小鼠腫瘤生長的影響 采用抗PD-1封閉抗體腹腔注射miR-150KO和WT荷瘤小鼠，觀察其對腫瘤生長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：抗PD-1抗體處理幾乎不影響WT小鼠的腫瘤生長，但對miR-150KO小鼠的腫瘤生長具有明顯抑制作用（P＜0.05，圖5）。

圖5 抗PD-1抗體處理對miR-150KO和WT荷瘤小鼠腫瘤生長的影響Fig.5 Tumor growth in miR-150KO and WT tumor bearing mice after treatment of anti-PD-1 antibody

3 討論

miR-150主要表達(dá)在免疫系統(tǒng)中。課題組的前期研究顯示，miR-150敲除對胸腺傳統(tǒng)T細(xì)胞的產(chǎn)生和發(fā)育無明顯影響，但導(dǎo)致NKT細(xì)胞的發(fā)育和功能異常［5］。本研究進(jìn)一步探討了miR-150對外周免疫器官和外周血中傳統(tǒng)T細(xì)胞數(shù)量和表型的影響。與課題組的既往研究結(jié)果一致，與WT小鼠相比，miR-150敲除小鼠外周血中CD4+T和CD8+T細(xì)胞顯著降低［3］。但本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-150敲除導(dǎo)致小鼠淋巴結(jié)和脾臟中CD4+T細(xì)胞顯著增加。其原因可能與miR-150對NKT細(xì)胞遷移的影響相似，miR-150敲除誘導(dǎo)趨化因子受體7（chemokine receptor 7，CCR7）和CCR9表達(dá)增加，導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞從血液向脾臟和淋巴結(jié)的遷移增加［6-7］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-150敲除可促進(jìn)某些自身免疫病的發(fā)生，提示miR-150敲除可能促進(jìn)T細(xì)胞的異?；罨?，8-10］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-150敲除導(dǎo)致CD4 T和CD8 T細(xì)胞中CD69表達(dá)顯著增加，表明miR-150敲除導(dǎo)致傳統(tǒng)T細(xì)胞活化顯著增強(qiáng)，可能是導(dǎo)致自身免疫病發(fā)生、發(fā)展的主要原因之一。

近年研究發(fā)現(xiàn)，免疫檢查點(diǎn)分子PD-1在T細(xì)胞中的表達(dá)變化影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［11-13］。在此研究中，課題組又深入探討了miR-150敲除對正常和荷瘤小鼠CD4 T和CD8 T細(xì)胞中PD-1的表達(dá)影響，發(fā)現(xiàn)在正常小鼠中，miR-150敲除導(dǎo)致外周血CD4 T和CD8 T細(xì)胞中PD-1表達(dá)顯著增加。在荷瘤小鼠中，miR-150敲除導(dǎo)致淋巴結(jié)和外周血CD4 T和CD8 T細(xì)胞中PD-1表達(dá)也顯著增加。另外，研究發(fā)現(xiàn)miR-150敲除對移植肺腫瘤具有促進(jìn)作用，可見miR-150可通過抑制T細(xì)胞中PD-1表達(dá)，降低對腫瘤的免疫耐受，進(jìn)而抑制其發(fā)生或發(fā)展。已有研究表明，miR-150在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中具有抑癌基因作用［14］。因此，miR-150既可通過腫瘤細(xì)胞本身，也可通過免疫系統(tǒng)抑制肺腫瘤生長，提示其對肺腫瘤治療的潛在臨床應(yīng)用價值。

為進(jìn)一步研究miR-150敲除通過PD-1對肺腫瘤發(fā)展的影響，課題組對miR-150KO和WT荷瘤小鼠腹腔注射抗PD-1封閉抗體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗PD-1抗體處理幾乎不影響WT小鼠腫瘤的生長變化，但對miR-150KO小鼠腫瘤生長具有明顯抑制作用。雖然抗PD-1抗體對血液系統(tǒng)腫瘤具有明顯的抗腫瘤活性，但對實(shí)體瘤的治療效果并不理想［15-16］。一般情況下需與放療或化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，才能產(chǎn)生更顯著的效果［17-19］。另一方面，miR-150敲除導(dǎo)致T細(xì)胞PD-1表達(dá)增加，可能增加了抗PD-1抗體在miR-150KO小鼠中的作用靶點(diǎn)，進(jìn)而增強(qiáng)了其對腫瘤的免疫殺傷效果。目前miR-150在T細(xì)胞中調(diào)控PD-1表達(dá)變化的機(jī)制還不清楚，需要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步闡明。