涂艷虹 程波 （江漢大學(xué)附屬醫(yī)院武漢市第六醫(yī)院綜合科，武漢 430015）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）作為一種威脅人類健康的心血管疾病，是老年人最常見(jiàn)的死亡原因之一［1］。其主要病變特點(diǎn)為部分動(dòng)脈脂質(zhì)沉淀，伴有平滑肌細(xì)胞和纖維基質(zhì)增生，逐漸發(fā)展為AS斑塊形成。AS常被認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾?。?］。炎癥在AS病變過(guò)程中起重要作用，是AS發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中生理和病理變化的共同基礎(chǔ)［3］。來(lái)源于平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的泡沫細(xì)胞形成是AS的早期指標(biāo)，也是AS發(fā)展的重要部分［4］。

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是G蛋白偶聯(lián)受體、類固醇受體和酪氨酸激酶的重要信號(hào)通路整合因子［5］。EGFR在許多細(xì)胞過(guò)程中起主要作用，對(duì)活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生和巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放非常重要［6］。最近研究表明，EGFR參與血管病理生理學(xué)，尤其是巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)［7］。EGFR也參與促炎癥、增殖、遷移和重塑過(guò)程，增加細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積，促進(jìn)血管疾病［5］。而EGFR在AS發(fā)病機(jī)制中的作用需進(jìn)一步探討。本研究采用純AS敏感C57BL/6J小鼠和腹腔巨噬細(xì)胞與50 μg/ml ox-LDL培養(yǎng)48 h，建立典型的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型，采用EGFR抑制劑AG1478或EGFR-shRNA處理泡沫細(xì)胞，探討EGFR通路在AS機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清、Collagenase Type Ⅰpowder購(gòu)自Gibco公司；PBS、青-鏈霉素-兩性霉素B溶液（三抗）、油紅O、流式專用Buffer、0.25%胰蛋白酶、ROS檢測(cè)試劑盒、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒、RIPA（強(qiáng)）組織細(xì)胞快速裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）和磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自Bioswamp；多聚賴氨酸購(gòu)自Sigma；SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自KAPA Biosystems；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa；DNaseⅠ購(gòu)自Fermentas；CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司；IMS圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR儀、電泳儀購(gòu)自Bio-Rad；流式細(xì)胞儀購(gòu)自Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細(xì)胞原代分離 清潔級(jí)C57BL/6J小鼠（湖北省疾控中心提供）以頸椎脫臼法處死，全部浸入75%乙醇中5 min，倒立小鼠并向腹腔注射4 ℃預(yù)冷DMEM培養(yǎng)液5 ml，仰臥平放并輕揉小鼠腹部2～3 min，靜置5～7 min，取出腹腔液（倫理批號(hào)：HLK-20210305-001）。進(jìn)行巨噬細(xì)胞純化，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，得到接近純凈的巨噬細(xì)胞。

1.2.2 泡沫模型構(gòu)建 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分為正常組和模型組，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，接種于12孔培養(yǎng)板，1 ml/孔，培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞貼壁后，模型組加入終濃度為50 mg/L的ox-LDL，共同孵育48 h，油紅O染色，顯微鏡下觀察成脂染色效果。

1.2.3 qRT-PCR 取樣本于1 ml Trizol勻漿管提取總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s（40個(gè)循環(huán)），2-ΔΔCt計(jì)算mRNA相對(duì)含量。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 Western blot 提取蛋白BCA試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度。在凝膠中（配制12%分離膠和5%濃縮膠）加入20 μg蛋白（濃縮膠80 V 40 min，分離膠120 V 50 min），恒壓90 V轉(zhuǎn)膜50 min，5%脫脂奶4 ℃封閉過(guò)夜。加入一抗（EGFR 1∶5 000、p-EGFR 1∶2 000、CHOP 1∶250、ATF4 1∶1 000、EIF2α 1∶2 000、p-EIF2α 1∶3 000、Cyt-C 1∶5 000和GAPDH 1∶1 000）室溫孵育1 h。洗膜后加入二抗（Goat anti-Rabbit IgG 1∶10 000）室溫孵育1 h。加入ECL發(fā)光液后置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中顯色。TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值，每組3次重復(fù)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ox-LDL的提取 取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，吹打制成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清。PBS緩沖液洗滌2次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，加入100 μl單細(xì)胞懸液，按抗體名稱標(biāo)記，加入ox-LDL-FITC抗體，4 ℃避光孵育45 min，加入400 μl流式染色緩沖液重懸細(xì)胞，4 ℃避光保存。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CYEXPERT軟件分析。

1.2.6 ROS檢測(cè) 按1∶1 000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA，細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，37 ℃孵育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻，使探針和細(xì)胞充分接觸。無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS，CYEXPERT軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用±s表示。多組間比較使用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 泡沫細(xì)胞模型鑒定 ox-LDL處理細(xì)胞48 h，油紅O染色發(fā)現(xiàn)，脂滴在泡沫細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中明顯積聚（圖1）。說(shuō)明模型建立成功。

2.2 靶位點(diǎn)篩選 qRT-PCR和Western blot檢測(cè)各靶點(diǎn)干擾效率。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，EGFR表達(dá)依次下降（P＜0.01，圖2），其中EGFR sh-RNA3干擾效率最好。因此選擇質(zhì)粒3構(gòu)建EGFR干擾慢病毒進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 EGFR相對(duì)表達(dá)Fig.2 Relative expression of EGFR

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)泡沫細(xì)胞對(duì)ox-LDL的攝取與模型組比較，EGFR抑制劑AG1478或EGFR shRNA3均能夠顯著降低細(xì)胞對(duì)ox-LDL的提?。≒＜0.01，圖3）。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ox-LDL攝取Fig.3 Uptake of ox-LDL by flow-cytometry

2.4 炎癥因子表達(dá) 與模型組比較，EGFR抑制劑AG1478組和EGFR shRNA3組IL-6和TNF-α表達(dá)均顯著降低（P＜0.01，圖4）。

圖4 IL-6和TNF-α表達(dá)Fig.4 Expressions of IL-6 and TNF-α

2.5 細(xì)胞內(nèi)ROS生成 與模型組比較，經(jīng)AG1478和shRNA3處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低（P＜0.01，圖5）。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS生成Fig.5 Flow cytometry detection of ROS production

2.6 Cyt-C釋放 與模型組比較，EGFR抑制劑AG1478和shRNA3均能夠顯著抑制細(xì)胞質(zhì)中Cyt-C表達(dá)（P＜0.01，圖6）。

圖6 Cyt-C釋放Fig.6 Release of Cyt-C

2.7 CHOP、ATF4、p-EIL2α和EIF2α相對(duì)表達(dá) 與泡沫細(xì)胞模型相比，抑制EGFR可顯著降低p-EIF2α、CHOP和ATF4表達(dá)（P＜0.01，圖7）。

圖7 CHOP、ATF4、p-EIF2α、EIF2α表達(dá)Fig.7 CHOP， ATF4， p-EIF2α and EIF2α expressions

3 討論

AS發(fā)展與動(dòng)脈斑塊中慢性炎癥和氧化應(yīng)激密切相關(guān)。AS作為心血管疾病之一，一般認(rèn)為多種炎癥細(xì)胞和炎癥因子在其發(fā)病過(guò)程中起重要作用。其主要特征在于ox-LDL異常、內(nèi)皮細(xì)胞受損和斑塊積聚于血管壁、巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞形成和平滑肌細(xì)胞增殖［8-13］。ox-LDL是AS發(fā)展過(guò)程中的主要致病因子，能夠誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生和AS進(jìn)展相關(guān)炎癥因子釋放［11，14-15］。

EGFR家族及其配體充當(dāng)調(diào)節(jié)多個(gè)細(xì)胞過(guò)程的總機(jī)，在正常心臟發(fā)育中至關(guān)重要，其激活與AS、新生內(nèi)膜增生和心臟重塑有關(guān)［16］。EGFR經(jīng)常在許多類型人類惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)［17］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)成功建立泡沫細(xì)胞模型，研究EGFR與AS的關(guān)系，EGFR抑制劑AG1478或EGFR shRNA均能抑制EGFR表達(dá)，且抑制EGFR表達(dá)能夠顯著降低泡沫細(xì)胞對(duì)ox-LDL的提取。ox-LDL在AS過(guò)程中具有重要功能，誘導(dǎo)ROS過(guò)量產(chǎn)生、黏附分子釋放和內(nèi)皮細(xì)胞損傷途徑，并與炎癥密切相關(guān)［15，18］。內(nèi)皮細(xì)胞損傷和內(nèi)皮功能障礙被認(rèn)為是AS過(guò)程的第一步［19］。氧化應(yīng)激在心血管疾病進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，尤其是ROS非常普遍地伴隨AS典型癥狀發(fā)展［20］。過(guò)量ROS產(chǎn)生會(huì)直接破壞細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA［21］。研究證明，氧化應(yīng)激通過(guò)增強(qiáng)炎癥促進(jìn)動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)重塑［22］。證明ROS參與AS發(fā)展，并表明EGFR參與ROS產(chǎn)生。已有報(bào)道證明ROS生成與EGFR-PI3K-AKT/ERK信號(hào)通路相關(guān)［23-24］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)EGFR抑制劑AG1478或EGFR shRNA降低了ROS產(chǎn)生。

炎癥已被證明在AS斑塊發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。早期AS的原因?yàn)閮?nèi)皮損傷、脂質(zhì)代謝異常和血流動(dòng)力學(xué)損傷。IL-6是一種多效細(xì)胞因子，涉及固有和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，用于調(diào)節(jié)急性期反應(yīng)和慢性炎癥［25］。冠心病患者血液中發(fā)現(xiàn)IL-6水平顯著高于健康者，且病情越嚴(yán)重，體內(nèi)炎癥指數(shù)越高［26］。斑塊破裂情況下，IL-6顯著增加，IL-6可能是預(yù)測(cè)AS斑塊易損性的潛在標(biāo)志物［27］。TNF-α作為一種促炎細(xì)胞因子，在AS相關(guān)炎癥中起重要作用，抑制TNF-α產(chǎn)生可能對(duì)AS抗炎治療具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)中，抑制EGFR能夠顯著降低泡沫細(xì)胞中ROS生成以及炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)。

研究表明，ROS誘導(dǎo)線粒體膜滲透變化，促進(jìn)Cyt-C釋放［28］。本研究中，抑制EGFR表達(dá)能夠顯著降低泡沫細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中Cyt-C表達(dá)。病理?xiàng)l件（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損）導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成，并在AS發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［29］。本實(shí)驗(yàn)中抑制EGFR可顯著降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑相關(guān)p-EIF2α、CHOP和ATF4蛋白表達(dá)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)采用泡沫細(xì)胞模型，通過(guò)加入EGFR抑制劑，發(fā)現(xiàn)能夠降低炎癥因子、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而減輕AS，為AS臨床治療提供了新思路。