袁靜 程楊陽(yáng) 李紅梅 周科技

（1.武漢理工大學(xué)醫(yī)院，武漢 430070；2.中國(guó)人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，武漢 430070）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）的傳統(tǒng)特征為高血糖引起的代謝和血流動(dòng)力學(xué)變化［1-2］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，脂質(zhì)代謝紊亂在DN發(fā)展和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用［3-5］。脂肪不僅是最大的儲(chǔ)能器官，也是重要的內(nèi)分泌器官，分泌大量具有生物活性的脂肪因子。脂聯(lián)素又稱脂肪細(xì)胞補(bǔ)體相關(guān)蛋白30（Acrp30），是一種在脂肪組織中大量存在的特異性脂肪因子，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性［6］。脂聯(lián)素因其抗糖尿病和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用引起廣泛關(guān)注，有望成為糖尿病相關(guān)代謝綜合征的新療法。脂聯(lián)素有利于血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，參與血管新生調(diào)控，包括DN血管內(nèi)皮細(xì)胞［7］。氧化應(yīng)激相關(guān)通路或炎癥相關(guān)通路是脂聯(lián)素有效降低糖尿病相關(guān)血管內(nèi)皮損傷的主要途徑［8］。NF-κB、NLRP3炎癥小體是DN的重要炎癥刺激物，直接參與內(nèi)皮細(xì)胞炎癥過(guò)程［9］。本課題組猜測(cè)NF-κB通路可能與脂聯(lián)素作用機(jī)制有關(guān)。本研究旨在探究脂聯(lián)素調(diào)控高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞存活及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及線粒體功能的潛在機(jī)制及其與NF-κB通路的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心；重組人脂聯(lián)素（球狀）購(gòu)自上海高創(chuàng)化學(xué)科技公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Hyclonc 公司；CCK8、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）購(gòu)自上海碧云天；ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翌圣生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒、人IL-4、IL-6、IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液。

1.2.2 細(xì)胞分組 含5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記為NC組；含25 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記為HG組。含1、2、4 μg/ml脂聯(lián)素與25 mmol/L葡萄糖共同培養(yǎng)48 h的內(nèi)皮細(xì)胞依次標(biāo)記為L(zhǎng)組、M組、H組。PBS、LPS聯(lián)合4 μg/ml脂聯(lián)素處理的HUVEC細(xì)胞標(biāo)記為H+PBS組、H+LPS組。

1.2.3 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整密度至0.5×105個(gè)/ml，200 μl/孔接種96孔板，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h。20 μl/孔加入CCK8反應(yīng)液振蕩混勻，避光孵育25 min，終止反應(yīng)，檢測(cè)細(xì)胞吸光度（A490）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞存活率（%）=A490實(shí)驗(yàn)組/A490對(duì)照組×100%。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌5次，500 μl結(jié)合緩沖液重懸。加入Annexin V-FITC工作液5 μl、PI工作液5 μl，室溫避光孵育30 min。300目篩過(guò)濾，流式儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞總凋亡率（%）=早期凋亡率（%）+晚期凋亡率（%）。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞Cleaved caspase-3、NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB和p-I-κBα蛋白表達(dá) 收集待測(cè)細(xì)胞，充分裂解，提取總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，煮沸變性。取變性蛋白上清進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜。0.5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，洗膜3次。加入稀釋后的一抗Cleaved caspase-3、NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB和p-I-κBα（均為1 000倍稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜；洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的二抗（500倍稀釋），37 ℃孵育2 h，洗滌3次。ECL顯色液顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

1.2.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清LDH、GSH-Px、SOD、MDA、IL-4、IL-6、IL-1β濃度 收集細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書操作，3 000 r/min離心5 min，取上清。檢測(cè)樣本中LDH、GSH-Px、SOD、MDA、IL-4、IL-6、IL-1β濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

1.2.7 免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞ROS 收集細(xì)胞，按ROS檢測(cè)試劑盒操作，暗室內(nèi)用1 000倍稀釋的DCFH-DA培養(yǎng)液孵育細(xì)胞1 h，胰酶消化，3 000 r/min離心5 min，PBS清洗。熒光顯微鏡下觀察拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

1.2.8 JC-1染色法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位 收集細(xì)胞，冷卻PBS清洗3次。按線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）說(shuō)明書操作，5倍稀釋的JC-1染色工作液染色，37 ℃孵育20 min，JC-1染色緩沖液洗滌3次，細(xì)胞培養(yǎng)液收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞線粒體膜電位水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

1.2.9 RT-qPCR檢測(cè)NLRP3表達(dá) TRIzol液提取總RNA，使用Primescript RT試劑將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR試劑盒檢測(cè)NLRP3水平。以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt計(jì)算NLRP3相對(duì)表達(dá)。引物由primer premier 5.0和NCBI的primer BLAST設(shè)計(jì)：NLPR3 正向引物：5'-AGTGGATGGGTTTGCTGGGAT-3'，反向引物：5'-TGCGTGTAGCGACTGTTGAGG-3'。β-actin正向引物：5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3'，反向引物：5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示。組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂聯(lián)素對(duì)高糖處理的內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響與NC組相比，HG組內(nèi)皮細(xì)胞48 h、72 h、96 h增殖率均降低（P＜0.05）；與HG組相比，M、H組內(nèi)皮細(xì)胞48 h增殖率均升高，L、M、H組內(nèi)皮細(xì)胞72 h、96 h增殖率均升高（P＜0.05）；與L組相比，M、H組內(nèi)皮細(xì)胞48 h、72 h、96 h增殖率升高（P＜0.05）；與M組相比，H組內(nèi)皮細(xì)胞48 h、72 h、96 h增殖率升高（P＜0.05，圖1）?？梢娭?lián)素以濃度依賴性提升高糖處理的內(nèi)皮細(xì)胞增殖率。

圖1 不同濃度脂聯(lián)素促進(jìn)高糖處理的內(nèi)皮細(xì)胞增殖Fig.1 Different concentrations of adiponectin promotes proliferation of endothelial cells treated with high glucose

2.2 脂聯(lián)素對(duì)高糖處理的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響與NC組相比，HG組內(nèi)皮細(xì)胞Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)、凋亡率均升高（P＜0.05）；與HG組相比，L、M、H組內(nèi)皮細(xì)胞Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)、凋亡率均降低（P＜0.05，圖2），且呈劑量依賴性。

圖2 內(nèi)皮細(xì)胞Cleaved caspase-3表達(dá)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡Fig.2 Expression of Cleaved caspase-3 in endothelial cells and detection of apoptosis by flow cytometry

2.3 脂聯(lián)素對(duì)高糖處理的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與NC組相比，HG組內(nèi)皮細(xì)胞LDH、SOD和MDA濃度均升高，ROS、GSH-Px濃度均降低（P＜0.05）；與HG組相比，L、M、H組內(nèi)皮細(xì)胞LDH、SOD和MDA濃度均降低，ROS、GSH-Px濃度均升高（P＜0.05，圖3），且呈劑量依賴性。

圖3 脂聯(lián)素對(duì)高糖處理的內(nèi)皮細(xì)胞LDH、ROS、GSH-Px、SOD和MDA的影響Fig.3 Effects of adiponectin on LDH， ROS， GSH-Px， SOD and MDA in high glucose treated endothelial cells

2.4 脂聯(lián)素對(duì)高糖處理的內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位的影響 與NC組相比，HG組內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位水平、IL-4、IL-6、IL-1β濃度均升高（P＜0.05）；與HG組相比，L、M、H組內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位水平、IL-4、IL-6、IL-1β濃度均降低（P＜0.05，圖4），且呈濃度依賴性。

圖4 脂聯(lián)素對(duì)高糖處理的內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.4 Effect of adiponectin on mitochondrial membrane potential of high glucose treated endothelial cells

2.5 脂聯(lián)素對(duì)高糖處理的內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB通路的影響 與NC組相比，HG組內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3、ASC、Cleaved caspase-3、p-NF-κB蛋白表達(dá)均升高，p-IκBα蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，圖5）；與HG組相比，L、M、H組內(nèi)皮細(xì)胞上述指標(biāo)均發(fā)生負(fù)調(diào)控，且呈濃度依賴性。

圖5 脂聯(lián)素對(duì)高糖處理的內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3、ASC、Cleaved caspase-3、p-NF-κB和p-I-κBα蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of adiponectin on NLRP3， ASC， Cleaved caspase-3， p-NF-κB and p-I-κBα protein expressions of endothelial cells treated with high glucose

2.6 PBS對(duì)脂聯(lián)素抵抗高糖處理的內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用的調(diào)控 與H+PBS組相比，H+LPS組內(nèi)皮細(xì)胞48 h、72 h、96 h活性顯著降低，LDH、SOD和MDA均升高，ROS、GSH-Px均降低，細(xì)胞凋亡率、線粒體膜電位、IL-4、IL-6、IL-1β含量均升高，Cleaved caspase-3、NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB蛋白表達(dá)均升高，p-I-κBα蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，圖6）。

圖6 PBS對(duì)脂聯(lián)素調(diào)控高糖處理的內(nèi)皮作用的影響Fig.6 Effect of PBS on adiponectin regulation of endothelial cells treated with high glucose

3 討論

人和嚙齒類動(dòng)物代謝過(guò)程中，脂聯(lián)素具有胰島素增敏、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗炎作用，因此脂聯(lián)素替代療法可能成為治療肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化的潛在多功能靶點(diǎn)［10］。KIM等［11］研究報(bào)道，高糖處理的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞（glomerular cell，GEC）、小鼠足細(xì)胞中，脂聯(lián)素提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，激活CaMKKβ、Ser431LKB1磷酸化、Thr172 AMPK/PPARα通路及下游信號(hào)傳導(dǎo)，降低高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和凋亡，改善內(nèi)皮功能障礙，說(shuō)明脂聯(lián)素通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)Ca2+/LKB1-AMPK/PPARα通路改善GEC和足細(xì)胞損傷。本研究在體外建立高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，不同濃度脂聯(lián)素處理后，內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力得到恢復(fù)，凋亡率下調(diào)，LDH、SOD、MDA、IL-4、IL-6、IL-1β分泌受到抑制，ROS、GSH-Px濃度回升，線粒體膜電位水平也得到恢復(fù)，且具有濃度依賴性，充分說(shuō)明脂聯(lián)素在抵抗高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損害中的潛在價(jià)值。杜蕓輝等［12］報(bào)道，脂聯(lián)素在糖尿病血管內(nèi)皮損傷中的保護(hù)作用機(jī)制與APPL1（APPL1基因編碼的銜接蛋白包含PH結(jié)構(gòu)域、PTB結(jié)構(gòu)域以及亮氨酸拉鏈基序）通路、窖蛋白-1信號(hào)通路、cAMP/PKA通路活性相關(guān)。但脂聯(lián)素在內(nèi)皮細(xì)胞抗糖作用機(jī)制與NF-κB通路的關(guān)系有待深入研究。

NF-κB通路參與包括糖尿病在內(nèi)的許多疾病炎癥階段，但該通路與脂聯(lián)素的相互作用尚未清楚［13］。HU等［14］發(fā)現(xiàn)，晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中，NF-κB/NLRP3通路激活，AMPK活性受抑制，紅景天苷能夠激活A(yù)MPK磷酸化，抑制NF-κB p65和NLRP3炎癥小體，減輕內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激，說(shuō)明紅景天苷通過(guò)AMPK/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路改善晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥和氧化應(yīng)激。YI等［15］報(bào)道，NF-κB/NLRP3信號(hào)通路參與高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞炎癥、纖維化和增殖，linc-RNA-Gm4419特異性抑制該通路活性減輕高糖對(duì)系膜細(xì)胞的損傷。孟祥龍等［16］在糖尿病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，NF-κB/NLRP3通路異常活躍，給予生、熟地黃后該通路活性通過(guò)AMPK得到抑制，小鼠器官代謝及抗炎功能均得到改善。說(shuō)明NF-κB/NLRP3通路活性增強(qiáng)參與糖尿病形成、發(fā)生、發(fā)展及治療。本研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中，NF-κB通路關(guān)鍵基因NLRP3、ASC、Cleaved caspase-3、p-NF-κB表達(dá)上升，說(shuō)明該通路活性得到激活，與既往研究結(jié)果一致。進(jìn)一步研究顯示，脂聯(lián)素呈濃度依賴性下調(diào)NLRP3、Caspase-1、p-NF-κB，上調(diào)p-I-κBα，證明脂聯(lián)素抑制高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB通路活性。LPS刺激NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行恢復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，激活NF-κB明顯降低脂聯(lián)素對(duì)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，說(shuō)明NF-κB參與脂聯(lián)素抵抗高糖所致細(xì)胞損傷過(guò)程。

綜上，脂聯(lián)素減輕高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激等損傷作用，維持內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能，潛在機(jī)制與抑制NF-κB通路相關(guān)，為脂聯(lián)素在糖尿病臨床治療中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。本研究結(jié)果僅在體外得到初步驗(yàn)證，下一步將開展動(dòng)物體內(nèi)研究，為脂聯(lián)素用于糖尿病治療提供更有說(shuō)服力的支持。