潘穎 楊凱 陳謹(jǐn) 孫蓓蓓 田平平 張發(fā)蘇 （.安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，合肥 3060；.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 3060）

Ⅰ型干擾素主要包括IFN-α和IFN-β，在病毒感染期間，宿主對病毒入侵的初始反應(yīng)是誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生并與其受體（interferon-α/β receptor，IFNAR）結(jié)合，激活酪氨酸蛋白激酶和信號(hào)轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）信號(hào)通路，合成多種抗病毒蛋白，如：核糖核酸依賴性蛋白激酶（protein kinase RNA dependent，PKR）、2'-5'寡聚腺苷酸合成酶（2'-5'oligoadenylate synthetase，OAS）、黏病毒抗性蛋白A（myxovirus resistance protein A，MxA），直接抑制病毒復(fù)制［1-2］。除了直接的抗病毒作用外，IFN-α還可以強(qiáng)烈調(diào)節(jié)宿主的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)［3-4］，如：增強(qiáng)NK細(xì)胞的增殖、CD8+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性以及IFN-γ分泌等，以增強(qiáng)宿主對病原體的清除能力，因此，Ⅰ型干擾素信號(hào)通路激活是宿主早期重要的自然防御機(jī)制，在抑制病毒入侵方面發(fā)揮重要作用。然而，WIELAND等［5］對實(shí)驗(yàn)室感染HBV的黑猩猩進(jìn)行體內(nèi)研究表明，HBV不能誘導(dǎo)干擾素刺激基因（interferon-stimulated gene，ISG）的表達(dá)，所以可以在肝臟中持續(xù)復(fù)制；SUSLOV等［6］通肝臟活檢發(fā)現(xiàn)，HBV感染患者肝組織中IFN和ISG的表達(dá)被抑制，使得病毒不能被有效清除；本課題組亦在前期研究中發(fā)現(xiàn)，由HBV編碼的HBx蛋白可以抑制外源性Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)抗病毒蛋白MxA的合成［7］。據(jù)此，本課題組推測HBV很有可能通過損傷Ⅰ型干擾素信號(hào)通路，影響機(jī)體的先天免疫應(yīng)答，從而引起病毒感染的慢性化。為此，本課題組擬研究HBV對肝細(xì)胞中Ⅰ型干擾素表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討可能存在的機(jī)制，為揭示HBV慢性感染與宿主免疫功能紊亂的關(guān)系提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞由安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校生化實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM和胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine 3000TM轉(zhuǎn)染試劑盒、ECL超敏發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司；TRIzol購自美國Life technogies公司；氯仿、異丙醇及乙醇均為分析純；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司；熒光染料購自中國Novoprotein公司；BCA試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒均購自碧云天試劑公司；mock-siRNA、HBxsiRNA及引物由上海生工生物合成；HBx、p-IRF3及GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司；pEGFP-N1和pEGFP-HBx質(zhì)粒由南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院劉巧玉博士惠贈(zèng)；熒光顯微鏡購自德國Leica公司；熒光定量PCR儀購自美國Thermo Scientific公司；電泳儀、電泳槽購自上海天能科技有限公司；自動(dòng)曝光儀購自培清科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞以2×105個(gè)/ml密度接種于6孔板用于轉(zhuǎn)染，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)候，改用無胎牛血清DMEM培養(yǎng)，以Lipofectamine 3000TM轉(zhuǎn)染試劑將mock-siRNA和HBxsiRNA轉(zhuǎn)染至HepG2.2.15細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞沉淀檢測HBx蛋白表達(dá)水平；將帶綠色熒光蛋白的pEGFP-N1和pEGFP-HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察HBx蛋白的表達(dá)。

1.2.2 熒光定量PCR檢測Ⅰ型干擾素IFN-α和IFN-β mRNA含量 收集轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞沉淀，加入1 ml TRIzol完全裂解，再加入0.2 ml氯仿振蕩離心取上清，加入0.5 ml預(yù)冷的異丙醇，-20 ℃孵育30 min后離心去上清，最后加入1 ml預(yù)冷的75%乙醇，12 000 r/min離心去上清，室溫干燥RNA沉淀，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為熒光定量的模板，運(yùn)用SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR儀設(shè)置擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，72 ℃20 s。目的mRNA相對表達(dá)量的計(jì)算方法為2-ΔΔCt。所用引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 Western blot檢測HBx及p-IRF3蛋白含量使用RIPA細(xì)胞裂解液細(xì)胞，并以12 000 r/min離心10 min收集上清液，即含有細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。在收集的蛋白樣品中按照1∶4加入蛋白上樣緩沖液，經(jīng)沸水浴加熱10 min以充分變性蛋白質(zhì)，待樣品冷卻至室溫后，上樣至加樣孔內(nèi)行SDSPAGE蛋白電泳1.5 h、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h。采用ECL超敏發(fā)光試劑檢測目的蛋白。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用MedCalc10.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV對肝細(xì)胞中Ⅰ型干擾素表達(dá)的影響 熒光定量PCR分析顯示，與HepG2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染HBV全基因組的HepG2.2.15細(xì)胞中IFN-α和IFN-β的mRNA水平升高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1），提示HBV在體外細(xì)胞中并未充分誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的表達(dá)。

圖1 Ⅰ型干擾素在HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of typeⅠinterferon in HepG2 and HepG2.2.15 cells

2.2 HBx-siRNA上調(diào)細(xì)胞中IFN-α和IFN-β mRNA含量 將mock-siRNA和HBx-siRNA分別轉(zhuǎn)染至HepG2.2.15細(xì)胞，結(jié)果顯示，與未經(jīng)處理的HepG2.2.15細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染HBx-siRNA的細(xì)胞中HBx蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01，圖2A），而IFN-α和IFN-β mRNA含量顯著升高（P＜0.01或P＜0.001，圖2B），提示HBV可通過HBx抑制Ⅰ型干擾素信號(hào)通路激活。

圖2 HBx-siRNA對HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)IFN-α和IFN-β表達(dá)的影響Fig.2 Effects of HBx-siRNA on expressions of IFN-α and IFN-β in HepG2.2.15 cells

2.3 pEGFP-HBx通過抑制IRF3的磷酸化影響Ⅰ型干擾素信號(hào)通路 將HepG2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒pEGFP-N1和pEGFP-HBx，48 h后運(yùn)用熒光顯微鏡觀察HBx蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)（圖3A）。進(jìn)一步分析各轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Ⅰ型干擾素mRNA及p-IRF3蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與空載體轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-HBx質(zhì)粒的細(xì)胞中p-IRF3蛋白含量降低，IFN-α和IFN-β mRNA水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖3B、C）。

圖3 HBx蛋白影響HepG2細(xì)胞p-IRF3和Ⅰ型干擾素表達(dá)Fig.3 HBx protein affects expressions of p-IRF3 and typeⅠ interferon in HepG2 cells

3 討論

HBV是一種非細(xì)胞病變的嗜肝DNA病毒，可編碼多種病毒蛋白，如：DNA多聚酶、表面抗原（HBsAg）、核心抗原（HBcAg）和HBx蛋白［8-9］。肝臟急性感染HBV后，90%～95%的患者能夠清除感染并完全康復(fù)，其余5%～10%的患者發(fā)展為慢性HBV感染，并且部分逐步發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌［10］。WHO估計(jì)全世界約有2.57億人呈慢性HBV感染，每年有近100萬人死于HBV相關(guān)并發(fā)癥［11］。一般認(rèn)為，HBV感染的結(jié)局取決于病毒與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，研究表明，HBV會(huì)抑制宿主的免疫系統(tǒng)，表現(xiàn)為先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞功能障礙，而Ⅰ型干擾素在體內(nèi)具有調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)和激活后天免疫反應(yīng)的作用［12-13］。此外，盡管常規(guī)和聚乙二醇化的IFN-α蛋白已成為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者的一線治療藥物，且Ⅰ型干擾素的抗病毒作用已明確，但在CHB患者中IFN-α治療的病毒清除率相當(dāng)?shù)?，具體機(jī)制尚未明確［14-15］，因此推測HBV可能影響了Ⅰ型干擾素信號(hào)通路。為此，本實(shí)驗(yàn)通過對比HepG2細(xì)胞和轉(zhuǎn)染HBV全基因組的HepG2.2.15細(xì)胞中IFN-α和IFN-β的基因表達(dá)量，證實(shí)HBV并不能充分誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型干擾素，進(jìn)一步將HBx-siRNA轉(zhuǎn)染至HepG2.2.15細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，抑制肝細(xì)胞在病毒轉(zhuǎn)錄中維持共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）微型染色體的重要調(diào)節(jié)蛋白—HBx蛋白的表達(dá)，可上調(diào)IFN-α和IFN-β的mRNA水平，提示HBx可能抑制了HBV誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型干擾素。

Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生受到干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factors，IRFs）家族的調(diào)控，其中，IRF3是Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的主要調(diào)節(jié)因子，機(jī)體感染病毒后，可通過模式識(shí)別受體對病毒病原體相關(guān)分子模式進(jìn)行識(shí)別，導(dǎo)致下游轉(zhuǎn)錄因子IRF-3的激活和核轉(zhuǎn)位，從而誘導(dǎo)IFN-α和IFN-β的表達(dá)［16-17］。而在HBV持續(xù)感染的肝細(xì)胞中，模式識(shí)別受體及IRF3呈低表達(dá)，LEE等［18］通過將IRF3小分子激活劑處理HBV感染的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)激活I(lǐng)RF3可誘導(dǎo)先天免疫作用，抑制HBV cccDNA的形成。在本研究中，將HBV編碼的HBx基因表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)HBx蛋白的HepG2細(xì)胞中IFN-α和IFN-β mRNA表達(dá)水平均下降，且磷酸化的IRF3蛋白含量亦降低。

綜上所述，本研究通過對培養(yǎng)的肝細(xì)胞模型進(jìn)行HBx基因過表達(dá)和沉默，揭示了HBV通過其所編碼表達(dá)的HBx蛋白抑制IRF3蛋白的活化，從而抑制Ⅰ型干擾素的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探討HBV感染的慢性化機(jī)制以及解決臨床CHB患者Ⅰ型干擾素治療應(yīng)答不佳提供了新的思路。