莫金樺，胡鴻，顏秋霞，李鵬東，陳彩蓉*

(廣州醫(yī)科大學附屬清遠醫(yī)院(清遠市人民醫(yī)院)1.生殖醫(yī)學中心;2.中心實驗室,清遠 511500)

卵巢早衰(premature ovarian failure,POF) 指40歲前出現(xiàn)卵巢功能衰竭,閉經(jīng)時間≥4個月、兩次月經(jīng)間隔>4周、卵泡刺激素(FSH)>40 U/L并伴有雌激素水平降低及絕經(jīng)癥狀,患者生育能力近乎喪失,嚴重影響身心健康和生活質(zhì)量,引發(fā)骨、心腦血管以及神經(jīng)系統(tǒng)等病變[1-3]。文獻報道,40歲以前POF發(fā)生率為1%,30歲以前發(fā)生率為1‰[4]。根據(jù)WHO的預(yù)測,全世界不孕癥的發(fā)病率日趨上升,將成為僅次于腫瘤、心腦血管病的第三大疾病[5]。隨著不孕癥發(fā)病率的日趨升高,POF作為女性不孕癥的主要原因之一,其發(fā)病人群將進一步增加[6]。然而,POF的病因及發(fā)病機制至今尚未完全闡明[7-8],其中包括遺傳因素、免疫因素、醫(yī)源性因素如手術(shù)及放化療等、環(huán)境因素,以及占半數(shù)以上的不明因素。目前對于POF的治療,主要包括補充雌激素及對不孕癥的治療,缺乏從根本上改善卵巢功能的治療方法[9]。鑒于此,關(guān)于POF疾病的基礎(chǔ)研究對臨床工作具有非常重要的意義,而動物模型是研究其病因、機制、治療的基礎(chǔ)。

目前常見的POF動物模型有化療藥物模型、基因敲除模型、半乳糖血癥模型和自身免疫性疾病模型等[10]。這些模型都側(cè)重于不同的病因?qū)W,均有著各自的獨特性和局限性,如基因敲除、半乳糖血癥和自身免疫疾病在臨床上發(fā)病率較低,缺乏代表性。隨著腫瘤發(fā)病的年輕化,化療所致的女性POF問題日益突出[11]。尤其對年輕未孕育女性,如何在化療時保護卵巢功能、如何恢復(fù)化療所致生育力損傷都是亟待解決的問題。環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)是一種常用的廣譜抗腫瘤藥和免疫抑制劑,具有嚴重的生殖毒性,使用CTX不同劑量及周期均可出現(xiàn)POF的典型表現(xiàn)[10];但是不同的劑量及停藥周期使模型的穩(wěn)定性存在一定偏差,且尚不清楚CTX在停藥后何時達到對卵巢功能損害之最,以及POF模型治療時間窗。本研究擬比較CTX不同造模劑量和停藥周期構(gòu)建的小鼠POF模型,探索制備小鼠POF的最佳劑量及停藥周期,為進一步研究POF提供更為適用的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

材料和方法

一、實驗材料

1.實驗動物:7周齡的C57BL/6雌性SPF小鼠購自廣東斯嘉景達生物科技有限公司[SCXK(粵) 2020-0052],體重(18±1)g,飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學附屬清遠醫(yī)院(清遠市人民醫(yī)院)實驗動物中心[SCXK(粵)2014-0082]。飼養(yǎng)條件為SPF級,溫度(22±2)℃,相對濕度50%～60%,自由飲食,每天光照時間12 h,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進行后續(xù)實驗。所有實驗操作均在該院醫(yī)學實驗中心進行,嚴格遵守實驗中心的規(guī)范要求,并得到動物倫理委員會的許可(批件號:LAEC-202208-032)。

2.主要試劑及儀器:環(huán)磷酰胺-水合物(CTX;貨號C0768,Sigma-Aidrich,美國);小鼠抗苗勒管激素ELISA Kit(貨號JYM0786M0)、小鼠卵泡刺激素ELISA Kit(貨號JYM0417M0)、小鼠雌二醇ELISA Kit(貨號JYM0379M0)均購自武漢基因美;多聚甲醛購自武漢賽維爾。電子天平(BCE2241-1CCN型,賽多利斯,德國);離心機(H1-16K型,湖南可成儀器);輪轉(zhuǎn)式切片機(RM2016型,上海徠卡);包埋機(JB-P5,武漢俊杰);相差顯微鏡(E200型,尼康,日本)。

二、實驗方法

1.實驗分組與造模:(1)CTX誘導(dǎo)POF模型最佳CTX暴露劑量:C57BL/6雌性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,使用相差顯微鏡觀察陰道涂片、記錄小鼠動情周期(圖1),將動情周期規(guī)律的40只小鼠隨機分成5組:CON、CTX80(80 mg·kg-1·d-1)、CTX100(100 mg·kg-1·d-1)、CTX120(120 mg·kg-1·d-1)、CTX150(150 mg·kg-1·d-1),每組8只,連續(xù)腹腔注射10 d,其中CON組注射生理鹽水,其余組注射CTX。記錄開始注射至停藥7 d內(nèi)小鼠的活力、毛發(fā)、體重、動情周期和卵巢臟器系數(shù),比較得出CTX誘導(dǎo)POF模型最佳CTX暴露劑量。

圖1 正常小鼠動情周期陰道涂片

(2)CTX誘導(dǎo)POF模型最佳CTX停藥周期:C57/BL6雌性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,將動情周期規(guī)律的小鼠使用最佳CTX暴露劑量重新造模,隨機分為模型組(24只)和對照組(24只),分別在停藥后第1、2、3、4周隨機選取6只小鼠,檢測其血清抗苗勒管激素(AMH)、FSH、E2水平,分析其卵巢臟器系數(shù),卵巢HE染色計數(shù)各級卵泡,比較得出CTX誘導(dǎo)POF模型最佳停藥周期。對照組分組記為:CON-1W、CON-2W、CON-3W和CON-4W;模型組分組記為:CTX-1W、CTX-2W、CTX-3W、CTX-4W。

2.體重變化與卵巢臟器系數(shù):自注射CTX開始,到試驗取材,記錄每只小鼠體重變化,觀察周期結(jié)束后,頸椎脫臼處死小鼠,取雙側(cè)卵巢組織進行稱重,拍照記錄。卵巢臟器系數(shù)=雙側(cè)卵巢質(zhì)量(g)/體重(g)×10 000()。

3.血清性激素檢測:自注射結(jié)束日為D0,分別于D7(1W)、D14(2W)、D21(3W)、D28(4W) 通過眼球摘除法取血,常溫靜置30 min,待血清析出,3 000 r/min離心15 min后取上清(血清),-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。血清收集完整?酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清E2、FSH、AMH的含量。

4.卵巢組織形態(tài)觀察與卵泡計數(shù):4%多聚甲醛溶液固定卵巢組織24 h,經(jīng)脫水、透明,卵巢最大平面石蠟包埋,5 μm切片,每隔10 μm取一張,每個組織取3張切片,常規(guī)HE染色后,每張切片全視野觀察卵巢的組織學變化及各級卵泡個數(shù),最終卵泡計數(shù)為3張切片計數(shù)之和除以3。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、模型小鼠一般情況比較

CTX150組小鼠自注射第3天開始出現(xiàn)明顯的進食減少、活力減退,第5天開始出現(xiàn)脫毛,其中2只小鼠分別于注射CTX第7天及停藥第2天死亡,由于CTX150組出現(xiàn)死亡,說明CTX 150 mg·kg-1·d-1劑量過大,不適合進行小鼠POF造模,后續(xù)部分結(jié)果不納入統(tǒng)計。CTX100組和CTX120組小鼠注射CTX第6天開始出現(xiàn)進食減少、活力減退和脫毛;而CTX80組小鼠在注射CTX后雖也出現(xiàn)進食減少、活力減退,但直至停藥后才開始出現(xiàn)脫毛。各組小鼠用藥前動情周期規(guī)律,約為4～5 d(圖1)。CTX暴露后,CTX80組小鼠仍有完整的動情周期,但延長至6～7 d,CTX120組和CTX100組小鼠則出現(xiàn)動情周期紊亂,在停止暴露的1周內(nèi)基本處于動情間期,少見動情后期(CTX100組有3只小鼠共出現(xiàn)4次動情后期,CTX120組僅1只小鼠出現(xiàn)1次動情后期),未見動情期,說明CTX 80組劑量不足,剔除該劑量小鼠POF造模。

二、各組小鼠體重和卵巢臟器系數(shù)比較

CTX150組注射CTX過程中小鼠體重下降最快。CTX其他組第4天開始小鼠體重均低于CON組,但第4～7 天差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),第8天開始CTX小鼠體重均顯著低于CON組(P<0.05),但各CTX組間無顯著差異(P>0.05);CTX小鼠體重在停藥后開始回升,且與CON組體重差逐漸減小,但至停藥第7天仍顯著低于CON組(P<0.05)(圖2A)。在停藥1周時各CTX組卵巢臟器系數(shù)顯著低于CON組(P<0.01),且CTX100最低(P<0.001),但各CTX組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),對比得出CTX100(100 mg·kg-1·d-1×10 d)是誘導(dǎo)卵巢早衰模型最佳CTX暴露劑量(圖2B)。

A:造模不同時期小鼠體重變化(第1～10天為藥物注射日,第11～17天為停藥后);B:停藥第7天時各組卵巢臟器系數(shù)比較情況。注:與CON組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

在研究最佳停藥周期時,模型組使用CTX 100 mg·kg-1·d-1×10 d的最佳劑量造模。隨停藥周期延長,模型組與對照組體重差逐漸減小,但到4W時模型組小鼠體重仍顯著低于對照組[(20.03±0.55)g vs.(21.38±1.29)g,P<0.01],而這種趨勢差異在卵巢質(zhì)量[(5.43±0.67)mg vs.(8.41±1.07)mg,P<0.001]和卵巢臟器系數(shù)[(2.71±0.31)vs.(3.92±0.70),P<0.001]同樣存在,說明CTX 100 mg·kg-1·d-1×10 d誘導(dǎo)的POF模型具有較好的穩(wěn)定性(表1)。模型組組內(nèi)比較時,相比1W,體重在2W、3W、4W增長,但只有在3W時差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而卵巢質(zhì)量和卵巢臟器系數(shù)僅在2W、3W時增長,4W時相對降低,但是只有卵巢質(zhì)量在3W時差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),展現(xiàn)出模型組體重和卵巢臟器系數(shù)并未隨停藥周期延長而出現(xiàn)明顯差異,同樣反映出較好的模型穩(wěn)定性(表1)。

表1 CTX不同停藥周期小鼠卵巢早衰模型參數(shù)比較(-±s)

三、血清性激素水平比較

模型組(CTX)小鼠在停止CTX暴露后的第1、2、3、4W,血清AMH、E2水平均顯著低于同期對照組(P<0.05),而FSH在第1、3、4W均顯著高于同期對照組(P<0.05),血清性激素水平符合POF模型特征(表2)。模型組組內(nèi)比較時,AMH水平隨停藥周期延長呈進行性下降趨勢,而FSH水平在3W、4W時顯著低于1W和2W(P<0.001),E2水平在3W、4W時顯著高于1W和2W(P<0.001),但是E2和FSH水平在1W和 2W間、3W 和 4W間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),呈現(xiàn)出隨停藥周期延長,小鼠血清E2和FSH開始出現(xiàn)一定程度回復(fù)、而AMH呈持續(xù)走低的狀態(tài)(表2)。

表2 CTX不同停藥周期小鼠性激素水平比較(-±s)

四、卵巢組織形態(tài)與卵泡計數(shù)

模型組在CTX停藥后的第1、2、3、4W卵巢組織肉眼可見的小于同期CON組(圖3)。模型組在CTX停藥后的第1、2、3、4W原始卵泡、初/次級卵泡均顯著低于同期CON組,第3、4W成熟卵泡計數(shù)均顯著低于同期CON組,而第1、2、4W的閉鎖卵泡計數(shù)均顯著高于同期CON組(P<0.05),符合POF特征表現(xiàn)。隨CTX停藥周期延長,模型組小鼠原始卵泡、初/次級卵泡、成熟卵泡計數(shù)呈進行性下降,閉鎖卵泡計數(shù)升高(P<0.05),展現(xiàn)出CTX對卵巢損傷呈進行性加重(圖4)。

紅色箭頭:對照組;黑色箭頭:模型組。每個卵巢組織代表1只小鼠。

A1～A4:對照組;B1～B4:模型組。1～4分別代表停藥后第1～4周。注:與同期對照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

討 論

隨著經(jīng)濟和醫(yī)學的發(fā)展,腫瘤和自身免疫疾病早期診斷率的升高,化療藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用,化療所致的女性POF問題日益突出[1]。POF增加了不孕癥發(fā)病率和退行性健康問題,如心血管疾病、骨質(zhì)疏松、抑郁焦慮和神經(jīng)認知障礙等,嚴重影響了生活質(zhì)量,使POF患者承受著心理、生理的雙重打擊[12-13]。但暫無針對POF有效的治療方法,需要進一步的動物模型和臨床研究去探索。目前POF建模方式多樣,操作復(fù)雜程度、模型穩(wěn)定性差異較大[10]。由于化療藥物造模具有造模時間短,操作簡單,穩(wěn)定性好且重復(fù)率高,在研究中較為常用。CTX是一種廣譜抗腫瘤藥和免疫抑制劑[14],是治療卵巢癌、乳腺癌、白血病、惡性淋巴瘤及自身免疫性疾病等常用的化療藥物,價格低廉,同時具有嚴重的生殖毒性,損傷顆粒細胞,引發(fā)POF[13],是誘導(dǎo)POF的最佳造模方式。但是當前CTX構(gòu)建小鼠POF模型方式各異,模型穩(wěn)定性有待探討。Nguyen等[15]用CTX 300 mg/kg單次靜脈注射,在24 h內(nèi)即可顯著消耗小鼠的原始卵泡,構(gòu)建POF模型,但是劑量過大,且與臨床周期化療不符;亦有腹腔注射CTX 120 mg·kg-1·d-1,連續(xù)2周,停止暴露后即可成模[16]。更多的研究者使用大劑量沖擊+后續(xù)小劑量維持的方法建模,如:CTX 200 mg/kg單次腹腔注射,后續(xù)8 mg·kg-1·d-1連續(xù)14 d的小劑量維持,以此構(gòu)建POF模型[17],但該類模型與臨床POF表現(xiàn)有待進一步考量。而Bahrehbar等[18]對比了白消安50 mg/kg+CTX 100 mg/kg連續(xù)10 d、CTX 100 mg/kg連續(xù)10 d、首次CTX 200 mg/kg +白消安50 mg/kg及后續(xù)9 d的CTX 50 mg/kg+白消安 5 mg/kg、單次CTX 200 mg/kg+白消安20 mg/kg,發(fā)現(xiàn)CTX 100 mg/kg連續(xù)10 d構(gòu)建小鼠POF成模最佳。多項研究發(fā)現(xiàn),在構(gòu)建小鼠POF模型時,使用CTX暴露天數(shù)各有不同[10,19]。本研究為提高造模成功率及減少暴露藥物劑量,選擇10 d作為暴露天數(shù)。目前,關(guān)于CTX誘導(dǎo)POF小鼠模型所用劑量和停藥周期的優(yōu)化組合,未見系統(tǒng)報道,且達到卵巢功能損害之最的最佳停藥周期亦不清楚。研究CTX誘導(dǎo)小鼠POF模型所用最佳造模劑量可提高模型穩(wěn)定性,而探討最佳停藥周期將對POF模型治療時間窗的確定具有重要意義。

本研究通過腹腔注射不同劑量的CTX,首先觀察小鼠的一般狀況,與CON組相比,各CTX組先后出現(xiàn)不同程度的毛發(fā)脫落、活動量減少、體重下降和動情周期紊亂。CTX150組造模過程中小鼠體重下降過快,最終出現(xiàn)小鼠死亡情況,說明CTX150劑量過大,不適合進行POF造模,故剔除出后續(xù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計。在停止CTX暴露后小鼠體重迅速回升,各CTX組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05),但至停藥1周各CTX組小鼠體重仍顯著低于CON組,說明CTX對小鼠的毒性損傷仍在持續(xù)。當前并未見CTX對卵巢功能損害最佳干預(yù)時間的系統(tǒng)性研究報道,這也是本研究后續(xù)探討CTX停藥周期的原因之一。與成年女性相似,小鼠陰道黏膜上皮細胞也可隨著體內(nèi)雌激素的變化而出現(xiàn)典型的動情周期,通過陰道涂片法可觀察出小鼠所處的動情周期,進而評估卵巢的功能變化[20]。CTX120和CTX100小鼠在停止暴露的1周內(nèi)未見動情期,說明較高劑量的CTX明顯損傷了卵巢功能,導(dǎo)致動情周期紊亂[21];然而CTX80仍存在完整的動情周期,說明CTX80劑量不足,故對比后得出CTX80并非最佳模型誘導(dǎo)劑量。卵巢是重要的生殖器官,卵巢臟器系數(shù)反映了雌鼠的生殖功能[22]。在停藥1周時,CTX100組卵巢臟器系數(shù)最低(P<0.001),但各CTX組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);再結(jié)合上文Bahrehbar等[18]的研究基礎(chǔ),以及考慮到盡量縮小藥物對實驗動物傷害的倫理要求,故在對比不同CTX劑量誘導(dǎo)POF小鼠模型效果后,得出以100 mg·kg-1·d-1連續(xù)暴露10 d作為CTX誘導(dǎo)小鼠POF模型的最佳造模劑量。

為進一步探討最佳停藥周期,本研究使用最佳環(huán)磷酰胺暴露劑量(100 mg·kg-1·d-1×10 d)重新造模進行后續(xù)研究。相比對照組,模型組小鼠在停止CTX暴露后的第1周AMH水平、E2水平、原始卵泡、初/次級卵泡、成熟卵泡計數(shù)均有所降低,而FSH水平、閉鎖卵泡計數(shù)均顯著升高(P<0.05),這與常規(guī)POF造模特性相符[12]。同樣的,在后續(xù)的第2、3、4W也呈現(xiàn)出類似的表現(xiàn)。卵巢臟器系數(shù)隨停藥的時間的延長呈現(xiàn)出第2W顯著升高(P<0.05),而從第3W開始下降,第4W低于第1W(表1),且更為客觀代表卵巢功能的各級卵泡計數(shù)也處于下降趨勢,這可能與卵巢組織的纖維增生有關(guān)[3],也從側(cè)面說明CTX對卵巢功能的損害具有持續(xù)性并進行性加重。結(jié)合血清性激素水平、卵巢臟器系數(shù)和卵巢病理,可以得出結(jié)論:使用CTX 100 mg/kg連續(xù)暴露10 d,對小鼠卵巢損害呈進行性加重,隨著停藥時間延長血清FSH出現(xiàn)一定程度下降和E2水平回升,但卵巢功能仍處于卵巢早衰狀態(tài),具有良好的模型穩(wěn)定性;考慮到干預(yù)治療時間窗,最佳成模時間為停藥后1周。

同時,我們發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象,血清E2在對照組和模型組的組內(nèi)比較顯示,1W和2W水平均顯著低于3W和4W(P<0.01),但1W和 2W間、3W和4W間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);且FSH也表現(xiàn)出類似情況(表2)。由于1W和2W在同一批次行ELISA檢測,而3W和4W在另一批次檢測,這種差異可能由檢測批次不同而造成,為消除這種偏倚,后續(xù)試驗中如需對同一指標進行統(tǒng)計對比,則最好在同一批次進行。再者,考慮到FSH由垂體前葉嗜堿性細胞分泌,AMH由竇前卵泡和竇卵泡的顆粒細胞合成、分泌[23],結(jié)合本研究小鼠血清AMH隨停藥周期延長呈進行性下降,在小鼠POF模型中評估激素標志物時,建議優(yōu)先使用AMH,次之FSH。Farzaneh等[24]對就診的96例患者測量血清AMH和FSH水平,發(fā)現(xiàn)與FSH相比,AMH的靈敏度更高(80% vs. 28.57%),特異性幾乎相同(78.89% vs. 78.65%)。此外,AMH(98.61%)和 FSH(87.5%)的陰性預(yù)測值也不同。但陽性預(yù)測值相同(17.39%)。得出AMH的診斷準確性高于FSH,AMH對POF的早期診斷更適用。顯然Farzaneh的研究結(jié)論也證實該現(xiàn)象,但仍須進一步研究佐證。本研究不足之處,未對模型組進行配種,驗證模型小鼠的生育能力和F1代的卵巢功能的影響,后續(xù)開展干預(yù)治療研究時應(yīng)同步進行。

綜上所述,本研究通過比較CTX不同造模劑量和停藥周期構(gòu)建的小鼠卵巢早衰動物模型,以100 mg·kg-1·d-1連續(xù)暴露10 d為CTX誘導(dǎo)小鼠POF模型的最佳造模劑量,最佳成模時間為停藥后1周。