吳曉茜,鐘秋平*,張云竹

1(海南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,海南 ?？?570228)2(海南大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,海南 ?？?570228)

“山蘭稻”是海南省黎族地區(qū)獨有的山地旱稻。山蘭米營養(yǎng)價值極高,相比于普通稻谷,鐵、硒、鋅等微量元素含量較高,是釀造米醋的優(yōu)選原料[1]。米醋是以大米為原料,經(jīng)過糖化、酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵等工藝釀制而成的一種調(diào)味品。食醋不僅是一種酸性調(diào)味品,而且還具有促進消化、軟化血管、消除疲勞、降低血脂和調(diào)節(jié)血壓等功效。風(fēng)味物質(zhì)是反應(yīng)米醋品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,包括揮發(fā)性和非揮發(fā)性成分。其中非揮發(fā)性物質(zhì)包含有機酸和游離氨基酸[2]。米醋中的氨基酸主要來源于原料中的蛋白質(zhì)降解作用,能夠緩沖醋酸帶來的刺激,使醋的口感更加柔和。在醋酸發(fā)酵階段,許多微生物生長繁殖,形成大部分醋的風(fēng)味物質(zhì)[3]。有機酸是食醋中酸味的主要來源,其主要成分是乙酸,具有清爽和刺激的風(fēng)味,而乳酸是食醋含量最多的非揮發(fā)性酸,口感柔和,它們共同協(xié)調(diào)構(gòu)成食醋獨特的風(fēng)味和特點[4]。近年來,越來越多人注重健康和膳食營養(yǎng),許多具備功能性的食醋正在被研究和開發(fā)。如徐融融等[5]利用鐵皮石斛為原料開發(fā)藥食同源植物鐵皮石斛的食醋產(chǎn)品;楊成瑞等[6]利用以云南產(chǎn)馬尾松松針為原料釀造馬尾松松針醋;馬敬[7]利用青稞麩皮替代小麥麩皮釀醋開發(fā)具有良好抗氧化效果的食醋;SU等[8]以兔眼藍(lán)莓為原料制作藍(lán)莓醋等。而采用山蘭米發(fā)酵食醋的研究尚未報道。

在釀制過程中,理化性質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)的變化都會對小米醋的品質(zhì)產(chǎn)生影響。本研究以山蘭黃酒為原料,通過稀釋發(fā)酵環(huán)境酒精度至最適醋酸發(fā)酵酒精度,而后添加醋酸菌進行醋酸發(fā)酵,開發(fā)一種具有保健功能的山蘭米醋產(chǎn)品。同時對醋酸發(fā)酵階段的總酸、pH這兩個理化指標(biāo)進行跟蹤測定,分析其動態(tài)變化;通過高效液相色譜法分析發(fā)酵過程中游離氨基酸和有機酸含量的變化規(guī)律;采用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用(headspace-solid phase micro-extraction - gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)風(fēng)味分析技術(shù)對醋酸發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行跟蹤檢測,揭示山蘭米醋風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律,并篩選出醋酸發(fā)酵過程中的差異性成分,為山蘭米醋產(chǎn)品開發(fā)提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醋的制作:山蘭酒糟、酒液和純凈水等比例混合,置于80 ℃水浴鍋中滅菌15 min,取出冷卻至室溫后,添加原料1%～3%(體積分?jǐn)?shù))的醋酸菌,將其放在30 ℃的搖床進行醋酸菌發(fā)酵,每天測定總酸含量,待3 d的總酸穩(wěn)定,結(jié)束醋酸發(fā)酵。醋醅取4個不同發(fā)酵時間的樣品[第3天(Acid-3 d),第7天(Acid-7 d),第11天(Acid-11 d),第15天(Acid-15 d)],每天同一時間取樣,樣品于0～4 ℃保存。

醋酸桿菌培養(yǎng):配制10 g/L葡萄糖水活化醋酸菌2 d,然后進行醋酸發(fā)酵。

甲醇/乙腈/甲酸、3-硝基苯肼/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(色譜級),安譜;鹽酸(分析純),國藥;衍生試劑,Waters;NaOH(分析純),天津歐博凱化工有限公司;草酸、乳酸、乙酸、酒石酸等有機酸標(biāo)準(zhǔn)品,sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Q Exactive質(zhì)譜儀、Vanquish超高壓液相色譜儀,Thermo;Eppendorf 5430R低溫高速離心機、Tissuelyser-48組織破碎儀,上海凈信科技有限公司;pH計,上海雷磁儀器有限公司;8890氣相色譜、7000D質(zhì)譜、DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),Agilent。

1.3 實驗方法

1.3.1 總酸的測定

參照GB 12456—2021《食品中總酸的測定》的方法,稱取25 g醋醅(精確至0.01 g)至250 mL容量瓶中,用無二氧化碳水定容至刻度,搖勻。用快速濾紙過濾,收集濾液,用于測定。

1.3.2 pH值的測定

用pH計直接測定醋醅浸泡后過濾的濾液。

1.3.3 有機酸的測定

稱取適量樣本(0.1～0.5 g),加入1 mL 提取液[V(甲醇)∶V(氯仿)=7∶3],充分混勻;冰上孵育提取30 min;加入600 μL H2O,混勻;4 ℃下12 000 r/min離心10 min,取上清液,重復(fù)提取1次,4 ℃下12 000 r/min離心10 min,取上清液,稀釋20倍,取40 μL樣品衍生化上機。

液相色譜條件:色譜柱:Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.8 μm);流動相:A相為0.1%甲酸水溶液,B相為0.1%甲酸乙腈溶液;流速0.35 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量2 μL;洗脫梯度:0.0 minV(水)∶V(乙腈)=90∶10;2.0 minV(水)∶V(乙腈)=90∶10;12.0 minV(水)∶V(乙腈)=10∶90;14.0 minV(水)∶V(乙腈)=10∶90;14.1 minV(水)∶V(乙腈)=90∶10;16.0 minV(水)∶V(乙腈)=90∶10。整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進樣器中。

質(zhì)譜條件:采用美國Thermo公司的Q Exactive高分辨質(zhì)譜檢測系統(tǒng)進行的采集。電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI)條件如下:鞘氣40 arb;輔助氣10 arb;離子噴霧電壓-2 800 V;溫度350 ℃;離子傳輸管溫度320 ℃。掃描模式為Fullms-ms2模式;掃描方式為負(fù)離子。一級掃描范圍(m/z)120～1 500。

1.3.4 游離氨基酸的測定

樣品制備和提取:樣品中加入0.6 mL 0.1 mol/L HCl于室溫下攪拌提取1 h,每個樣品通過0.22 μm孔膜過濾器過濾。取10 μL樣品于萃取瓶,加入70 μL硼酸緩沖液和20 μL AccQ·Tag試劑。反應(yīng)混合物在室溫下靜置1 min, 55 ℃加熱10 min,冷卻后注入1 μL上機分析。

液相色譜條件:色譜柱:Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相:A相為超純水(含0.1%甲酸),B相為乙腈(含0.1%甲酸);流速0.5 mL/min;柱溫55 ℃;進樣量1 μL;洗脫梯度:0 minV(水)∶V(乙腈)=95∶5;5.5 minV(水)∶V(乙腈)=90∶10;7.5 minV(水)∶V(乙腈)=75∶25;8 minV(水)∶V(乙腈)=40∶60;8.5 minV(水)∶V(乙腈)=95∶5;13 minV(水)∶V(乙腈)=95∶5。整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進樣器中。

質(zhì)譜條件:采用美國Thermo公司的Q Exactive高分辨質(zhì)譜檢測系統(tǒng)進行的采集。采用ESI,鞘氣40 arb;輔助氣10 arb;離子噴霧電壓+3 000 V;溫度350 ℃;離子傳輸管溫度320 ℃。掃描模式為全掃(Full MS)模式;掃描方式為正離子。一級掃描范圍(m/z)150～700。

1.3.5 風(fēng)味物質(zhì)的測定

樣品提取:從-80 ℃取出樣品,渦旋混合均勻,吸取1 mL樣品置于頂空瓶中,分別加入飽和NaCl溶液,10 μL(50 μg/mL)內(nèi)標(biāo)溶液。在60 ℃恒溫條件下,振蕩5 min,120 μm DVB/CWR/PDMS萃取頭插入樣品頂空瓶,頂空萃取15 min,于250 ℃下解析5 min,然后進行GC-MS分離鑒定。采樣萃取頭在Fiber Conditioning Station中250 ℃下老化5 min。

色譜條件:DB-5MS毛細(xì)管柱,載氣為高純氦氣(純度≥99.999%),恒流流速1.2 mL/min,進樣口溫度250 ℃,不分流進樣,溶劑延遲3.5 min。程序升溫:40 ℃保持3.5 min,以10 ℃/min升至100 ℃,再以7 ℃/min升至180 ℃,最后以25 ℃/min升至280 ℃,保持5 min。

質(zhì)譜條件:電子轟擊離子源(EI),離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃,質(zhì)譜接口溫度280 ℃,電子能量70 eV,掃描方式為選擇離子檢測模式(SIM),定性定量離子精準(zhǔn)掃描(GB 23200.8—2016)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel進行基本的數(shù)據(jù)處理,SPSS 23進行顯著性數(shù)據(jù)分析,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。所有的實驗均重復(fù)3次。采用Origin 2022進行總酸和pH作圖?；谧越〝?shù)據(jù)庫,對樣本的代謝物進行質(zhì)譜定性定量分析。用MassHunter定量軟件打開樣本下機質(zhì)譜文件,進行色譜峰的積分和校正工作。采用多元統(tǒng)計分析,包括采用無監(jiān)督的主成分分析(principal component analysis,PCA)來觀察各組樣本之間的總體代謝物差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。基于正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)結(jié)果,從變量重要性投影(variable importance in projection,VIP≥1)初步篩選出組織間差異的代謝物,同時結(jié)合差異倍數(shù)值(fold change≤0.05)來進一步篩選出差異代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 山蘭米醋發(fā)酵過程中總酸和pH值的變化

總酸和pH值是評價米醋品質(zhì)的重要指標(biāo)[9]。米醋發(fā)酵過程中總酸和pH值的變化如圖1所示。醋醅為微生物生長繁殖提供營養(yǎng)成分,醋酸菌大量生長繁殖,將原料中的一些化合物轉(zhuǎn)化成酸類物質(zhì)。米醋發(fā)酵的過程中總酸含量逐漸增加,在發(fā)酵15 d時達(dá)到最大值(4.64 g/100 mL)并趨于穩(wěn)定,顯著高于發(fā)酵初期第3天(1.32 g/100 mL)。與發(fā)酵前期相比,發(fā)酵后期總酸含量變化較小,這可能是由于前期醋酸菌等產(chǎn)酸微生物生長旺盛,促使產(chǎn)生較多酸性物質(zhì)導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境酸度較高,以及后期醋醅中的營養(yǎng)物質(zhì)所剩無幾,抑制了醋酸菌等產(chǎn)酸菌的生長代謝。同時,隨著發(fā)酵的進行,pH值從初期的4.23下降到發(fā)酵結(jié)束的3.64。

圖1 山蘭米醋發(fā)酵過程理化指標(biāo)的變化Fig.1 Changes of physicochemical indexes in the fermentation process of Shanlan rice vinegar

2.2 山蘭米醋發(fā)酵過程中有機酸的變化規(guī)律

有機酸是酸味物質(zhì)的主要來源,構(gòu)成醋中獨特的風(fēng)味和風(fēng)格[10-11]。在山蘭米醋發(fā)酵過程中,共檢測到27種有機酸,如表1所示?？傮w上,發(fā)酵過程中乙酸和乳酸的相對含量占比最大,發(fā)酵結(jié)束時含量分別達(dá)到729.91、927.59 mg/L。作為米醋中兩種主要的有機酸,共占有機酸總含量的72%左右。乙酸含量隨著發(fā)酵的過程逐漸增加,從415.91 mg/L提升至927.59 mg/L,而乳酸含量則隨著發(fā)酵的進行逐漸減少,從1 389.59 mg/L下降至729.91 mg/L,這與LI等[12]研究結(jié)果一致。分析原因可能是乳酸菌在有O2存在的條件下代謝生長緩慢,產(chǎn)物乳酸生成降低,且在發(fā)酵后期由于乙醇和葡萄糖被大量耗盡,乳酸則作為被醋酸菌利用的碳源。而醋酸菌在每天供氧的條件下,分泌乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶將乙醇氧化生成乙酸[13]。酒石酸、衣康酸和戊酸等有機酸占比相對較小,可能是因為在微生物代謝的過程中難以大量積累。琥珀酸和草酸兩種有機酸呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,琥珀酸由535.12 mg/L下降至404.06 mg/L,草酸由38.03 mg/L下降至6.05 mg/L。檸檬酸在發(fā)酵過程中由發(fā)酵前期的93.83 mg/L下降至中后期的27.4 mg/L,而后又上升至79.19 mg/L。綜上所述,在米醋發(fā)酵的過程中,這些有機酸之間相互協(xié)調(diào),緩沖乙酸味道的刺激性,豐富了米醋的口感,使得米醋酸而不澀。

表1 山蘭米醋發(fā)酵過程中各種有機酸含量的變化 單位:mg/L

2.3 山蘭米醋發(fā)酵過程中游離氨基酸的變化規(guī)律

氨基酸是米醋中重要的呈味物質(zhì),能夠為米醋提供鮮、甜、苦等滋味,緩沖米醋中酸味的刺激,使得口感更柔和[2]。采用超高效液相色譜法對山蘭米醋發(fā)酵過程4個階段游離氨基酸的含量進行測定,共檢測到22種游離氨基酸,如電子版增強出版附表1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035449,下同)。整個發(fā)酵過程中谷氨酰胺和丙氨酸含量最高,占總含量的30%左右。在發(fā)酵3、7、11、15 d積累的總游離氨基酸含量分別為(3 945.65±28.778)、(4 081.70±53.659)、(3 760.03±33.852)、(3 558.16±44.155) μg/mL,發(fā)酵過程中的總游離氨基酸含量發(fā)生顯著變化(P<0.05),可以看出發(fā)酵的中期氨基酸總含量較高,這可能是因為乳酸菌和酵母菌分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸,同時發(fā)酵初期到中期微生物大量生長繁殖分泌蛋白酶,將原料中的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨基酸,而發(fā)酵后期的微生物數(shù)量減少、蛋白酶活力下降,同時乳酸菌會在脫羧酶的作用下利用游離的氨基酸產(chǎn)生一些多胺類的物質(zhì),導(dǎo)致游離氨基酸含量降低,使得游離氨基酸含量緩慢下降。根據(jù)氨基酸的呈味性質(zhì),可以分為苦味氨基酸、甜味氨基酸和鮮味氨基酸[9, 14]。甜味氨基酸和苦味氨基酸變化趨勢基本保持一致,發(fā)酵初期到中期增加,隨后略有減少,發(fā)酵結(jié)束后米醋中的甜味氨基酸和苦味氨基酸的含量分別為(1 573.96±10.734)、(723.13±18.097) μg/mL。鮮味氨基酸含量從發(fā)酵初期到發(fā)酵結(jié)束呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,發(fā)酵結(jié)束后含量為(463.24±5.971) μg/mL。成品米醋中呈味分布為甜味氨基酸>苦味氨基酸>鮮味氨基酸,甜味最為明顯,中和醋中的酸味,增加米醋的味道協(xié)調(diào)性。

2.4 山蘭米醋發(fā)酵過程中代謝物分布特征分析

2.4.1 山蘭米醋發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物

通過HS-SPME-GC/MS技術(shù),在山蘭米醋發(fā)酵不同階段中共鑒定出175種揮發(fā)性代謝物,其中包括酯類、萜類、酸類等物質(zhì),如圖2所示。其中酯類化合物的種類最豐富(21.71%),其次為萜類化合物(17.71%)和雜環(huán)化合物(16%)。在米醋發(fā)酵過程中雜環(huán)化合物一般對米醋香味影響較小,但大多數(shù)酯類物質(zhì)具有花香、果香和酯香,而萜類物質(zhì)帶有木質(zhì)香和天然香氣,為米醋風(fēng)味貢獻很大的作用[15]。

圖2 山蘭米醋發(fā)酵過程中揮發(fā)性代謝物的分類Fig.2 Classification of volatile metabolites in the fermentation of Shanlan rice vinegar

2.4.2 PCA

通過對山蘭米醋發(fā)酵不同時間各樣本以及質(zhì)控樣本進行PCA,可以從總體上反映各樣本組間的總體差異以及組內(nèi)樣本之間的變異度大小。圖3為山蘭米醋發(fā)酵不同時間各樣本及質(zhì)控樣本的PCA圖,第一主成分的貢獻率為67.64%,第二主成分的貢獻率為14.77%,二者累積貢獻率為82.41%,可以較好地反映山蘭米醋中的揮發(fā)性成分。從圖3所表示的象限中看,Acid-11 d、Acid-15 d和PC1呈現(xiàn)正相關(guān),而Acid-3 d、Acid-7 d呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。此外Acid-3 d、Acid-15 d 和PC2呈現(xiàn)正相關(guān),Acid-7 d、Acid-11 d和PC2呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果表明,山蘭米醋發(fā)酵不同時間的各組樣本之間完全分離并表現(xiàn)出顯著差異,整體說明發(fā)酵過程中代謝物差異較大,質(zhì)控組內(nèi)平行樣本成分接近,聚集在PCA圖的中心附近,表明方法穩(wěn)定性較好,數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。

圖3 山蘭米醋發(fā)酵不同階段樣本及質(zhì)控的PCA得分圖Fig.3 PCA scores of samples and quality control at different stages of fermentation of Shanlan rice vinegar

2.4.3 山蘭米醋發(fā)酵過程中代謝物的OPLS-DA及模型驗證

與PCA相比,OPLS-DA能夠?qū)矩陣信息分解成與Y相關(guān)和不相關(guān)的兩類信息,通過去除不相關(guān)的差異來篩選差異變量,使組間區(qū)分最大化,有利于尋找差異代謝物。OPLS-DA模型得分散點圖如電子版增強出版附圖1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035449,下同),其中橫坐標(biāo)表示預(yù)測主成分,可以看出組間的差距。縱坐標(biāo)表示正交主成分,可以看出組內(nèi)的差距,縱向距離越近表明組內(nèi)重復(fù)性越好。百分比表示該成分對數(shù)據(jù)集的解釋率。圖中的每個點表示一個樣品,同一個組的樣品使用同一種顏色表示。OPLS-DA評價模型的預(yù)測參數(shù)有R2X、R2Y和Q2,其中R2X和R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率,Q2表示模型的預(yù)測能力,這3個指標(biāo)越接近于1表示模型越穩(wěn)定可靠,Q2>0.5可認(rèn)為是有效的模型,Q2>0.9為出色的模型。電子版增強出版附圖2為OPLS-DA模型置換驗證圖,橫坐標(biāo)表示模型R2Y,Q2值,縱坐標(biāo)是模型分類效果出現(xiàn)的頻數(shù),即本模型對數(shù)據(jù)進行200次隨機排列組合實驗,一般情況下,P<0.05時模型最佳。由附圖1-a可知,Acid-3 d和Acid-7 d兩組分別位于置信區(qū)間的左右兩側(cè),并且Acid-3 d和Acid-7 d之間具有明顯的區(qū)分度。PC1和PC2的貢獻率為41.5%和36.1%,R2Y=0.994、Q2=0.936,P<0.05,證實了該OPLS-DA模型擬合度好,具有預(yù)測性和穩(wěn)定性。由附圖1-b可知,Acid-3 d和Acid-11 d兩組分別位于置信區(qū)間的左右兩側(cè),并且Acid-3 d和Acid-11 d之間具有比較明顯的區(qū)分度。PC1和PC2的貢獻率為50.6%和24.4%,R2Y=0.992、Q2=0.923,P<0.05。由附圖1-c可知,Acid-3 d和Acid-15 d兩組分別位于置信區(qū)間的左右兩側(cè),并且Acid-3 d和Acid-15 d之間具有明顯的區(qū)分度。PC1和PC2的貢獻率為 46.1%和39.9%,R2Y=0.995、Q2=0.977,P<0.05,證實了3組OPLS-DA兩兩實驗組對比模型擬合度好,具有預(yù)測性和穩(wěn)定性。由附圖1可以看出,每兩組樣本之間區(qū)分非常顯著,樣本全部處于95%置信區(qū)間內(nèi),表明山蘭米醋發(fā)酵過程中的代謝物存在顯著差異,可用于后續(xù)代謝物差異分析。

2.4.4 差異代謝物聚類分析和篩選

為了更直觀地觀察到發(fā)酵過程中不同階段差異代謝物含量的變化趨勢,采用聚類分析方法對山蘭米醋發(fā)酵過程中的差異代謝物進行分析。電子版增強出版附圖3說明了代謝物在山蘭米醋發(fā)酵過程中的變化規(guī)律。根據(jù)附圖3-a的樣本聚類的樹狀圖分析,將發(fā)酵過程分成兩個區(qū)域,Acid-3 d的3個平行樣本為第1區(qū)域,Acid-7 d、Acid-11 d和Acid-15差異代謝物聚成一類為第2區(qū)域,Acid-3 d大多數(shù)代謝物顏色比其他3個階段的深,而其他3個階段中Acid-15 d的代謝物豐度又比其他兩組高。由附圖3可知,Acid-7 d和Acid-11 d的差異代謝物數(shù)量較少,說明在發(fā)酵中期到中后期代謝物的變化較小,即代謝物表達(dá)量變化的趨勢相接近[16]。苯甲醛、苯甲酸烯丙酯、β-苯乙酸乙酯、芐丁醚、吡啶甲酰胺和1-(2-呋喃基)-1-戊酮等隨著發(fā)酵時間的延長,代謝物含量逐漸增加,在發(fā)酵結(jié)束時達(dá)到最大。有50%的差異代謝物的含量隨著發(fā)酵的進行呈現(xiàn)遞減的趨勢,包括9-十六碳烯酸乙酯、油酸乙酯和十六烷酸乙酯等。由附圖3-b可知,隨著發(fā)酵時間的延長,差異代謝物的數(shù)量逐漸減少,并且篩選出的主要差異代謝物集中在酯類、醇類、酸類、酮類和雜環(huán)化合物等。

基于OPLS-DA結(jié)果,以同時滿足OPLS-DA模型的VIP>1.0,t檢驗的P<0.05為標(biāo)準(zhǔn),篩選山蘭米醋發(fā)酵不同階段樣品間的差異代謝產(chǎn)物,結(jié)果見電子版增強出版附表2。在醋酸發(fā)酵的不同階段共檢測到41種差異性代謝物。醋的味道一般來自醇類、酯類、醛類、酸類和酮類等各種化合物相互協(xié)調(diào)配合[17]。與Acid-3 d組相比較,4種酸類化合物[油酸、(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸、11-順-十八碳烯酸和(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸]在Acid-15 d組中的含量發(fā)生顯著下降,從高含量降至低含量。醋中的醇類物質(zhì)大多來自于原料,或者酒精發(fā)酵階段微生物作用下的產(chǎn)物。4組樣本共檢測到丙二醇、己醇、(E)-4-己烯-1-醇和3,7,11,15-四甲基-2-十六烯-1-醇4種醇類差異代謝物,這些豐富的揮發(fā)性化合物,是醋中的香氣活性物質(zhì)[18]。丙二醇、己醇都屬于雜油醇,是谷物通過酒精發(fā)酵后的產(chǎn)物。醋中含有少量的高級醇,能夠賦予醋特殊的味道,并起到襯托酯香的作用,使醋香更加完美。醛類和酮類因為分子中均含有羰基所以合稱為羰基化合物,在米醋發(fā)酵過程中共檢測到8種羰基類代謝差異化合物。醋中主要的酮類物質(zhì)為乙偶姻(3-羥基-2-丁酮),乙偶姻帶有淡淡的奶油酸奶香氣[19-20]。乙偶姻是眾多微生物作用的產(chǎn)物,在醋的釀制過程中由α-乙酰乳酸脫羧酶轉(zhuǎn)化雙乙酰產(chǎn)生,是醋中常見的香氣化合物。由附圖3和附表2可以看出,乙偶姻在醋酸發(fā)酵過程中逐漸被消耗。發(fā)酵期間,醛類差異代謝物只有3個,包括環(huán)己烷甲醛、苯甲醛和十八醛。苯甲醛含有杏仁香味,能夠增加山蘭米醋的風(fēng)味。在發(fā)酵第3天和第7天含量幾乎沒有發(fā)生變化,而在中后期其含量發(fā)生大幅度上升。十八醛具有強烈的椰子油香氣,在發(fā)酵期間緩慢減少。酯類化合物一般由酸與醇的共同反應(yīng)生成,多數(shù)酯類化合物具有花果香氣,可使米醋具有理想的風(fēng)味[21]。檢測到發(fā)酵過程中的酯類差異代謝物共有12種,占差異代謝物數(shù)量的29%。其中,十六烷酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、β-苯乙酸乙酯和(4Z,15Z)-4,15-十八碳烯乙酸酯等酯類含量較大。β-苯乙酸乙酯具有甜甜的玫瑰花香味,其含量在發(fā)酵期間變化最大,呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢。油酸乙酯由油酸和醇類物質(zhì)酯化反應(yīng)生成,油酸乙酯含量在醋酸發(fā)酵過程中逐漸減少,考慮與油酸含量減少有關(guān)。萜類化合物的產(chǎn)生主要來源于米醋的原料,β-紫羅蘭酮具有木質(zhì)香韻,是合成視黃醇、β-胡蘿卜素和維生素A等的前提化合物,具有抗癌作用[22],其含量隨著發(fā)酵的過程緩慢增加。

2.4.5 差異代謝物的代謝通路分析

山蘭米醋的發(fā)酵過程受到多種因素的共同調(diào)控,需進一步對其代謝通路進行分析,找到發(fā)酵過程中潛在的代謝途徑。因此,根據(jù)山蘭米醋發(fā)酵不同階段差異代謝物的結(jié)果,進行KEGG通路富集分析,其中Rich Factor為對應(yīng)通路中差異代謝物個數(shù)與該通路注釋到的代謝物總數(shù)的比值,該值越大表示富集程度越大,P值越接近于0,表示富集越顯著,結(jié)果見圖4。點的顏色反映P值大小,越紅表示富集越顯著,點的大小代表富集到相應(yīng)通路上的差異顯著代謝物個數(shù)。由圖4可知,參與山蘭米醋發(fā)酵過程的關(guān)鍵代謝通路共有17條,主要的相關(guān)代謝途徑有植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路、不飽和脂肪酸的生物合成通路、二萜生物合成通路、次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路、代謝途徑通路、芳香族化合物降解通路和不同環(huán)境下的微生物代謝通路。且不同環(huán)境下的微生物代謝通路的富集程度最為顯著,次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路、植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路和不飽和脂肪酸的生物合成通路的富集程度最高。

圖4 山蘭米醋發(fā)酵過程中差異代謝物通路富集分析Fig.4 Enrichment analysis of differential metabolite pathway during fermentation of Shanlan rice vinegar

將關(guān)鍵代謝通路中主要參與的差異代謝物與代謝路徑進行整合,如圖5所示。圖中標(biāo)紅的表示發(fā)酵過程中的主要差異性代謝。由圖5可知,主要參與的差異代謝物有6種,分別為丙二醇、苯甲醛、反式香葉基香葉醇、油酸、(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸和(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸。在山蘭米醋發(fā)酵過程中,乙酰輔酶A先轉(zhuǎn)化成丙二酰輔酶A,而后將飽和脂肪酸氧化生成不飽和脂肪酸[油酸、(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸、(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸]。苯甲醇在芳基醇脫氫酶的作用下生成苯甲醛,苯甲醛在苯甲醛脫氫酶的作用下生成苯甲酸酯,苯甲酸酯在二羥基環(huán)己二烯羧酸脫氫酶的作用下生成鄰苯二酚,鄰苯二酚經(jīng)過多重轉(zhuǎn)化形成琥珀酰輔酶A,琥珀酰輔酶A在氧化酶的催化下最終生成乙酰輔酶A,進入代謝循環(huán)。葡萄糖在醛縮酶的作用下生成磷酸甘油酮,在甘油脫氫酶的作用下磷酸甘油酮轉(zhuǎn)化成L-乳醛,L-乳醛在乳醛酸還原酶作用下產(chǎn)生丙二醇。香葉基焦磷酸經(jīng)過香葉酰二磷酸酶的作用生成萜類物質(zhì)反式香葉基香葉醇。綜合代謝通路的分析結(jié)果,這些關(guān)鍵代謝物質(zhì)可能影響山蘭米醋的風(fēng)味和品質(zhì)。

圖5 山蘭米醋發(fā)酵過程中差異代謝物途徑分析Fig.5 Analysis of differential metabolite pathway during fermentation of Shanlan rice vinegar

3 結(jié)論

以山蘭米醋為研究對象,對發(fā)酵過程中的理化性質(zhì)、游離氨基酸、有機酸和風(fēng)味代謝物進行定量分析。山蘭米醋發(fā)酵過程中總酸含量逐漸增加,而pH值呈現(xiàn)緩慢下降趨勢,兩者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。在山蘭米醋不同發(fā)酵階段共檢測到27種有機酸,其中乳酸和乙酸的含量較高,占有機酸總含量的72%左右,是山蘭米醋中的兩種主體有機酸,而酒石酸、衣康酸和戊酸等有機酸含量占比相對較小。整個發(fā)酵過程中谷氨酰胺和丙氨酸含量最高,而游離氨基酸總含量在發(fā)酵的中期較高,成品米醋中呈味分布為甜味氨基酸>苦味氨基酸>鮮味氨基酸?；赑CA和OPLS-DA結(jié)果分析,發(fā)酵不同階段的代謝物差異較大,共檢測到41種差異代謝物。通過分析發(fā)酵過程中差異代謝物相對含量的變化,發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時間的延長,大部分差異代謝物的相對含量顯著增加。山蘭米醋的發(fā)酵過程受到多種因素的共同調(diào)控,通過對差異代謝物的代謝途徑進行分析,篩選出17條關(guān)鍵代謝通路,發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境下的微生物代謝通路的富集程度最為顯著,次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路、植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路和不飽和脂肪酸的生物合成通路的富集程度最高。