孫華欣,宋春麗,韓赫,王志鵬,孫天穎,任健*,周恪馳

1(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾,161006)2(黑龍江省玉米主食工業(yè)化工程技術(shù)研究中心, 黑龍江 齊齊哈爾,161006)3(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院,黑龍江 齊齊哈爾,161000)

玉米蛋白粉是玉米淀粉濕法加工的主要副產(chǎn)物,蛋白質(zhì)含量約占60%[1],富含各種氨基酸(如丙氨酸、絲氨酸和亮氨酸)[2],具有脂溶性蛋白質(zhì)含量高[3]、氨基酸不平衡[4]、必需氨基酸含量低[5]、消化性差[6]等缺點。

玉米蛋白粉作為一種高蛋白飼料原料,在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用愈發(fā)廣泛[7],然而動物采食后難以被胃、腸道吸收利用,導(dǎo)致玉米蛋白粉的利用效果較差。因此,提高玉米蛋白粉的有效利用率,適宜的預(yù)處理尤為重要。酶法改性是一種有效的手段,該方法可以有效降低玉米蛋白粉中抗?fàn)I養(yǎng)因子的產(chǎn)生,從而增加底物的水解度和消化性,但酶解會使玉米蛋白粉產(chǎn)生苦澀味道,影響口感,且存在耐熱性差等問題[8]。微生物發(fā)酵也能夠提高蛋白質(zhì)的利用率,發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶可以酶解底物中的大分子物質(zhì),降低抗?fàn)I養(yǎng)因子的抗原性,并通過產(chǎn)生有機(jī)酸和抑菌物質(zhì)發(fā)揮其抑菌活性,但微生物發(fā)酵存在菌株性能不穩(wěn)定、耐受性低的問題[9]。將兩種改性方法進(jìn)行有機(jī)結(jié)合,微生物發(fā)酵能夠產(chǎn)生相應(yīng)功能酶,與體系內(nèi)酶發(fā)揮協(xié)同作用,共同促進(jìn)底物酵解過程,顯著縮短發(fā)酵周期[10-11],從而使底物分解成更易吸收的小肽。

CHEIK等[12]研究表明菌酶協(xié)同發(fā)酵小米可以有效提高小米蛋白的消化性,改善口感。徐超等[13]和龍祝[14]研究發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵和酶水解預(yù)處理可以使玉米蛋白粉的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,并且可以改善氨基酸平衡及動物的吸收和利用。王國艷等[15]研究發(fā)現(xiàn)微生物的繁殖和代謝的過程可抑制抗?fàn)I養(yǎng)因子的產(chǎn)生,進(jìn)而提高蛋白的可消化性。張新宇等[16]研究發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵過程中會引進(jìn)有機(jī)酸,使胃消化環(huán)境pH降低,胃蛋白酶活性升高,蛋白消化率升高。

因此,為進(jìn)一步提高玉米蛋白粉的消化性,以玉米蛋白粉為原料,將乳酸菌發(fā)酵與酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶水解結(jié)合,采用單因素、正交試驗確定最佳發(fā)酵工藝條件,并對直接影響玉米蛋白粉體外消化性的游離巰基含量、二硫鍵含量、表面疏水性、氨基酸等理化特性進(jìn)行分析,以獲得更高消化性的菌酶協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)物,為菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白粉提供技術(shù)支撐,為玉米蛋白粉的生產(chǎn)加工和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸菌(活力為1×1010CFU/g)、酸性蛋白酶(酶活力為20 000 U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力為10 000 U/g),北京默飛生物科技有限公司;玉米蛋白粉(蛋白質(zhì)含量66%),大連奧肽營養(yǎng)專賣店。

1.2 設(shè)備與儀器

ME104E電子天平,梅特勒-托力多集團(tuán);ZNCL-GS磁力加熱攪拌器,上海凌科實業(yè)發(fā)展有限公司;RF5301PC熒光分光光度計,日本島津公司;TU-1810紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;3-18KS臺式高速冷凍離心機(jī),德國Sigma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 復(fù)合酶酶解產(chǎn)物的制備

通過試驗預(yù)處理,將玉米蛋白粉進(jìn)行木瓜蛋白酶(添加量400 U/g、溫度55 ℃、pH 6.0、時間3 h)及酸性蛋白酶(溫度40 ℃、添加量800 U/g、pH 3.0、時間3 h)復(fù)合處理得到復(fù)合酶酶解產(chǎn)物。

1.3.2 乳酸菌發(fā)酵復(fù)合酶酶解產(chǎn)物

利用乳酸菌發(fā)酵上述復(fù)合酶酶解產(chǎn)物,考察發(fā)酵溫度(33～41 ℃)、接種量(0.1%～0.5%)、料液比(1∶2～1∶6,g∶mL)、發(fā)酵時間(12～36 h)對產(chǎn)物水溶性蛋白質(zhì)含量的影響。

1.3.3 福林酚法測水溶性蛋白

參照文獻(xiàn)[17]采用福林酚法測定產(chǎn)物水溶性蛋白質(zhì)含量。吸取0.2 mL的玉米蛋白粉水解液,加入0.8 mL蒸餾水、5 mL福林酚甲液,混勻10 min,再加入0.5 mL稀釋1倍的福林酚乙液,混勻并水浴(30 ℃、30 min)。然后用紫外分光光度計在最適波長處進(jìn)行測定(640 nm)。按公式(1)計算水溶性蛋白質(zhì)含量。

水溶性蛋白含量/(mg/mL)

(1)

1.3.4 游離巰基含量的測定

參考李平等[18]的方法并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷?。稱取400 mg不同改性產(chǎn)物添加量的凍干樣品于10 mL的0.2 mol/L Tris-Gly緩沖溶液中,渦旋振蕩5 min,離心機(jī)離心(5 000 r/min、15 min)。取4 mL上清液與0.1 mL 10 mmol/L的DTNB溶液混勻,靜置20 min,用紫外分光光度計在412 nm波長處進(jìn)行測定,按公式(2)計算游離巰基的含量。

(2)

式中:n,標(biāo)準(zhǔn)曲線縱坐標(biāo)游離巰基含量,μmol/mL;ρ,樣品質(zhì)量濃度,g/mL;SHF,游離巰基的含量,μmol/mL。

1.3.5 二硫鍵含量的測定

取1.3.4節(jié)中離心后的上清液1 mL,加入0.1 mL β-巰基乙醇和4 mL的0.2 mol/L Tris-Gly緩沖溶液,常溫顯色1 h,然后添加10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的三氯乙酸,均勻混合1 h,4 500 r/min、離心15 min,保留沉淀,用5 mL 12%的三氯乙酸溶液洗滌沉淀2次,洗滌完全后溶于10 mL 0.2 mol/L的Tris-Gly緩沖溶液,溶解后加入0.1 mL 10 mmol/L DTNB,靜止20 min,用紫外分光光度計在412 nm處測定吸光度后,按公式(3)和公式(4)計算總巰基含量[18]。

(3)

式中:n,吸光度經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的巰基含量,μmol/mL;ρ,樣品質(zhì)量濃度,g/mL;V1,上清液體積,mL;V2,沉淀復(fù)溶后體積,mL。

(4)

式中:SHT,總巰基含量,μmol/mL;SHF,游離巰基含量,μmol/mL。

1.3.6 表面疏水性的測定

以10 mmol/L磷酸鹽緩沖液,pH值為7.0配制蛋白溶液(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL),取2 mL稀釋液加入10 μL 8-苯胺萘磺-1-酸鹽溶液(8.0 mmol/L)中,并用熒光分光分度計激發(fā)波長為390 nm、發(fā)射波長為470 nm進(jìn)行測定,以熒光強(qiáng)度隨蛋白濃度變化的斜率表示表面疏水性[19]。

1.3.7 氨基酸組成分析

參照李思錦等[20]的方法,使用氨基酸自動分析儀進(jìn)行分析。

1.3.8 體外消化率測定

采用體外胃-胰蛋白酶兩步法[21]測定菌酶協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)物。稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的樣品于具塞三角瓶,調(diào)節(jié)pH值至2.0,加入30 mg的胃蛋白酶,39 ℃、120 r/min水浴搖床振蕩4 h。調(diào)節(jié)pH值至7.5,加入30 mg的胰蛋白酶,再振蕩3 h,取10 mL消化液添加至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的三氯乙酸中,搖勻后靜止30 min,20 000 r/min 離心10 min。取上清液2 g于消化管,凱氏定氮法測定上清液的含氮量,每個樣品設(shè)置3個平行。體外消化率計算如公式(5)所示:

(5)

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵復(fù)合酶酶解產(chǎn)物

2.1.1 乳酸菌發(fā)酵復(fù)合酶酶解產(chǎn)物單因素試驗

以乳酸菌發(fā)酵的發(fā)酵溫度、接種量、時間、料液比為試驗因素,考察各因素對菌酶協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)物水溶性蛋白質(zhì)含量的影響,結(jié)果見圖1。

由圖1-a可知,隨著溫度升高,水溶性蛋白質(zhì)含量整體趨勢為先升高再降低,在37 ℃時水溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大值。這是因為在37 ℃時乳酸菌生物活性最高。當(dāng)溫度不在該最適溫度范圍,乳酸菌的生物活性減弱,直接影響乳酸菌的發(fā)酵性能[22]。

a-發(fā)酵溫度;b-接種量;c-發(fā)酵時間;d-發(fā)酵料液比

由圖1-b可知,隨著接種量的增加,水溶性蛋白質(zhì)含量呈先升高后降低趨勢,這是因為接種量會影響發(fā)酵體系內(nèi)微生物的生長繁殖,隨著接種量逐漸升高,發(fā)酵體系內(nèi)微生物生長茂盛,從而使產(chǎn)生的水溶性蛋白質(zhì)含量升高[22];而接種量過多會使發(fā)酵環(huán)境中菌與底物比過高,發(fā)酵環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡,還有可能會產(chǎn)生發(fā)酵代謝物,導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境中產(chǎn)生有毒代謝成分[23]。因此選擇0.4%為適宜接種量。

由圖1-c可知,隨著發(fā)酵時間的延長,水溶性蛋白質(zhì)含量升高,當(dāng)發(fā)酵時間為24 h時,水溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高。原因是短時間的發(fā)酵不能使玉米蛋白粉發(fā)酵完全;而隨著發(fā)酵時間延長,底物大量消耗,并且發(fā)酵產(chǎn)物過多會抑制反應(yīng)的進(jìn)行,導(dǎo)致乳酸菌的衰亡[20]。因此選用發(fā)酵時間24 h。

由圖1-d可知,當(dāng)料液比在1∶2～1∶4(g∶mL)時,水溶性蛋白質(zhì)含量逐漸升高,在1∶4～1∶6(g∶mL)時,水溶性蛋白含量逐漸降低。這是因為水分含量的多少會影響乳酸菌的生長,水分含量過低時不利于乳酸菌的生長繁殖;過高時會促進(jìn)有害菌(梭菌)發(fā)酵,抑制乳酸菌生長[19]。因此發(fā)酵料液比選用1∶4(g∶mL)。

2.1.2 正交試驗設(shè)計

在單因素的基礎(chǔ)上,采用L9(34)正交表優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵復(fù)合酶酶解產(chǎn)物的發(fā)酵條件。正交因素水平表如表1所示,正交試驗結(jié)果如表2所示,方差分析結(jié)果如表3所示。

表1 L9(34)正交因素水平表Table 1 Orthogonal L9(34) factor level table

由表2可知,以水溶性蛋白質(zhì)含量為評價指標(biāo),影響極差R大小的主次順序依次為C>B>D>A,即料液比>加菌量>溫度>時間。理論適宜組合為A2B1C2D3。即:發(fā)酵時間為24 h,發(fā)酵接種量為0.3%,發(fā)酵料液比為1∶4(g∶mL),發(fā)酵溫度為39 ℃。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results

由表3可知,料液比對水溶性蛋白質(zhì)含量影響差異顯著。將理論適宜因素水平下進(jìn)行驗證試驗,水溶性蛋白質(zhì)含量為15.9 mg/mL,略高于已報道的玉米蛋白粉飼料發(fā)酵工藝中水溶性蛋白質(zhì)含量(13.77 mg/mL)[24],且有效縮短了發(fā)酵時間。因此,乳酸菌發(fā)酵復(fù)合酶酶解產(chǎn)物最佳工藝條件為:發(fā)酵時間24 h,發(fā)酵接種量0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),料液比1∶4(g∶mL),發(fā)酵溫度39 ℃。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results

2.2 菌酶協(xié)同發(fā)酵對玉米蛋白粉游離巰基、二硫鍵及表面疏水性含量的影響

巰基和二硫鍵是反映玉米蛋白品質(zhì)變化的重要指標(biāo)[12]。由圖2-a可知菌酶協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)物的游離巰基含量由65.43 μmol/g升高至88.42 μmol/g,二硫鍵含量由67.06 μmol/g降低至44.40 μmol/g,這是因為菌酶協(xié)同發(fā)酵會使玉米蛋白粉的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使連接肽鏈之間的二硫鍵打開,導(dǎo)致游離巰基含量上升,玉米蛋白的空間結(jié)構(gòu)松散,蛋白消化率發(fā)生改變[25]。

由圖2-b可知經(jīng)菌酶協(xié)同發(fā)酵后的產(chǎn)物表面疏水性由71.94降低至10.97。這是因為菌酶協(xié)同發(fā)酵可以打開蛋白質(zhì)的三、四級空間結(jié)構(gòu),促使酶與酶切位點結(jié)合,剪切長肽鏈,導(dǎo)致親水基團(tuán)從內(nèi)部暴露出來,蛋白表面疏水性降低[26]。

a-菌酶協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)物游離巰基及二硫鍵含量; b-菌酶協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)物表面疏水性變化

2.3 菌酶協(xié)同發(fā)酵對玉米蛋白粉氨基酸組成分析

氨基酸是消化能力大小的重要影響因素,發(fā)酵可使產(chǎn)物的氨基酸組成與原蛋白相比發(fā)生明顯變化。菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白粉氨基酸含量由表4可知,菌酶協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)物中的氨基酸組成豐富,含15種不同氨基酸,含有蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸等6種必需氨基酸。其中必需氨基酸含量為22.54、23.56、25.70 mg/g,總氨基酸含量分別為64.56、66.91、72.27 mg/g。

表4 菌酶協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸含量 單位:mg/g

此外,菌酶協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)物與玉米蛋白粉相比,必需氨基酸含量升高3.16 mg/g,總氨基酸含量升高7.71 mg/g,親水氨基酸含量從32.19 mg/g升高至35.25 mg/g。這主要是因為玉米蛋白中多為不溶性的玉米醇溶蛋白,蛋白表面含有大量的疏水性氨基酸,且以二硫鍵和氫鍵維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[27]。本研究利用復(fù)合酶酶解或者菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白粉,一方面破壞了二硫鍵(見2.2節(jié)二硫鍵含量分析結(jié)果)和氫鍵,導(dǎo)致醇溶蛋白表面疏水氨基酸含量減少,從而有利于暴露內(nèi)部親水性氨基酸;另一方面,被破壞的疏水性氨基酸又在體系內(nèi)形成更多新的氨基酸,從而使總氨基酸含量上升[27]。已有研究表明提高親水氨基酸的含量可提高蛋白質(zhì)在體內(nèi)的消化率[28]。由此可知,菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白粉產(chǎn)物的氨基酸較平衡,消化性能好。

2.4 菌酶協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)物的體外消化率分析

體外消化率可表征營養(yǎng)物質(zhì)在體內(nèi)被消化利用的是否完全,還與微生物對飼料的作用能力有關(guān)。體外消化率可直接反映采食量和飼料可消化性[29]。由圖3可知,菌酶協(xié)同發(fā)酵可以提高玉米蛋白粉的體外消化率,由60.15%(玉米蛋白粉)升高至80.42%,高于已有報道利用單一發(fā)酵所得玉米蛋白粉的消化率(67.10%)[30]。這是因為蛋白原料的空間結(jié)構(gòu)直接影響消化率。研究表明蛋白質(zhì)疏水作用減弱、二硫鍵斷裂、游離巰基含量上升,會使體外蛋白消化率升高[21]。而由2.2節(jié)可知,菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白粉使疏水作用和二硫鍵顯著下降,游離巰基含量顯著上升,綜上所述,菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白粉會使體外消化率顯著升高。

圖3 菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白粉的體外消化率Fig.3 In vitro digestibility of the fermented products from corn gluten meal hydrolysates with lactic acid bacteria

3 結(jié)論與討論

菌酶協(xié)同發(fā)酵使玉米蛋白粉的二硫鍵含量、表面疏水性降低,游離巰基、氨基酸含量升高,從而顯著提高玉米蛋白粉的體外消化率(由60.15%升高至80.42%)。同時,本研究成果為菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白粉在飼料中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ),也可為菌酶協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白粉提供技術(shù)支撐。