鐘璐璐 周峰 彭佳欣 譚洋 裴剛

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省普通高等學(xué)校中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410208）

溶質(zhì)載體15A3（solute carrier 15A3，SLC15A3，又稱PhT2）是質(zhì)子偶聯(lián)寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體（proton-coupled oligopeptide transporters，POTs）家族成員，負(fù)責(zé)某些二肽及組氨酸跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)［1］。研究顯示SLC15A3基因參與調(diào)控固有免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，其表達(dá)上調(diào)可能是炎癥進(jìn)展的原因［2］。

炎癥是固有免疫系統(tǒng)對(duì)病原體或損傷的一種反應(yīng)，通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別相關(guān)病原分子啟動(dòng)下游信號(hào)通路，這些受體包括Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）和核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域（nucleotidebinding oligomerization domain，NOD）樣受體（NLRs）［3］。巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，SLC15A3被發(fā)現(xiàn)在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中高表達(dá)［4-5］。LPS與細(xì)胞膜上的TLR4受體特異性結(jié)合，激活NF-κB，上調(diào)SLC15A3表達(dá)，此作用可被NF-κB抑制劑逆轉(zhuǎn)，表明SLC15A3表達(dá)受NF-κB信號(hào)調(diào)控［2］。此外，TLR2、TLR7及TLR9激活也能上調(diào)SLC15A3基因表達(dá)［2］。SLC15A3基因通過(guò)將NOD的2個(gè)配體胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）和胞壁酰三肽（L-Ala-γ-D-Glu-meso-diaminopimelic acid，tri-DAP）轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)受體，觸發(fā)NOD依賴性免疫應(yīng)答［6］。MDP刺激SLC15A3沉默的樹突狀細(xì)胞后，IL-6和IL-1β的產(chǎn)生與野生型細(xì)胞相比顯著減少［7］；相反，過(guò)表達(dá)SLC15A3細(xì)胞受MDP刺激時(shí)，炎癥因子產(chǎn)生增多，細(xì)胞免疫應(yīng)答增強(qiáng)［8］。研究SLC15A3表達(dá)調(diào)控機(jī)制對(duì)進(jìn)一步研究其在炎癥疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用具有重要意義。為了系統(tǒng)分析SLC15A3基因及編碼蛋白的性質(zhì)和功能，本研究利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行預(yù)測(cè)，期望有助于人SLC15A3基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究的開展。

1 資料與方法

1.1 資料 人SLC15A3基因Gene ID：51296，mRNA登錄號(hào)：NM_016582.3。人、大鼠、小鼠、貓和牛SLC15A3蛋白UniProtKB分別為：Q8IY34、Q924V4、Q8BPX9、M3WJ98和F1MYU7。

1.2 方法 在NCBI網(wǎng)站中以“SLC15A3”為關(guān)鍵詞，獲得人SLC15A3基因上游-2 000 bp～-1 bp序列，作為SLC15A3基因可能的啟動(dòng)子序列。使用TSSW和Neural Network Promoter Prediction啟動(dòng)子軟件對(duì)人SLC15A3基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析。將人SLC15A3基因啟動(dòng)子序列輸入JASPAR、PROMO和AliBaba 2.1網(wǎng)站對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用EMBOSS、MethPrimer和CpG finder網(wǎng)站預(yù)測(cè)人SLC15A3基因2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)域甲基化CpG島。使用SNP Function Prediction對(duì)人SLC15A3基因啟動(dòng)子單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。從Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取SLC15A3蛋白基本信息，分別使用ProtParam和ProtScale在線工具分析人SLC15A3蛋白理化性質(zhì)和親疏水性。采用DNAMAN對(duì)不同物種來(lái)源SLC15A3蛋白進(jìn)行同源性分析，并使用MEGA-x構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用SOPMA和SWISS-MODEL在線工具預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白相互作用關(guān)系進(jìn)行分析。所用數(shù)據(jù)庫(kù)及網(wǎng)址見表1。

表1 本研究所用數(shù)據(jù)庫(kù)及網(wǎng)址Tab.1 Databases and websites used in this study

2 結(jié)果

2.1 人基因SLC15A3基本信息 SLC15A3基因在Genebank中的登錄號(hào)為NC_000011.10，位于人11號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)2帶2亞帶（11q12.2），基因全長(zhǎng)15 093 bp（60 937 084～60 952 176 bp），由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成。常表達(dá)于肺、脾、骨髓及腸等組織。

2.2 人基因SLC15A3啟動(dòng)子預(yù)測(cè) TSSW預(yù)測(cè)到該基因有1個(gè)啟動(dòng)子，位于551 bp；Neural Network Promoter Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)未發(fā)現(xiàn)該基因啟動(dòng)子。

2.3 人SLC15A3基因轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點(diǎn)分析 利用JASPSR軟件對(duì)人SLC15A3基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，Relative profile score threshold分別選擇80%、85%、90%、95%及100%時(shí)，獲得正負(fù)鏈轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)數(shù)依次為1 702個(gè)、352個(gè)、165個(gè)、53個(gè)和2個(gè)，Relative profile score threshold為95%時(shí)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)部分預(yù)測(cè)結(jié)果見表2。

表2 JASPAR軟件預(yù)測(cè)人SLC15A3基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)部分結(jié)果Tab.2 Analysis part results of transcription factor binding sites in promoter region of human SLC15A3 gene predicted by JASPAR

使用PROMO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)人SLC15A3基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，共獲得62個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（圖1），涉及YY1、XBP-1、GR-alpha、TFⅡ-Ⅰ、C/EBPbeta、AP-2alphaA和NF-1等。AliBaba 2.1聯(lián)結(jié)TRANSFAC 4.0數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得人SLC15A3基因255個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（圖2），主要包括Oct-1、Sp1、ETF、NF-1和RAR-alpha等，兩種軟件預(yù)測(cè)得到結(jié)合位點(diǎn)位置相同的轉(zhuǎn)錄因子共16個(gè)，包括YY1、C/EBPbeta、NF-1、RXR-alpha、c-Jun、ETF、Sp1、NFκB、PU.1、C/EBPalpha、GR、AP-1、c-Fos、RAR-beta、GATA-1和WT1。

圖1 PROMO 預(yù)測(cè)人SLC15A3基因啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)果Fig.1 Results of transcription factor binding sites in promoter region of human SLC15A3 gene predicted by PROMO

圖2 AliBaba2.1預(yù)測(cè)人SLC15A3基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)部分結(jié)果Fig.2 Part results of transcription factor binding sites in promoter region of human SLC15A3 gene predicted by AliBaba2.1

2.4 人SLC15A3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島及SNP預(yù)測(cè)分析 利用EMBOSS、CpG Finder和MethePrimer分析人SLC15A3基因上游2 000 bp，結(jié)果顯示無(wú)CpG島。運(yùn)用SNP Function Prediction進(jìn)行功能預(yù)測(cè)和種族特異性等位基因頻率查詢，結(jié)果顯示rs11230691、rs11230693、rs11423328、rs11600411、rs11606608、rs17156016、rs17704641、rs34883413、rs35043745、rs35958610、rs7930736和rs896830保守性極低，其中rs17156016、rs17704641和rs896830等位基因具有人種差異，北歐西歐血統(tǒng)美國(guó)猶他州人（CEU）、中國(guó)北京漢族人（CHB）、日本東京人（JPT）和尼日利亞約魯巴人（YRI） 4個(gè)種族中等位基因頻率存在差異，CHB和JPT兩個(gè)種族等位基因頻率基本一致（表3）。進(jìn)一步分析人SLC15A3基因啟動(dòng)子區(qū)等位基因和非同義SNP等信息，結(jié)果見表4。

表3 人SLC15A3基因啟動(dòng)子區(qū)SNP功能信息和種族特異等位基因頻率預(yù)測(cè)Tab.3 Prediction of functional information and race specific allele frequency of SNP in promoter region of human SLC15A3 gene

表4 人SLC15A3基因啟動(dòng)子區(qū) SNP 預(yù)測(cè)Tab.4 SNP prediction of promoter region of human SLC15A3 gene

2.5 人SLC15A3蛋白的理化性質(zhì) SLC15A3蛋白總分子式為C2929H4543N769O767S27，含581個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子量為63 559.50，原子總數(shù)為9 026個(gè)，理論等電點(diǎn)為9.27。581個(gè)氨基酸殘基中堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)為43，酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）總數(shù)為30。不穩(wěn)定系數(shù)為47.70，屬于不穩(wěn)定蛋白。體內(nèi)半衰期30 h，脂肪系數(shù)為106.99，親水值為0.409，表明該蛋白為疏水性蛋白。進(jìn)一步應(yīng)用ProtScale在線親/疏水性軟件獲得 SLC15A3蛋白親/疏水性序列分析圖譜（圖3）。第282位丙氨基酸（A）分值為-2.911；疏水性最強(qiáng)位點(diǎn)是位于第384位的亮氨基酸（L），分值為3.500。581個(gè)氨基酸（5～581）中有365個(gè)（63.37%）分布于score＞0區(qū)，表明SLC15A3蛋白存在大量疏水域，屬于疏水性蛋白。預(yù)測(cè)結(jié)果與理化性質(zhì)中的疏水性結(jié)果一致。

圖3 人SLC15A3蛋白質(zhì)的親（疏）水性分析Fig.3 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of human SLC15A3 protein

2.6 SLC15A3蛋白序列比對(duì)和同源性分析 蛋白序列比對(duì)結(jié)果（圖4）顯示，人、大鼠、小鼠、貓和牛的SLC15A3蛋白氨基酸序列同源性高達(dá)87.91%，說(shuō)明哺乳動(dòng)物中SLC15A3具有高度同源性，蛋白序列保守性較高，推測(cè)其在其他物種中的生理功能可能與在人體中的生理功能相同。基于最低Bayesian Information Criterion分?jǐn)?shù)值、模型更合適的原則，選擇JTT模型，選擇Neighbor Joining 建樹方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）。結(jié)果顯示人、大鼠和小鼠進(jìn)化距離極小，說(shuō)明SLC15A3蛋白在人、大鼠和小鼠中具有高度保守性。

圖5 人SLC15A3蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of human SLC15A3 protein

2.7 SLC15A3蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) SLC15A3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖6所示。α-螺旋（Hh）270個(gè)（46.47%），無(wú)規(guī)卷曲（Cc）227個(gè)（39.07%），延伸鏈（Ee）67個(gè)（11.53%）及β-轉(zhuǎn)角（Tt）17個(gè)（2.93%）。說(shuō)明該蛋白結(jié)構(gòu)主要元件為α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角僅在局部出現(xiàn)。將人SLC15A3氨基酸序列上傳SWISS-MODEL采用同源建模法得到4個(gè)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)信息（圖7）。圖片展示了4種模型蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)和同源蛋白質(zhì)相似性波形圖。4個(gè)模型中A模型GMQE值為0.53，同源性為26.71%，序列相似性為0.34，相似性波形圖預(yù)測(cè)值較高且穩(wěn)定，覆蓋率為0.86，說(shuō)明模型A更可信。使用The Structure Analysis and Verification Server進(jìn)行拉曼圖分析，進(jìn)一步分析結(jié)構(gòu)可信度，拉曼圖中區(qū)域由白到紅，顏色越深表明該區(qū)域二面角越合理。拉曼圖（圖8）中，392個(gè)氨基酸處于拉曼圖的核心容許區(qū)（紅色），占84.5%，57個(gè)氨基酸處于額外容許區(qū)（黃色），占12.3%。容許區(qū)氨基酸數(shù)比例超過(guò)90%，表明該模型A預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)形成的二面角穩(wěn)定可靠。

圖6 人SLC15A3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Secondary structure prediction of human SLC15A3 protein

圖7 人SLC15A3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Tertiary structure prediction of human SLC15A3 protein

圖8 人SLC15A3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)拉曼圖分析Fig.8 Ramachandran plot of tertiary structure of hunan SLC15A3 protein

2.8 人SLC15A3蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)如圖9所示，CD6、TYROBP、CD5、NOD2、SLC37A2、IFI30、CSF1R、PTCHD3、LILRB2、CD14與SLC15A3相互作用，其中CD6得分最高，說(shuō)明其與SLC15A3蛋白相互作用最緊密（表5）。

圖9 人SLC15A3蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.9 Network of proteins interacted with human SLC15A3

表5 與人SLC15A3蛋白相互作用可能性較大的10種蛋白Tab.5 Ten proteins with high possibility of interaction with human SLC15A3

3 討論

POTs家族由SLC15A1～SLC15A5組成，SLC15A3的功能主要是將組氨酸和二肽從溶酶體內(nèi)運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)［9］。研究表明SLC15A3表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用，將其基因沉默會(huì)減少TLR4依賴的IL-6和TNF-α等促炎因子產(chǎn)生；另一方面，將其基因過(guò)表達(dá)會(huì)增加TLR4依賴的炎癥因子產(chǎn)生［2］。此外，葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織和結(jié)腸固有單核免疫細(xì)胞中可見SLC15A3表達(dá)上調(diào)，而SLC15A3上調(diào)導(dǎo)致更多促炎因子產(chǎn)生，引起更強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)展［8］。因此抑制SLC15A3表達(dá)或許能成為治療炎癥性疾病的新思路。

人SLC15A3蛋白是以α-螺旋為主的疏水性不穩(wěn)定蛋白。氨基酸同源性和進(jìn)化樹結(jié)果顯示人SLC15A3蛋白在哺乳動(dòng)物中具有較高進(jìn)化保守性。蛋白互作結(jié)果顯示共10個(gè)蛋白與SLC15A3存在互作關(guān)系，其中NOD2與SLC15A3的關(guān)系已得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SLC15A3基因通過(guò)將NOD2配體MDP轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)受體，觸發(fā)NOD依賴性免疫應(yīng)答，加重炎癥反應(yīng)［6］。

現(xiàn)有文獻(xiàn)表明SLC15A3表達(dá)受NF-κB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控［6］。SLC15A3基因表達(dá)依賴于一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)，其中轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)相互作用是調(diào)控基因表達(dá)的重要一環(huán)［10］。本研究經(jīng)多種預(yù)測(cè)軟件分析發(fā)現(xiàn)NF-κB、c-Jun、AP-1及c-Fos等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在SLC15A3基因啟動(dòng)子序列存在結(jié)合位點(diǎn)。NF-κB是兩種Rel家族蛋白構(gòu)成的異二聚體，可以調(diào)控?cái)?shù)百個(gè)免疫基因表達(dá)而被稱為炎癥反應(yīng)主要調(diào)節(jié)器［11］。NF-κB接受上游信號(hào)傳遞后，能夠磷酸化從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，并通過(guò)結(jié)合靶基因增強(qiáng)子或啟動(dòng)子區(qū)域κB位點(diǎn)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄［12］。NF-κB在巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中起轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，研究表明巨噬細(xì)胞中SLC15A3表達(dá)受NF-κB調(diào)控［4］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路同樣參與SLC15A3表達(dá)上調(diào)［8］。激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）是MAPK信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子［13］。AP-1與NF-κB類似，AP-1接收上游信號(hào)活化后，同樣通過(guò)轉(zhuǎn)錄參與炎癥因子合成，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥發(fā)生［14-15］。AP-1由c-Jun和c-Fos兩個(gè)亞基組成［16］。c-Jun/c-Fos復(fù)合物參與激活多種促炎信號(hào)基因表達(dá)［17］。此外，c-Jun能夠識(shí)別并結(jié)合增強(qiáng)子七聚體基序5'-TGA［CG］TCA-3'，并參與c-Jun氨基末端激（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號(hào)通路，其被磷酸化激活有助于促炎基因表達(dá)［18］。本研究中已有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)參與調(diào)控SLC15A3基因表達(dá)，但還有許多是預(yù)測(cè)的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

目前研究主要關(guān)于SLC15A3在炎癥反應(yīng)過(guò)程中的表達(dá)變化，本研究系統(tǒng)分析了SLC15A3基因特點(diǎn)及其編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和進(jìn)化保守性等，將對(duì)深入研究SLC15A3基因和蛋白在潰瘍性結(jié)腸炎等炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)調(diào)控具有重要意義。