毛永盡，楊慧琳，馬曉聰，趙鋒，崔英俊

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室 哈爾濱 150030）

0 引 言

核因子κB 受體活化因子配體（R eceptor activator of the N F-κB ligand，RANKL），俗稱TRANCE、ODF、OPGL、TN FSF11。RANKL 是國際上普遍接受的名字。T 淋巴細胞、巨噬細胞、破骨細胞、骨髓基質(zhì)細胞、乳腺上皮細胞等都能夠表達RANKL。RANKL與其同源性受體RANK 相互作用，能夠活化下游的信號通路，從而對骨重建，促進乳腺發(fā)育，T、B 細胞的早期分化，淋巴結(jié)形成，體溫調(diào)節(jié)等重要生理過程發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[1-2]。在乳腺中，RANKL 能夠以自分泌或旁分泌的方式影響乳腺上皮細胞的增殖分化及腺泡腔的形成過程[3-5]。研究表明RAN KL 缺陷會使妊娠期小鼠乳腺組織中乳腺上皮細胞增殖受到抑制、細胞凋亡增加、導(dǎo)管側(cè)枝和腺泡發(fā)育受損，從而導(dǎo)致分娩時泌乳過程受阻[6]。已有研究表明RAN KL 是催乳素（Prolactin, PR L）信號途徑重要的下游調(diào)節(jié)者，參與PR L 調(diào)節(jié)的乳腺組織發(fā)育過程。在體內(nèi)及體外PR L 都能夠誘導(dǎo)RANKL 的表達[7-8]。敲除研究表明PR LR 缺陷會導(dǎo)致RANKL 表達量下降，小鼠乳腺組織呈現(xiàn)出與RANKL/RANK 功能缺陷相同的表型[9]。而PR L 調(diào)控RANKL 表達的分子機制還未見報道。本研究以奶牛乳腺上皮細胞為實驗?zāi)Ｐ?，探索PR L 調(diào)節(jié)RANKL表達的分子機制，旨在進一步豐富和完善PR L 調(diào)控奶牛乳腺組織發(fā)育及泌乳的調(diào)控機理。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DM EM/F12 培養(yǎng)基粉末、0.25% T rypsin-EDTA，Gibco；Dual-Luciferase Reporter Assay System，Prom ega；RANKL 抗體、STAT 5a 抗體、p-STAT 5a 抗體，Cell Signaling Technology；Lipofectamine 2000，Invitrogen；Kpn Ι 和Bgl Ⅱ限制性內(nèi)切酶，Takara；CK-18 抗體，F(xiàn)ITC 標(biāo)記山羊抗兔二抗，Bioss；Pro lactin，Peprotech。

激光共聚焦掃描顯微鏡，德國Leica；PCR 儀、CO-150 型CO2細胞培養(yǎng)箱，美國Eppendorf；G lo－M ax 20/20 Luminom eter，Prom ega。

1.2 方法

1.2.1 乳腺上皮細胞分離培養(yǎng)及鑒定

取泌乳期荷斯坦奶牛健康新鮮乳腺組織，剔除多余脂肪和結(jié)締組織，采用酶消化法從組織中分離乳腺上皮細胞。將得到的原代乳腺上皮細胞培養(yǎng)在鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中，使用DM EM/F12 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 μg/m L 鏈霉素，100 U/m L 青霉素），37 ℃，5% CO2條件下，進行貼壁培養(yǎng)。使用胰蛋白酶對細胞傳代及純化處理，將純化后得到的乳腺上皮細胞進行CK-18 鑒定。

1.2.2 奶牛RANKL 啟動子雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建

采用DN A 提取試劑盒以奶牛乳腺上皮細胞中提取基因組DNA。以NCBI 數(shù)據(jù)庫提供的牛源RANKL基因啟動子序列為模板，采用Prim er 5 軟件設(shè)計引物并進行PCR 擴增，引物序列如表1 所示。將PCR 擴增得到的基因片段與PGL3-Basic 載體，分別使用KpnΙ 和BglⅡ限制性內(nèi)切酶進行雙酶切反應(yīng)。將酶切后DN A 片段與質(zhì)粒載體進行連接轉(zhuǎn)化，構(gòu)建重組PGL3質(zhì)粒，分別命名為：P-RAN KL-1428（L-1428）、PRAN KL-883（L-883）、P-RAN KL-239（L-239）、PRANKL-90（L-90）。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進行雙酶切及San-ger 測序驗證。

表1 RANKL 基因啟動子引物序列

1.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測

將乳腺上皮細胞接種在12 孔板中，細胞密度長至80%左右進行轉(zhuǎn)染處理。采用Lipo fectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑將PGL3-Basic（陰性對照）、PGL3-CM V（陽性對照）、L-1428、L-883、L-239、L-90 6 種質(zhì)粒與pR LTK 質(zhì)粒按照50∶1 的比例共轉(zhuǎn)染至乳腺上皮細胞中，具體實驗操作按照產(chǎn)品說明書進行。轉(zhuǎn)染6 h，在相應(yīng)組中添加PR L 處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用Dual-Luciferase R eporter Assay System 來檢測熒光素酶活性。

1.2.4 W estern Blot

采用R IPA 裂解液從處理后的乳腺上皮細胞中提取總蛋白，并使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒對蛋白濃度進行測定，具體操作按照產(chǎn)品說明書進行。每孔40 μg 總蛋白用10%SDS-PAGE 進行電泳，然后將其轉(zhuǎn)移到NC 膜上。將NC 膜用5%脫脂乳封閉2 h、37 ℃，用相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜。將NC 膜充分清洗后，HRP 標(biāo)記的二抗37 ℃孵育1 h。加入ECL發(fā)光液檢測蛋白條帶，并使用Im ageJ 對蛋白條帶進行分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用G raphpad Prism 8.0 對3 組獨立的實驗數(shù)據(jù)進行分析處理并作圖。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，“*”表示P< 0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異“**”表示P<0.01，有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異；“ns”表示P> 0.05，無統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳腺上皮細胞的鑒定

采用免疫熒光染色法對乳腺上皮細胞特異性標(biāo)志物角蛋白18（CK-18）進行鑒定，激光共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果如圖1 所示。圖中藍色物質(zhì)代表DAPI 染色的細胞核；綠色物質(zhì)則代表FITC 染色的CK-18。實驗結(jié)果表明，分離純化得到的細胞為奶牛乳腺上皮細胞。

圖1 奶牛乳腺上皮細胞CK-18 鑒定結(jié)果

2.2 PRL 對RANKL 蛋白表達的影響

1 μg/m L PR L 處理乳腺上皮細胞48 h，采用W estern Blot 方法檢測PRLR、p-STAT 5a 以及RANKL 蛋白水平變化，結(jié)果如圖2 所示。與對照組相比，PRL 能夠顯著提高PR LR、p-STAT 5a 以及RANKL蛋白的表達（P< 0.05），而STAT 5a 蛋白表達水平無顯著變化（P> 0.05）。

圖2 PRL 對RANKL 蛋白表達的影響

2.3 RANKL 啟動子雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建

采用KpnΙ 和BglⅡ限制性內(nèi)切酶對L-1428、L-883、L-239 及L-90 重組質(zhì)粒進行雙酶切驗證，結(jié)果如圖3 所示。電泳結(jié)果顯示，在預(yù)期位置都出現(xiàn)相應(yīng)大小的DNA 條帶，結(jié)果說明L-1428、L-883、L-239及L-90 雙熒光素酶載體構(gòu)建成功。

圖3 RANKL 啟動子雙熒光素酶載體雙酶切結(jié)果

2.4 PRL 對RANKL 啟動子活性的影響

將PGL3-Basic、PGL3-CM V、L-1428、L-883、L-239 及L-90 載體與pR L-TK 共轉(zhuǎn)染至乳腺上皮細胞中，轉(zhuǎn)染6 h 后，添加PR L 刺激，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后采用雙熒光素酶報告基因檢測RANKL 啟動子不同長度區(qū)段的熒光素酶活性，結(jié)果如圖4 所示。與對照組相比，PR L 處理后，L-1428 和L-883 啟動子活性顯著增加（P< 0.05），而L-239，L-90 啟動子活性無顯著變化（P> 0.05）。實驗結(jié)果表明在RANKL 基因啟動子在-883~ -239 bp 區(qū)段存在著PR L 響應(yīng)元件。

圖4 PRL 對RANKL 啟動子活性的影響

采用JASPAR 數(shù)據(jù)庫對RANKL基因啟動子-883~-239 bp 區(qū)域進行預(yù)測，在-826~-814 bp 位置存在GAS 位點（5′-GGTTCCTATAAGC-3′）。為驗證潛在的GAS 位點，采用定點突變的方法將該位點突變?yōu)?′- ATGATGATAGTCA-3′，構(gòu)建突變型L-883-M ut 熒光素酶載體。分別將野生型L-883-W t 和突變型L-883-M ut 載體轉(zhuǎn)染至乳腺上皮細胞中，轉(zhuǎn)染6 h后，添加PR L 刺激，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后采用雙熒光素酶報告基因檢測RANKL 啟動子熒光素酶活性，結(jié)果如圖5 所示。與對照組相比，PR L 能夠顯著增加野生型L-883-W t 啟動子活性（P< 0.05），而突變型L-883-M ut 對PR L 刺激無顯著變化（P> 0.05）。

圖5 PRL 對突變型RANKL 啟動子活性的影響

3 討論與結(jié)論

乳腺是一個動態(tài)發(fā)育器官，其發(fā)育過程主要發(fā)生在出生后[10]。新出生時乳腺組織中只有少量初步形態(tài)的導(dǎo)管，在甾體類激素、多肽類激素和一些細胞因子的控制下，乳腺組織逐漸發(fā)育完善[11-12]。PR L 是由垂體前葉催乳激素細胞分泌的多肽類激素，能夠促進乳腺發(fā)育生長，啟動且維持泌乳過程，并提高乳產(chǎn)量[13-15]。PR L 既能夠通過間接調(diào)控孕酮的分泌來調(diào)控乳腺導(dǎo)管分支，也能夠直接作用于乳腺上皮細胞，來促使腺泡結(jié)構(gòu)的形成[9]，因此在青春期及妊娠期，PR L 能夠以旁分泌、自分泌和內(nèi)分泌的形式調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子、細胞與細胞、細胞與細胞基質(zhì)的相互作用，從而控制著乳腺上皮細胞的增殖、乳腺導(dǎo)管延伸及分支和腺泡腔結(jié)構(gòu)的形成[14-16]。PR L 與其受體PR LR 是乳腺上皮細胞增殖分化以及腺泡腔形成的重要驅(qū)動力[17]。RAN KL 是乳腺上皮細胞增殖和分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，RANKL能夠促進乳腺上皮細胞增殖、存活及小葉腺泡發(fā)育過程，特別是腺泡發(fā)育后期所必需[18-19]。已有研究發(fā)現(xiàn)，RANKL 是PR L 途徑主要的下游信號分子，是PRL誘導(dǎo)乳腺發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控因子[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛乳腺上皮細胞中，PRL 能夠顯著提高RANKL 蛋白的表達。

轉(zhuǎn)錄因子STAT 5 在泌乳期乳腺組織中被首次發(fā)現(xiàn)，是PRL 途徑最重要的轉(zhuǎn)錄因子[20]。PR L 與其受體PR LR 結(jié)合引起受體二聚化，從而激活JAK 2，導(dǎo)致STAT 5 發(fā)生磷酸化[21-22]。一旦被激活，磷酸化的STAT 5蛋白分子會形成同源或者異源活性二聚體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞核，與靶基因啟動子區(qū)域GAS 位點結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄水平[23-25]。研究發(fā)現(xiàn)PR LR 和STAT 5a 是乳腺上皮細胞增殖分化所必需的[26-27]，STAT 5a 缺失會引起引起乳腺上皮細胞凋亡增加[28]。在乳腺組織中，STAT 5a不僅調(diào)節(jié)上皮細胞的增殖分化和存活[29]，還參與泌乳期乳蛋白的合成過程[30]，例如STAT 5a 直接調(diào)節(jié)β-casein啟動子活性來促進β-casein的表達。PR L 刺激引起STAT 5 被迅速招募到Cyclin D1啟動子區(qū)域，增強Cyclin D1啟動子活性[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)，PRL 刺激能夠顯著增加RANKL L-1428 和L-883 片段啟動子活性，而對L-239 和L-90 片段啟動子活性無影響。由此推測潛在PR L 響應(yīng)元件位于RANKL 基因啟動子-883~-239 bp 區(qū)域。早期研究也發(fā)現(xiàn)在小鼠內(nèi)源性RANKL啟動子中含有能夠被PR L 激活的GAS 位點[33]。本研究采用定點突變的方法證明在奶牛RAN KL 基因啟動子-826~-814 bp 位點存在一個GAS 位點，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核心區(qū)段，該位點能夠響應(yīng)PR L 刺激。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明在奶牛乳腺上皮細胞中，PRL 通過調(diào)控RANKL 啟動子活性，促進RANKL 的表達。該結(jié)果為PRL 參與奶牛乳腺組織發(fā)育及泌乳過程提供了理論基礎(chǔ)，進一步豐富和完善了PR L 在乳腺組織中的分子調(diào)控機制。