張穎,董耀,呂云斌,王紹琛,馮治洋

(南京農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院,江蘇 南京,210000)

酯酶屬于α/β水解酶超家族,通常催化酯鍵的裂解和形成,包括酯化和酯交換等反應,一般情況下優(yōu)先水解短鏈酯,在結(jié)構(gòu)上具有α/β水解酶典型的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)和相對保守的催化域[1-3]。1999年,ARPIGNY等將細菌源酯酶分類成8個家族[4]。其中,酯酶的第Ⅳ家族(HSL家族)有典型的帽結(jié)構(gòu)域[5],通常由4～5個α螺旋組成,覆蓋活性位點[6],并且其N末端部分(帽結(jié)構(gòu)域的一部分)可能與底物特異性和催化效率的調(diào)節(jié)有關[7]。

脂解酶作為一種工業(yè)生物催化劑應用廣泛[8-9],工業(yè)上對高酶活酯酶的需求也日益增大,因此對酯酶的研究有巨大的價值。有的研究者通過直接分離產(chǎn)酯酶的菌株,在菌種中分離所需的酯酶[10],再去擴展被表征的高活性酯酶[11],但大多數(shù)產(chǎn)酯酶的菌株及其酶會由于培養(yǎng)條件受限而難以被發(fā)現(xiàn)[12]。于是,有的研究者直接基于活性去篩選酯酶[13]?，F(xiàn)在,利用宏基因組序列篩選或功能篩選新型酯酶成為了一種趨勢[14],KANG等[15]便在宏基因組庫中分離得到1種新型熱穩(wěn)定酯酶。

本試驗在以三丁酸甘油酯為指示底物的瓊脂平板上基于活性功能篩選到了1個高活性的陽性克隆,構(gòu)建亞克隆測序驗證后,對其進行了異源表達和酶學性質(zhì)的表征,展現(xiàn)了其在工業(yè)應用方面的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料采集與處理

本實驗室已構(gòu)建的珠穆朗瑪峰土壤宏基因組文庫[16]:2014年2月取樣于珠穆朗瑪峰(北緯28.21°,東經(jīng)86.56°,海拔高度4 276 m)。文庫宿主:EscherichiacoliEPI100;文庫載體:Cosmid pWEB-TNC。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)基材料等

EPI100-T1R、Cosmid pWEB-TNC、E.coliBL21(DE3)均由本實驗室保藏。LB培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5,胰蛋白胨10,NaCl 10。三丁酸甘油酯篩選培養(yǎng)基:12.5 μg/mL氯霉素、100 μg/mL氨芐青霉素、體積分數(shù)為1%甘油三丁酸酯,體積分數(shù)為1%阿拉伯樹膠的LB固體培養(yǎng)基。

1.2 酯酶的陽性克隆的篩選

在三丁酸甘油酯篩選培養(yǎng)基平板上鋪約包含400～500個克隆的文庫菌液,37 ℃培養(yǎng)1周,挑出具有透明圈的陽性克隆后,水平轉(zhuǎn)移鋪板驗證。

1.3 亞克隆的構(gòu)建

提取陽性克隆質(zhì)粒后,用限制性內(nèi)切酶Sau3AI部分酶切,膠回收,去磷酸化后,將酶切基因片段連接到經(jīng)完全酶切、去磷酸化后的pWEB-TNC載體中,連接產(chǎn)物化轉(zhuǎn)至E.coliEPI100-T1R,涂布在三丁酸甘油酯篩選培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)1周,挑出陽性亞克隆測序驗證。

1.4 酯酶基因的生物信息學分析

提取陽性亞克隆質(zhì)粒并進行酶切檢驗后送公司進行雙末端測序,拼接后的結(jié)果使用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進行開放閱讀框分析。序列相似性使用BLASTp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行分析,通過Clustal W(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)和在線工具ESPript 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/) 進行多序列比對及同源序列分析。使用MEGA6.0 基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,自展值設為1 000,系統(tǒng)發(fā)育樹的美化采用在線工具 ITOL(https://itol.embl.de/)。使用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)進行蛋白理化性質(zhì)分析預測蛋白的理論分子質(zhì)量和等電點,使用SignalP 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)預測蛋白是否含有信號肽序列,使用TMHMMOL/L(https://dtu.biolib.com/DeepTMHMMOL/L)預測是否存在跨膜區(qū)域,使用PDB (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html)尋找相似三維結(jié)構(gòu),使用SWISS MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)進行同源蛋白三維結(jié)構(gòu)預測和模型構(gòu)建,使用SAVES v5.0(https://saves.mbi.ucla.edu/)對模型進行可信度評價。圖像處理使用軟件AdobeIllustrator。數(shù)據(jù)處理使用軟件EXCEL。采用AutoDock Vina 1.1.2軟件進行分子對接,使用PyMol 2.5.2 對對接結(jié)果進行可視化分析。

1.5 異源表達和純化

設計目的基因上帶有酶切位點的上下游引物(AesZF899-R:5′-ATATCTCGAGCGCCTTGGACTTCA-3′, AesZF899-F:5′-ATATGAATTCATGCCGATCGTAC-TCGA-3′),通過PCR(條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s;62 ℃ 45 s;72 ℃ 3 min;72 ℃ 10 min)擴增得到目的片段序列,然后將其與帶有相同酶切位點 Nco I和 Xho I 的表達載體相連接,建立pET-28a(+)-AesZF899重組質(zhì)粒。通過序列分析和三丁酸甘油酯底物驗證,將陽性重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到表達宿主E.coliBL21(DE3)中進行表達。挑取已驗證正確的重組克隆子E.coliBL21(DE3)-AesZF899于LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8時,添加異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside ,IPTG)使其終濃度為0.5 mmol/L,18 ℃,200 r/min,誘導表達20 h后離心棄上清液,用裂解液重懸菌體后超聲波破碎30 min(6 mmol/L超聲探頭,1 s超聲,間隔2 s),高速離心(12 000 r/min,20 min)取上清液過偶聯(lián)鎳離子的親和層析純化。將純化后的蛋白樣品與5×蛋白上樣緩沖液按相應比例混合,98 ℃反應10 min使蛋白變性,選擇體積分數(shù)為12%的聚丙烯酰胺分離凝膠和體積分數(shù)為5%濃縮膠來檢測純化效果,采用考馬斯亮藍法染色脫色。

1.6 酯酶活力的測定

采用對硝基苯酚(p-nitrophenol,p-NP)比色法測定酯酶活力,以1 mmol/L的p-NP為標準液,稀釋不同濃度,用酶標儀讀取405 nm處的OD值。以吸光度值為橫坐標,p-NP 濃度為縱坐標,繪制標準曲線。在40 ℃、pH 9.0條件下,每分鐘降解底物對硝基苯酯生成1 μmol對硝基苯酚所需酶量為一個酶活力單位(U)。反應混合物(500 μL)包含最終濃度為50 mmol/L的pH值為8.0的Tris-HCl和0.2 mmol/L對硝基苯酯底物,除非另有說明,還包括純化的AesZF899,所有反應都平行測定3次,酶反應時間5 min。

1.7 底物特異性的測定

以4種對硝基苯酚酯:對硝基苯乙酸酯(pNPC2)、對硝基苯丁酸酯(pNPC4)、對硝基苯己酸酯(pNPC6)、對硝基苯辛酸酯(pNPC8)為底物,評估純化的AesZF899的底物特異性。

1.8 酯酶的酶學性質(zhì)的測定

溫度對AesZF899活性的影響:在pH 8.0條件下,設置溫度梯度20～100 ℃,按照酯酶酶活力測定方法,依次計算各個溫度酶活力大小,從而得到該酶作用的最適溫度。將最高酶活力的實驗組的酶活力記為100%。

pH對AesZF899活性的影響:在溫度40 ℃條件下,設置pH梯度(甘氨酸緩沖液pH 9.0、10.0,Tris緩沖液pH 8.0、9.0,磷酸鹽緩沖液pH 6.0、7.0、8.0,檸檬酸緩沖液pH 3.0、4.0、5.0、6.0),按照酯酶酶活力測定方法,依次計算各個pH下酶活力大小,從而得到該酶作用的最適pH。將最高酶活力的實驗組的酶活力記為100%。

溫度對AesZF899穩(wěn)定性的影響:在pH 9.0條件下,將酶液分別置于30、40、50 ℃保溫,期間每隔一段時間測定其在最適條件下(40 ℃、pH 9.0)殘余酶活力大小。將未經(jīng)保溫操作的對照組在最適條件下(40 ℃、pH 9.0)測得的酶活力記為100%。

pH對AesZF899穩(wěn)定性的影響:在pH 9.0條件下,將酶液分別置于不同緩沖液中(檸檬酸緩沖液pH 3.0、4.0、5.0、6.0,磷酸鹽緩沖液pH 6.0、7.0、8.0,Tris緩沖液pH 8.0、9.0,甘氨酸緩沖液pH 9.0、10.0)4 ℃ 保溫2 h,期間每隔一段時間測定其在最適條件下(40 ℃、pH 9.0)殘余酶活力大小。將未經(jīng)保溫操作的對照組在最適條件下(40 ℃、pH 9.0)測得的酶活力記為100%。

金屬離子和有機溶劑對 AesZF899 活性的影響:在最適條件下(40 ℃、pH 9.0),在緩沖液中加入10 mmol/L的不同的金屬離子(Cu2+、K+、Na+、Ni+、Mg2+、Fe3+、Mn2+、Li+)及體積分數(shù)為1%和10%的化學溶劑[SDS、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO) 、甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、異戊醇],測定酯酶活力。將添加有機溶劑但未添加酶液的對照組作為空白,將添加酶液但未添加有機溶劑的對照組在最適條件下(40 ℃、pH 9.0)測得的酶活力記為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯酶的克隆、表達、序列分析和系統(tǒng)發(fā)育

本研究基于宏基因組功能篩選了約200萬個文庫菌克隆后獲得了多個周圍有透明圈的陽性克隆,選擇一個透明圈半徑最大的酯酶陽性克隆進行后續(xù)實驗。對該陽性克隆進行復篩,確認該克隆具有酯酶活性后進行亞克隆的構(gòu)建,挑選具有酯酶活性的亞克隆,酶切驗證酯酶陽性亞克隆構(gòu)建成功,并對該陽性亞克隆質(zhì)粒測序。

亞克隆測序結(jié)果經(jīng)ORF Finder在線工具分析后,定位一個長度為945 bp的開放閱讀框,命名為AesZF899,可編碼314個氨基酸,預測蛋白大小34 kDa,等電點是5.49,顯示其不含信號肽,不存在跨膜區(qū)域,提示AesZF899為胞內(nèi)酶。NCBI在線工具BLASTp中的UniProtKB/Swiss-prot (swissprot)數(shù)據(jù)庫序列比對結(jié)果表明,與來自Afipiasp. P52-10中編碼313個氨基酸的α/β水解酶(GenBank登錄號為WP_034470467.1)一致性達76.43%,但該酶的酶學性質(zhì)尚未表征,Graphic Summol/Lary中提示AesZF899可能編碼一種乙?；ッ浮esZF899提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中,登錄號為PRJNA932869。

利用MEGA X構(gòu)建了包含Arpigny和Jaeger的分類中8個家族的代表序列鄰接系統(tǒng)發(fā)生樹(圖1-a),以對AesZF899進行相關的分類,顯示AesZF899與酯酶第四家族密切相關。

對酯酶AesZF899及同家族的triacylglycerol lipase [Moraxellasp.](CAA37862)、esterase [RenibacteriumsalmoninarumATCC 33209](ABY25125)和Arylesterase(B5BLW5.1)進行多序列同源比對,結(jié)果如圖1-b所示,在AesZF899的氨基酸序列中存在酯酶第四家族(HSL家族)酯酶的保守基序HGGG和GDSAG,比對分析推測活性位點絲氨酸(Ser162)、保守天冬氨酸(Asp242)和組氨酸(His88)可能組成了催化三聯(lián)體。

2.2 AesZF899的結(jié)構(gòu)建模與分子對接

二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明AesZF899 有10個α螺旋、8個β折疊、3個無規(guī)則卷曲。在SWISS-MODEL上進行同源建模[17-21],根據(jù)Est8(PDB:4YPV,序列覆蓋度43.87%)的結(jié)構(gòu)建模得到AesZF899的結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖2 所示。GMQE的可信度范圍為0～1,值越大表明質(zhì)量越好;QMEAN4評估待測蛋白與模板蛋白的匹配度,值越大表示匹配越好,該結(jié)構(gòu)的GMQE值是0.83,QMEAN4值是0.79。ERRAT分析不同原子類型之間非鍵合相互作用的統(tǒng)計數(shù)據(jù),結(jié)果表明,AesZF899有91.77%的得分。VERIFY 3D用于確定原子模型(3-dimension,3D)的準確性,其中的結(jié)果是通過比較已經(jīng)被晶體學或核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)解析的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,AesZF899有96.15%的氨基酸殘基得分。以上結(jié)果顯示,同源建模得到的結(jié)構(gòu)合理,適合于下一步的分子對接。此外,還可以看到在AesZF899的三維結(jié)構(gòu)中存在α/β水解酶折疊子,即多個α螺旋和β折疊組成,并且可以看到上方存在一個CAP結(jié)構(gòu)域。

分子對接的對硝基苯乙酸酯(Cas號:830-03-5)的3D結(jié)構(gòu)從PUBCHEM數(shù)據(jù)庫下載獲得,并在MMOL/LFF94力場下進行能量最小化。在對接開始之前,使用PyMol 2.5.22對受體蛋白進行處理,包括去除水分子、鹽離子以及小分子。結(jié)果如圖3所示,從右邊的相互作用細節(jié)圖中看到對硝基苯乙酸酯與AesZF899上的Leu-210、Asp-208發(fā)生氫鍵作用,和Lys-23發(fā)生陽離子pi共軛作用;此外,還可以觀察到對硝基苯乙酸酯和蛋白的Phe-16、Leu-210 發(fā)生疏水作用。氫鍵作用為最強的非共價作用之一,在此表明發(fā)生氫鍵作用的Leu-210、Asp-208為對結(jié)合起重要貢獻的氨基酸。結(jié)合親和力為負數(shù)表示存在結(jié)合的可能,通常數(shù)值小于-6 kcal/mol被認為結(jié)合可能性較大。在該復合物中,對接軟件給出對硝基苯乙酸酯與AesZF899結(jié)合親和力評分為-6.0 kcal/mol,意味著對硝基苯乙酸酯與AesZF899蛋白具備結(jié)合可能性。

a-AesZF899的系統(tǒng)發(fā)育樹;b-AesZF899的多重序列比對

圖2 AesZF899的三維結(jié)構(gòu)Fig.2 3D structure of AesZF899

圖3 AesZF899與對硝基苯乙酸酯的分子對接圖Fig.3 Molecular docking diagram of AesZF899 with p-nitrophenylacetate

2.3 重組酯酶的表達和純化

N端包含His-Tag的重組AesZF899在大腸桿菌BL21 (DE3)中成功表達,并經(jīng)Ni+親和層析純化,SDS-PAGE結(jié)果如圖4所示,AesZF899的大小與理論大小34 kDa相符。

M-蛋白Marker;1-粗酶液;2-純酶

2.4 酯酶的酶學特性分析

酶的最適底物如圖5所示,在對對硝基苯乙酸酯(pNPC2)、對硝基苯丁酸酯(pNPC4)、對硝基苯己酸酯(pNPC6)和對硝基苯辛酸酯(pNPC8) 4種底物的底物特異性實驗中,AesZF899對對硝基苯乙酸酯(pNPC2)的酶活性最佳,底物活性譜是酯酶活性的特征,即酯酶通常僅在短鏈酯上具有活性,因此,AesZF899是一個酯酶,而不是脂肪酶。

圖5 底物特異性Fig.5 Specificity of substrate

酶的最適溫度如圖6所示,酶活性在40 ℃時達到最大值,酶促反應理想溫度在40～50 ℃,反應溫度大于60 ℃后,相對酶活性不足20%,酶的作用溫度區(qū)間較窄,反映了AesZF899是一個中溫酶。

圖6 溫度對酶活性的影響Fig.6 Effect of temperature on enzyme activity

酶的溫度穩(wěn)定性如圖7所示,在30 ℃溫育8 h后仍可保持初始活性,酯酶在溫度35、40 ℃的半衰期分別是7、4 h,當溫育溫度大于50 ℃后,溫育半小時后相對酶活性僅50%,溫育1 h后酶活性幾乎完全喪失,反映了AesZF899并不耐高溫。

圖7 時間對酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of temperature on enzyme stability

酶的最適pH如圖8所示,酶活性隨著酶促反應的pH值的上升先升后降,pH值小于5.0時酯酶幾乎無活性,pH值在9.0時酯酶的活性最大,反映了AesZF899是一個堿性酶。

圖8 pH 對酶活性的影響Fig.8 Effect of pH on enzyme activity

pH值對酶穩(wěn)定性的影響如圖9所示,過酸或過堿的環(huán)境都會降低酶的穩(wěn)定性,中度偏堿的環(huán)境更適合酶的穩(wěn)定,酶在pH 9的情況下可維持65%的活性。

圖9 pH 對酶穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of pH on enzyme stability

金屬離子對酶活性的影響如圖10所示,Fe3+可以增強酶活性,Mn2+和Cu2+對AesZF899的酶活性抑制作用較弱,K+和Ca2+對AesZF899的酶活性抑制作用較強,Na+、Li+和Mg2+對AesZF899的酶活性抑制作用最強,反應體系中加入Na+、Li+和Mg2+可使AesZF899的相對酶活性降低到50%以下。

圖10 金屬離子對酶活性的影響Fig.10 Effect of metal ions on enzyme activity

有機溶劑對酶活性的影響如圖11所示,酶在10%甲醇和10%丙醇溶劑中活性明顯降低,可能是由于有機溶劑分子阻礙底物和酶活性位點的接觸[22];酶在1% DMSO中活性明顯增強,可能是由于其使酶的柔性部位增加[23];酶在1%和10%的異戊醇中活性稍微增加,可能是由于二級結(jié)構(gòu)的改變[24]。

圖11 有機溶劑對酶活性的影響Fig.11 Effect of organic solvent on enzyme activity

在最佳條件下,即酶促反應溫度40 ℃,pH值為9.0,底物是對硝基苯乙酸酯,反應體系不額外加金屬離子,不加有機溶劑的情況下,酯酶AesZF899的比活力可高達(3 957±3) U/mg。

3 結(jié)果與討論

本研究通過宏基因組手段從前期建立的珠穆朗瑪峰土壤文庫中,篩選了約200萬個文庫菌克隆后獲得了多個周圍有透明圈的陽性克隆,選擇一個透明圈半徑最大的酯酶陽性克隆,即酯酶活性最大的一個陽性克隆,構(gòu)建正確的陽性亞克隆后在NCBI上比對序列信息,并利用基因工程技術實現(xiàn)了該基因在大腸桿菌中的異源表達,通過鎳柱親和層析純化后得到純度較高的純酶,在脫鹽柱上脫鹽后進行酶學性質(zhì)的測定。通過對進化樹的分析,推測該酯酶是酯酶第四家族。選取進化樹上與該酯酶相近的分支的序列進行多重序列比對,發(fā)現(xiàn)該酯酶的序列具有保守基序HGGG和GDSAG,符合酯酶第四家族GDSAG亞族的特點。采用了測定酯酶活性的通用底物對硝基苯酯測定該酶的底物特異性,該酶在底物特異性實驗中偏好短鏈酯,最佳底物是對硝基苯乙酸酯,最佳pH值為9.0,偏堿性,最佳溫度40 ℃。在最佳條件下的該酯酶的比活力可達3 957 U/mg。同時,Fe3+可以增強酶活性,適用于工業(yè)中鐵容器材質(zhì)。

通常采用在同等條件下釋放的對硝基苯酚的含量去衡量酯酶的活性大小,這是因為酯酶水解酯鍵,產(chǎn)生游離酚重新激活顯色基團或熒光基團,進一步通過分光光度計定量測定,從而反應水解能力的大小[25]。AesZF899的比活力可達3 957 U/mg,Sigma-Aldrich提供的商業(yè)酯酶的活性也僅為104～105U/g,雖然商業(yè)酯酶的活力通常小于天然酯酶的活力,大于人工設計的酯酶活力[26]。在一些實驗中為了獲得具有較高催化活性的酶,會對其底物結(jié)合口袋的形成、相互作用和疏水性進行合理的定向突變[27]。在未來的研究中,可以對AesZF899進行突變獲得更高活性的酯酶,或者可以通過突變底物分子周圍重要的氨基酸從而改造酶的分子結(jié)構(gòu)以提高酶的穩(wěn)定性以及增強酶的選擇性、改變酶的表面特性等。酯酶主要催化短鏈的脂肪酸酯及醇的反應,且生產(chǎn)成本低于脂肪酶,成為了化學合成中重要的催化劑[28]。有研究者從豌豆中分離得到酯酶,并根據(jù)底物特異性將其歸類為羧酸酯酶,用于酶抑制法檢測農(nóng)藥殘留[29]。所以根據(jù)底物特異性可以將AesZF899也歸類為酯酶,用于生物催化劑等工業(yè)領域。同時,AesZF899在30 ℃的穩(wěn)定性很好,利于工業(yè)酶制劑的常溫儲存,保持高效的酶活性,減少工業(yè)酶制劑的貯存成本。