孟凌云 段冉 陳靜 （.泰安市中心醫(yī)院，泰安 7000；.泰安市婦幼保健院，泰安 7000；.山東第一醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 507）

在眾多神經(jīng)系統(tǒng)疾病當(dāng)中，阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）的發(fā)病率最高，在疾病早期會出現(xiàn)記憶和認(rèn)知障礙，晚期更是會導(dǎo)致自理能力的喪失，被稱為“不死的癌癥”，給社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)［1］。其主要病理特征為β淀粉樣蛋白（amyloid β，Aβ）的沉積以及細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)［2-4］。目前很多研究提示，神經(jīng)炎癥機(jī)制在AD的發(fā)生以及發(fā)展過程中起到重要作用［5］。LAG3淋巴細(xì)胞活化蛋白3屬于Ig超家族，包含4個細(xì)胞外Ig樣結(jié)構(gòu)域，8個外顯子，并且LAG3與CD4有密切關(guān)系，LAG3是與癌癥、傳染病和自身免疫相關(guān)的重要免疫檢查點(diǎn)。LAG3可以通過內(nèi)吞作用和蛋白水解切割在轉(zhuǎn)錄和翻譯后進(jìn)行調(diào)節(jié)，并且LAG3與其配體存在相互作用［6］。通過生物信息學(xué)方法分析LAG3可能在AD中發(fā)揮的作用，對于AD的機(jī)制研究具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載 原始微陣列數(shù)據(jù)集從GEO數(shù)據(jù)庫下載。GSE48350基于GPL570平臺（HG-U133_Plus_2），由AD患者和健康人的死后大腦樣本組成，海馬區(qū)與AD具有密切聯(lián)系，因此共計62例來自海馬體的樣本被用于進(jìn)一步分析，其中19例為AD患者，43例為正常對照者。另一個數(shù)據(jù)集GSE140829包含204例AD患者血樣和249例健康人的樣本，檢測基于HumanHT-12 v4 Expression BeadChip平臺。正常對照組被命名為CTL，數(shù)據(jù)處理采用R軟件包（version 4.0.3）［7］。利用R包Affy讀取原始數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行魯棒多芯片平均（RMA）算法歸一化樣本，確保每個樣本具有可比性［8-9］。探針I(yè)D被轉(zhuǎn)移到基因上根據(jù)平臺標(biāo)注命名。當(dāng)一個基因?qū)?yīng)于多個探針時，取各個探針I(yè)D的表達(dá)量中位數(shù)代表重復(fù)基因的表達(dá)。

1.2 免疫評分分析 將基因表達(dá)數(shù)據(jù)集使用標(biāo)準(zhǔn)的注釋文件和數(shù)據(jù)上傳到CIBERSORT網(wǎng)站（https：//cibersort.stanford.edu/），CIBERSORT是一種基于基因表達(dá)的反卷積算法［10］，對每個樣本以CIBERSORT值P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選，將過濾后的免疫細(xì)胞表達(dá)矩陣與GEO的信息矩陣融合，并對AD的免疫細(xì)胞進(jìn)行評價。

1.3 GSEA分析 對于基因集功能富集分析［11］，課題組從GSEA中獲得（http：//software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp），根據(jù)LAG3表達(dá)水平，將樣本分為高表達(dá)組（≥50%）和低表達(dá)組（＜50%），獲得分子簽名數(shù)據(jù)庫Kegg.V7.4。根據(jù)基因表達(dá)譜和表型分組，最小基因集設(shè)置為5，最大基因集設(shè)置為5 000，重復(fù)采樣1 000次，P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.25被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和KEGG/GO分析 PPI網(wǎng)絡(luò)由蛋白通過彼此之間的相互作用構(gòu)成，參與生物信號傳遞、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、能量和物質(zhì)代謝及細(xì)胞周期調(diào)控等生命過程的各個環(huán)節(jié)。網(wǎng)站最新版本為2019年1月19日發(fā)布的String 11.0［12-13］。對于基因集功能富集分析，課題組使用KEGG rest API（https：//www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html）獲取了最新的KEGG Pathway的基因注釋，以此作為背景，將基因映射到背景集合中，使用R軟件包c(diǎn)lusterProfiler（version 3.14.3）進(jìn)行富集分析，以獲得基因集富集的結(jié)果。設(shè)定最小基因集為5，最大基因集為5 000，P＜0.05和FDR＜0.25被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對于基因集功能富集分析，課題組使用R軟件包org.Hs.eg.db（version 3.1.0）中的基因GO注釋，以此作為背景，將基因映射到背景集合中，使用R軟件包c(diǎn)lusterProfiler（version 3.14.3）進(jìn)行富集分析，以獲得基因集富集的結(jié)果。設(shè)定最小基因集為5，最大基因集為5 000，P＜0.05和FDR＜0.25被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 AD細(xì)胞模型構(gòu)建 Aβ1-42寡聚物制備淀粉樣β-蛋白（1-42）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，并根據(jù)參考文獻(xiàn)［14］中的方法制備。簡言之，將Aβ1-42懸浮在六氟異丙醇（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）中達(dá)到1 mmol/L，并在-80 ℃下作為干燥膜儲存。將溶液放置在生物安全柜中以供HFIP揮發(fā)以形成肽膜，其重新懸浮在二甲基亞砜（DMSO）（Sigma-Aldrich）中，然后超聲處理，在水浴中浸泡10 min。使用含有0.05%十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液（PBS）重新懸浮肽，然后在4 ℃下聚合2周，使用前用冷PBS進(jìn)一步稀釋至11.1 nmol/L。通過電子顯微鏡驗(yàn)證Aβ1-42的低聚物形式。在處理細(xì)胞之前，寡聚物溶液在4 ℃下13 000 r/min離心10 min。10 μmol/L為人源Aβ1-42濃度誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞系24 h，作為AD的細(xì)胞模型。

1.6 LAG3水平檢測 Real-time PCR檢測細(xì)胞中mRNA水平，使用Trizol試劑提取HT22細(xì)胞中的總RNA后，進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。反應(yīng)體積為25 μl，反應(yīng)體系含 SYBR Green Mix 12.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA模板2 μl，ddH2O 9.5 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)加熱10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，40個循環(huán)后，在60 ℃保持1 min，使產(chǎn)物延伸完整。數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件ABI Prism 7300 SDS Software分析各樣本的Ct值，得出LAG3的mRNA水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 使用R語言4.0.3版本，應(yīng)用arrayImpute、arraryMissPattern軟件包處理微陣列缺失值，因缺失數(shù)據(jù)很少，采用簡單插補(bǔ)，即用均值來替換變量中的缺失值。使用barplot函數(shù)繪制其22種浸潤免疫細(xì)胞的占比柱狀圖，應(yīng)用pheatmap包分別分析和繪制免疫細(xì)胞表達(dá)熱圖，采用vioplot包繪制小提琴圖，使用corrplot包繪制不同免疫細(xì)胞間的占比相關(guān)圖。采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料采用±s表示。各組計量資料采用單因素方差分析，并用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD組織免疫細(xì)胞占比分析 如圖1所示， 在AD組織中水平最高的10種免疫細(xì)胞類型分別是：M2型巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、激活的樹突狀細(xì)胞、激活的肥大細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞、γδ型T細(xì)胞。正常組織中水平最高的10種免疫細(xì)胞類型分別是：M2型巨噬細(xì)胞、未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞、激活的肥大細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、激活的樹突狀細(xì)胞、γδ型T細(xì)胞、激活的NK細(xì)胞。

圖1 GSE48350的免疫評分分析Fig.1 Immune score analysis of GSE48350

2.2 免疫細(xì)胞在AD組和正常對照組的比例差異與正常組織相比，AD組織中未激活的記憶CD4+T細(xì)胞和單核細(xì)胞的比例普遍較高，激活的NK細(xì)胞偏低（圖2）。

圖2 AD患者與健康人免疫細(xì)胞比較Fig.2 Comparison of immune cells between AD patients and normal controls

2.3 AD患者腦組織中和血液中的免疫檢查位點(diǎn)分析 如圖3、圖4所示，在AD患者腦組織中位點(diǎn)CTLA4、HAVCR2、LAG3、SIGLEC5差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），AD患者的SIGLEC5水平低于健康人，其他位點(diǎn)水平均高于健康人。在AD患者的血液中LAG3的水平高于健康人，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 AD患者腦組織中的免疫檢查位點(diǎn)基因表達(dá)Fig.3 Gene expression at immunoassay sites in brain tissues of AD patients

圖4 AD患者血液中的免疫檢查位點(diǎn)基因表達(dá)Fig.4 Immunoassay site gene expression in blood of patients with AD

2.4 細(xì)胞系驗(yàn)證 在人源Aβ1-42誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞系中，LAG3的表達(dá)顯著高于對照組（圖5）。

圖5 HT22細(xì)胞中LAG3的表達(dá)量Fig.5 Expression level of LAG3 in HT22 cells

2.5 基因富集分析 對AD患者腦組織中的LAG3進(jìn)行GSEA分析發(fā)現(xiàn)，視黃醇代謝通路存在顯著差異（圖6）。

圖6 AD患者腦組織LAG3基因的GSEA分析Fig.6 GSEA analysis of LAG3 gene in brain tissue of AD patients

2.6 PPI及KEGG/GO分析 對LAG3進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析（圖7）發(fā)現(xiàn)，LAG3與CD274、TIGIT、CD4、CTLA4、PDCD1、HAVCR2、CLEC4G、LGALS3、SNCA、FGL1存在相互聯(lián)系。然后對所有基因進(jìn)行KEGG和GO分析（圖8）發(fā)現(xiàn)，這些基因主要參與細(xì)胞黏附分子（cellular adhesion molecules，CAMs）、PD-L1表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)通路、癌癥細(xì)胞受體信號通路、原發(fā)性免疫缺陷、自身免疫性甲狀腺疾病、抗原加工和呈遞、Th1和Th2細(xì)胞分化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、造血細(xì)胞系Th17細(xì)胞分化等通路。GO分析發(fā)現(xiàn)這些基因與白細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)、細(xì)胞激活的調(diào)節(jié)、T細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞黏附和信息傳遞、T細(xì)胞活化的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)、淋巴細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞細(xì)胞與細(xì)胞黏附的負(fù)調(diào)控、T細(xì)胞激活等功能有關(guān)。

圖7 LAG3的PPI網(wǎng)絡(luò)分析Fig.7 PPI network analysis of LAG3

圖8 LAG3相關(guān)基因KEGG和GO分析圖Fig.8 KEGG and GO analysis of LAG3-related genes

3 討論

免疫細(xì)胞在AD的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，已知參與AD的免疫細(xì)胞主要有小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞等［15］。通過對AD患者腦組織的測序結(jié)果進(jìn)行免疫細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，AD患者腦組織中未激活的記憶CD4+T細(xì)胞和單核細(xì)胞的比例普遍較高，激活的NK細(xì)胞偏低。CD4+T細(xì)胞包括Th1、Th2、Th17等多種亞型，Th1細(xì)胞導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化和Aβ沉積增加，還可以通過激活巨噬細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞進(jìn)一步加重［16］。還有研究表明，NK細(xì)胞的耗竭可改善AD小鼠模型的認(rèn)知功能［17］。隨后課題組對AD患者的腦組織和血液中與免疫相關(guān)的檢查位點(diǎn)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)LAG3在AD患者中存在差異，同時課題組利用AD細(xì)胞模型對這個結(jié)論進(jìn)行了驗(yàn)證，已知LAG3與CD4細(xì)胞存在聯(lián)系［6］，這就與AD患者CD4細(xì)胞升高相互印證。為了深入分析LAG3的生物學(xué)功能，課題組對其進(jìn)行了GSEA分析和PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并對網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行了KEGG和GO分析，GSEA分析顯示LAG3與視黃醇的代謝通路有關(guān)，視黃醇被運(yùn)送到髓系細(xì)胞轉(zhuǎn)化為視黃酸，關(guān)鍵受體是LRP1，并且該軸對腸道先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)至關(guān)重要［18］。PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)了與其相互作用的10個基因，KEGG分析發(fā)現(xiàn)其主要與CAMs、原發(fā)性免疫缺陷等通路有關(guān)，GO分析發(fā)現(xiàn)其主要與白細(xì)胞和T細(xì)胞活化以及調(diào)節(jié)有關(guān)。這些通路均與免疫反應(yīng)有關(guān)，說明LAG3在免疫功能中可能發(fā)揮重要作用。

總之，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析技術(shù)，基于CIBERSORT等研究方法，分析了AD患者與健康人免疫細(xì)胞的差別，并對免疫檢查位點(diǎn)LAG3進(jìn)行了生物功能預(yù)測。本研究結(jié)果表明，未激活的記憶CD4+T細(xì)胞、單核細(xì)胞以及激活的NK細(xì)胞與AD的發(fā)生存在聯(lián)系，這些免疫特征可能是影響AD治療效果的主要因素，也是未來評估AD的新的參考指標(biāo)。