于海洋 陳欽昊 王子鳴 曹越越 潘躍銀

（1.中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院， 合肥 230000；2.皖南醫(yī)學院，蕪湖 241000）

乳腺癌（breast cancer，BRCA）已成為全世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤，也是導致癌癥患者死亡的主要原因之一［1］。在過去的幾十年里，BRCA患者的生存情況得到了一定程度的改善，然而，BRCA的行為學特征和治療模式繁雜多變，導致部分患者的預后仍不理想［2］。目前認為免疫療法在BRCA治療領域具有光明的前景，免疫系統(tǒng)與參與免疫反應的腫瘤細胞相互調節(jié)，是BRCA腫瘤微環(huán)境的活躍成分［3］。CD1c分子與前列腺癌、肝癌及非小細胞肺癌的免疫治療療效均密切相關［4-6］。然而，CD1c在BRCA中的作用和預后價值尚未完全闡明。本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫的測序數(shù)據(jù)，并采用qRT-PCR和免疫組化（immunohistochemistry，IHC）方法對組織標本進行驗證，探究CD1c分子在BRCA中的潛在作用及價值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 數(shù)據(jù)來源 TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）數(shù)據(jù)庫共1 222例樣本的測序數(shù)據(jù)來自TCGA BRCA項目中l(wèi)evel 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù)，詳細臨床參數(shù)見表1。GEO的數(shù)據(jù)來自GSE1456、GSE11121、GSE93601，部分乳腺正常組織數(shù)據(jù)來自GTEx（http：//commonfund.nih.gov/GTEx/）。使用來自安徽省立醫(yī)院病理科的石蠟包埋標本對CD1c分子進行IHC和qRT-PCR檢測。

1.1.2 主要試劑 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、Termal Cycler DiceTP850（TaKaRa）；IHC試劑盒（Dako，US）。

1.2 方法 IHC試劑盒檢測CD1c蛋白表達水平。兩位病理學專家對染色結果進行評分，對總共18個液體甲醛固定的石蠟包埋BRCA樣本進行IHC染色。新鮮冰凍組織在TRIzol溶液中裂解并提純獲得純化的RNA，并逆轉錄為cDNA。

根據(jù)SYBR Premix Ex Taq Ⅱ和 Termal Cycler DiceTP850試劑盒說明書行qRT-PCR試驗，2-ΔΔCt法進行實驗組和對照組靶基因表達量的測定（每個樣品一式三份進行qRT-PCR），并將檢測到的基因表達標準化為GAPDH的表達。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用R軟件（×64 3.6.3）進行統(tǒng)計分析。采用Mann-WhitneyU檢驗、DESeq2包分析了CD1c表達水平的差異。并用R軟件中的“pROC”包進行ROC分析，用以評價CD1c在BRCA中的診斷價值。采用Kruskal-Wallis Test、Dunn's test和Logistic回歸分析明確CD1c表達與臨床病理特征的關系。使用R軟件中的“clusterProfiler”包進行富集分析［7］。使用“survival”包進行繪制K-M生存分析，“GSVA”“estimate”包用于免疫浸潤分析［8-10］。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD1c的表達水平差異 經(jīng)Toil［11］流程處理后進行泛癌分析，結果表明，CD1c在膀胱尿路上皮癌、結腸癌、頭頸鱗狀細胞癌、腎嫌色細胞癌、肺腺癌、肺鱗癌、直腸腺癌及子宮內(nèi)膜癌中的表達均顯著低于正常組織（P＜0.001，圖1A）。TCGA中BRCA的CD1c表達水平同樣顯著低于乳腺正常組織（P＜0.001，圖1B）。此外，BRCA樣本中的配對數(shù)據(jù)分析同樣表明正常組織中CD1c的表達水平高于BRCA組織（圖1C）。GEO數(shù)據(jù)庫GSE93601數(shù)據(jù)集中的602個BRCA和508個鄰近乳腺正常組織樣本分析結果同樣證實了上述結論（圖1D）。受試者工作特征曲線下面積（AUC）為0.693（95%CI：0.658～0.728），表明CD1c對BRCA的診斷具有一定程度的準確性（圖1E）。

圖1 CD1c在人類癌癥中的表達水平Fig.1 Expression level of CD1c in human cancer

2.2 CD1c與臨床特征的關系 根據(jù)CD1c表達的中位數(shù)值合并臨床資料的患者分為CD1c低表達組和高表達組。表1顯示，T分期、病理分期、年齡、組織學類型、PR狀態(tài)、HER2狀態(tài)和PAM50分型與CD1c分子表達顯著相關。相比于年輕組（年齡≤60）BRCA患者，年老組（年齡＞60）患者的CD1c表達水平更低（P＜0.001，圖2A）。此外，隨著T分期和病理分期逐漸升高，CD1c表達水平總體呈下降趨勢（圖2B、C）。組織學類型、PR狀態(tài)、HER2狀態(tài)和PAM50分型同樣對CD1c的表達具有不可忽略的影響（圖2D～G）。

2.3 CD1c的表達與預后 對TCGA中BRCA患者的生存資料進行統(tǒng)計分析后，CD1c高表達組患者的總生存期（overall survival，OS）優(yōu)于低表達組（P＜0.05，圖3A）。隨后，通過GEPIA網(wǎng)站（圖3B）和Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站（圖3C）得到驗證。此外，通過Kaplan-Meier Plotter對患者的無復發(fā)生存時間（recurrence-free survival，RFS）進行繪制，CD1c高表達組患者RFS顯著長于對照組（P＜0.001，圖3D）。GEO數(shù)據(jù)庫中GSE1456（P=0.003，圖3E）與GSE11121（P=0.001，圖3F）的生存分析表明，低表達CD1c患者的RFS相較于高表達組明顯更短。

圖3 CD1c與患者預后Fig.3 CD1c and prognosis of patients

2.4 IHC和qRT-PCR驗證CD1c表達 部分IHC的代表性結果如圖4A～F所示，以驗證CD1c的表達特征。免疫組化分析結果顯示，CD1c高表達與患者較長的PFS相關（P=0.024，圖4G），與數(shù)據(jù)庫預測結果相一致。此外，qRT-PCR結果顯示，CD1c mRNA在BRCA組織中低表達，而在配對的癌旁組織中表達水平相對較高（P＜0.01，圖4H）。

圖4 IHC（×200）與qRT-PCR驗證CD1c分子Fig.4 Verification of CD1c by IHC （×200） and qRT-PCR

2.5 差異表達基因分析 根據(jù)CD1c在TCGA數(shù)據(jù)庫BRCA樣本中的中位數(shù)表達值，將患者分為低表達組和高表達組。以|logFC|＞1.5和FDR＜0.05的基因為差異基因，火山圖可視化結果見圖5A。選擇前10個上調最明顯的差異基因，Spearman相關性分析計算CD1c與差異基因的相關性（圖5B）。

圖5 差異基因分析Fig.5 Analysis of differentially expressed genes

2.6 通路富集分析 對差異基因進行GO和KEGG分析，圖6A展示了KEGG和GO分析靠前的途徑。GSEA結果表明，CD1c高表達組的免疫調節(jié)相互作用及補體初始觸發(fā)等通路被激活（圖6B～G）。

圖6 通路富集分析Fig.6 Pathway enrichment analysis

2.7 CD1c的免疫浸潤分析 ssGSEA算法對BRCA患者樣本免疫浸潤分析結果如圖7A，Spearman相關分析展示BRCA環(huán)境中CD1c表達水平與免疫細胞的相關性。CD1c與未成熟樹突狀細胞呈正相關（r=0.757，P＜0.001，圖7B），與T細胞也呈正相關（r=0.643，P＜0.001，圖7C）。樹突狀細胞及B細胞均與CD1c分子存在不弱的相關性（圖7D、E）。表明CD1c分子在免疫調節(jié)和應答方面具有不可缺少的作用。Estimate方法對每個樣本進行計算后得出，CD1c高表達組樣本中，免疫浸潤得分、基質得分與估計得分均大于低表達組（圖7F），提示高表達組腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞與基質細胞豐度更高。

圖7 免疫浸潤分析Fig.7 Immune infiltration analysis

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，CD1c基因在BRCA中的表達水平明顯低于配對或不配對的乳腺正常組織，高表達CD1c分子的患者預后明顯優(yōu)于低表達者，提示CD1c基因在BRCA的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。盡管有許多關于CD1c分子在腫瘤發(fā)生中作用的報道，但目前尚未有研究報道此基因在BRCA中的預后價值。本研究發(fā)現(xiàn)CD1c低表達組BRCA患者的OS和RFS較差，提示CD1c可能成為BRCA治療的生物標志物。

在BRCA的治療模式中，免疫治療發(fā)揮的作用日益重要，新的生物標志物的不斷出現(xiàn)為BRCA的治療獲益奠定了基礎［12］。既往研究已經(jīng)證實CD1c在多種癌癥的進展和治療中發(fā)揮重要作用，尤其是在免疫治療方面。DI BLASIO等［13］研究揭示了在非小細胞肺癌中誘導耐受性CD1c+DCs以及導致腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視的免疫抑制性微環(huán)境發(fā)展的新細胞機制。本研究通過免疫浸潤分析發(fā)現(xiàn)了高表達CD1c者的腫瘤微環(huán)境中基質成分與免疫浸潤更高，國外有研究表明腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤水平和基質細胞水平與免疫治療療效密切相關［14］。此外，免疫浸潤分析同樣揭示了iDC細胞、T細胞、DC及B細胞與CD1c的表達呈正相關，DC被認為是癌癥和免疫系統(tǒng)間的關鍵接口之一，并已成為通過離體免疫調節(jié)進行癌癥疫苗接種的有前景的平臺［15］。T細胞與B細胞在多項研究中均被證明與BRCA的免疫治療聯(lián)系緊密［16-18］。

本研究通過多個數(shù)據(jù)庫的多個數(shù)據(jù)集對CD1c在BRCA中的作用進行了初步探討，隨后通過收集臨床標本進行qRT-PCR和IHC驗證。本研究尚存在一些不足之處。首先，本研究收集的BRCA組織樣本量較小；其次，本研究主要關注CD1c在BRCA中的表達及其預后意義，缺乏對具體分子機制的進一步研究，在未來的研究中需要加以完善。