唐心怡，曹志文，王曉瑩，周繼東，張陽，岳秋玲，姜瑞偉，李朝軍，顏桂軍，孫海翔*

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,南京 210008;2.南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)與子代健康全國重點實驗室,南京 211116)

子宮內(nèi)膜是女性生殖系統(tǒng)的重要組織器官,具有周期性重塑、蛻膜化和胚胎種植等生理功能,而這些關(guān)鍵生理功能需要該組織的細(xì)胞在間質(zhì)和上皮表型之間轉(zhuǎn)換[1-2],這一過程被稱為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)或間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-epithelial transition,MET)。其中,MET主要參與子宮內(nèi)膜的周期性重塑與蛻膜化過程,而EMT主要參與胚胎著床過程[1,3]。在胚胎種植過程中發(fā)生的EMT,使子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞獲得細(xì)胞間黏附減少、遷移能力增加的間充質(zhì)特征,有利于胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲[4]。然而,由于倫理和技術(shù)等方面的限制,目前關(guān)于子宮內(nèi)膜的EMT研究主要為體外實驗[5],尚無動物實驗證據(jù)證明子宮內(nèi)膜在胚胎種植過程能夠發(fā)生EMT。因此,用動物模型證明該過程中EMT的發(fā)生,尤其是找到上皮細(xì)胞EMT后成為間質(zhì)細(xì)胞的直接形態(tài)學(xué)證據(jù),對于這一領(lǐng)域的研究具有重大意義。

譜系追蹤技術(shù)是一種用于追蹤和分析細(xì)胞增殖分化過程中細(xì)胞譜系的方法。通過引入遺傳標(biāo)記物(如熒光基因)對特定細(xì)胞群進行標(biāo)記,隨著細(xì)胞的增殖與分化,這些標(biāo)記物會被傳遞給后代細(xì)胞,因此可根據(jù)遺傳標(biāo)記物的存在判斷細(xì)胞的譜系來源。本研究擬構(gòu)建LtfcreRosa26mT/mG小鼠用于研究胚胎種植過程中的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的EMT行為,利用譜系追蹤技術(shù)尋找子宮內(nèi)膜中上皮細(xì)胞EMT后轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的直接形態(tài)學(xué)證據(jù),并進一步探究圍著床期與激素刺激下子宮內(nèi)膜EMT的變化情況。

材料與方法

一、實驗動物

本研究中使用的Rosa26mT/mG(Rosa26KI/KI)小鼠由廈門大學(xué)王海濱教授團隊贈與,Ltf-Cre(LtfCre/WT)小鼠由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蘇仁偉教授團隊贈與。實驗(不包括繁育過程)共使用可育雄鼠12只,LtfcreRosa26mT/mG雌鼠36只,其中21 d雌鼠3只,6周齡雌鼠3只,8周齡雌鼠30只。所有小鼠均飼養(yǎng)于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院動物房,飼養(yǎng)環(huán)境溫度為19～22℃,相對濕度40%～70%,采用12 h明/暗光照循環(huán)(7:00—19:00),自由飲水和進食,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進行下一步實驗。所有動物實驗均在江蘇省實驗動物管理委員會指導(dǎo)下進行,并經(jīng)南京鼓樓醫(yī)院實驗動物倫理委員會(SYXK 2021-0509)批準(zhǔn)。

二、實驗試劑

雌二醇(E2,E2758)、孕酮(P4,P0130)、芝麻油(S3547)均購自美國Sigma-Aldrich公司;兔抗E-Cadherin單抗(3195S)購自美國CST公司;兔抗Vimentin多抗(BS1855)購自美國Bioworld公司;兔抗CD45多抗(ab10558)和驢抗兔Alexa Fluor647熒光二抗(ab150075)均購自英國Abcam公司;PCR試劑盒(P213-01)購自南京諾維贊公司,PCR引物由南京金斯瑞公司合成。

三、實驗方法

1.LtfcreRosa26mT/mG小鼠的配繁與鑒定:將P0代Rosa26mT/mG(Rosa26KI/KI)小鼠和P0代Ltf-Cre(LtfCre/WT)小鼠雜交,P1代中50%為LtfCre/WTRosa26KI/WT小鼠,50%為LtfWT/WTRosa26KI/WT小鼠。通過P1代LtfCre/WTRosa26KI/WT小鼠與P0代Rosa26KI/KI小鼠再次雜交,P2代中25%為LtfCre/WTRosa26KI/KI小鼠,即LtfCreRosa26mT/mG小鼠。繁育過程中,通過鼠尾PCR方法鑒定小鼠基因型。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s,61℃退火30 s,72℃延伸45 s,共35個循環(huán);72℃進一步延伸10 min。引物及序列見表1。

表1 引物及序列

2.胚胎種植時間點小鼠收樣:6:00 pm將12只8周齡的LtfcreRosa26mT/mG雌鼠與12只可育雄鼠按1∶1合籠,次日8:00 am檢查雌鼠陰道及陰道口周圍,若見到白色陰栓,則判定雌雄鼠交配,當(dāng)天上午記為0.5 dpc(0.5 day post copulation),在2.5 dpc、3.5 dpc、4.0 dpc或4.5 dpc時處死小鼠,取出小鼠子宮,液氮速凍后保存于-80℃。每個時間點取3只小鼠進行實驗。

3.雌孕激素序貫刺激造模:15只8周齡的雌性LtfcreRosa26mT/mG小鼠分為5組(每組3只),進行卵巢切除手術(shù)。術(shù)后休息2周后,處死第1組小鼠,記為“卵巢切除術(shù)后2周”組;剩余4組小鼠連續(xù)3 d皮下注射50 μl含有100 ng E2的芝麻油,第三次注射E2后6 h后處死第2組小鼠,記為“E2后6 h”組,2 d后處死第3組小鼠,記為“E2后休息2 d”組;剩余2組小鼠連續(xù)2 d皮下注射50 μl含有1 mg P4、10 ng E2的芝麻油,第二次注射P4+ E2后6 h處死第4組小鼠,記為“P4后6 h”組,剩余1組小鼠休息5 d后處死,記為“P4后休息5 d”組。小鼠處死后快速收取子宮組織,液氮速凍后保存于-80℃。具體造模與收樣方法見圖4A。

4.組織冰凍切片與染色:待測組織離體后去除表面多余水分,經(jīng)液氮冷凍后,進行冰凍切片(厚度為10 μm);37℃烤片3 min,隨后使用4% PFA/PBS室溫避光固定15 min;PBS洗3遍,每次5 min;山羊血清室溫封閉1 h后,一抗(1∶500稀釋)4℃避光孵育過夜,PBS洗3遍,每次5 min;二抗(1∶500稀釋)室溫避光孵育1 h,PBS洗3遍,每次5 min;DAPI室溫避光染色10 min,PBS洗3遍,每次5 min;抗淬滅劑封片,熒光顯微鏡拍照。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、LtfcreRosa26mT/mG小鼠模型驗證

為了驗證LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的重組效率,以及確定開始重組、完成重組的時間,我們收集了出生后21 d、6周齡、8周齡的雌性LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮組織進行冰凍切片,熒光顯微鏡下鏡檢。結(jié)果顯示,出生后21 d的小鼠子宮內(nèi)膜未見EGFP綠色熒光,證明該模型鼠不存在胚胎期Cre酶表達(dá)(圖1B),用于譜系追蹤研究時不會受到胚胎發(fā)育過程信號的干擾。在6周時,僅部分上皮細(xì)胞表現(xiàn)出EGFP熒光,而在8周小鼠完全性成熟后,所有上皮細(xì)胞均表現(xiàn)出EGFP熒光。此外,間質(zhì)中也存在零星分布帶EGFP熒光的細(xì)胞(圖1C)。

A:LtfcreRosa26mT/mG小鼠模型構(gòu)建圖;B:出生21 d后LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮冰凍切片熒光染色(5×);C:6周齡與8周齡LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮冰凍切片熒光染色(10×、20×)。

二、性成熟后LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮內(nèi)膜中存在由上皮細(xì)胞EMT形成的間質(zhì)細(xì)胞

收集8周齡的雌性LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮組織進行冰凍切片,分別與上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞的標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin、CD45共染后,confocal鏡下觀察,間質(zhì)中零星分布的EGFP+細(xì)胞中無E-cadherin+細(xì)胞,部分為CD45+的免疫細(xì)胞,部分為Vimentin+的間質(zhì)細(xì)胞,這部分Vimentin+EGFP+細(xì)胞即為由上皮細(xì)胞EMT形成的間質(zhì)細(xì)胞(圖2)。

子宮切片分別與E-cadherin、Vimentin、CD45共染,confocal成像(20×)。

三、胚胎圍著床期LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮內(nèi)膜間質(zhì)EGFP熒光變化情況

為了探究胚胎種植過程中子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞EMT的變化情況,以見栓當(dāng)日上午為0.5 dpc,我們收集了2.5 dpc、3.5 dpc、4.0 dpc、4.5 dpc的LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮進行冰凍切片(圖3A),并計數(shù)間質(zhì)中EGFP+細(xì)胞個數(shù),發(fā)現(xiàn)在3.5 dpc間質(zhì)中EGFP+細(xì)胞個數(shù)顯著降低(P<0.01)(圖3B)。

A:圍著床期不同時間點LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮冰凍切片熒光染色(20×);B:20×視野下胚胎圍著床期EGFP+間質(zhì)細(xì)胞計數(shù)。注:與2.5 dpc比較,**P<0.01;與3.5 dpc比較,##P<0.01。

四、LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮內(nèi)膜間質(zhì)EGFP+細(xì)胞受激素調(diào)控明顯

為了探究激素水平與子宮內(nèi)膜上皮EMT的相關(guān)性,我們利用LtfcreRosa26mT/mG小鼠建立了雌孕激素序貫刺激模型(圖4A)。分別收集不同時間點的LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮內(nèi)膜進行冰凍切片(圖4B),計數(shù)間質(zhì)中EGFP+細(xì)胞數(shù)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)E2刺激后間質(zhì)中EGFP+細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05),E2刺激休息2 d后間質(zhì)中EGFP+細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05),P4刺激后間質(zhì)中EGFP+細(xì)胞數(shù)量又顯著降低(P<0.05)(圖4C)。

A:雌孕激素序貫刺激模型構(gòu)建圖;B:雌孕激素序貫刺激不同時間點 LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮冰凍切片熒光染色(20×);B:20×視野下胚胎圍著床期EGFP+間質(zhì)細(xì)胞計數(shù)。注:與卵巢切除術(shù)后2周比較,*P<0.05;與E2后6 h組比較,#P<0.05;與E2后休息2 d組比較,ΔP<0.05。

討 論

在本研究中,我們構(gòu)建了LtfcreRosa26mT/mG上皮特異性譜系追蹤小鼠模型,首次在子宮內(nèi)膜中找到了上皮細(xì)胞EMT形成的間質(zhì)細(xì)胞,獲得了子宮內(nèi)膜EMT的直接形態(tài)學(xué)證據(jù)。并且我們發(fā)現(xiàn),8周齡性成熟的LtfcreRosa26mT/mG小鼠在未交配、無胚胎存在時,子宮內(nèi)膜中已經(jīng)存在由上皮細(xì)胞EMT形成的間質(zhì)細(xì)胞,說明EMT可能不僅僅發(fā)生在胚胎種植過程中。在圍胚胎著床期,我們發(fā)現(xiàn)3.5 dpc的LtfcreRosa26mT/mG小鼠間質(zhì)中EGFP+細(xì)胞個數(shù)顯著降低,而此時胚胎進入子宮但尚未開始種植,并且母體處于雌激素水平的高峰,因此我們認(rèn)為激素水平對EMT可能存在影響,進一步研究雌孕激素對EMT的作用。在雌孕激素序貫?zāi)Ｐ椭?我們發(fā)現(xiàn)LtfcreRosa26mT/mG小鼠在E2刺激后間質(zhì)中EGFP+

細(xì)胞數(shù)量顯著降低,E2刺激休息2 d后間質(zhì)中EGFP+細(xì)胞數(shù)量顯著增加,P4刺激后間質(zhì)中EGFP+細(xì)胞數(shù)量又顯著降低,提示雌孕激素均能快速抑制子宮內(nèi)膜EMT,而雌激素的撤退能夠促進子宮內(nèi)膜EMT。

EMT是一系列引起細(xì)胞從上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的生物過程的總稱[6]。上皮細(xì)胞通常具有頂-底極性,呈多角形,底面連接基膜,細(xì)胞間連接豐富,運動遷徙能力很弱;而間質(zhì)細(xì)胞一般為長梭形,具有多極性,細(xì)胞間連接較少,可以通過細(xì)胞膜形成的偽足在細(xì)胞外基質(zhì)間移動,具有較強的遷移和侵襲能力,并且能夠產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)[1]。根據(jù)EMT發(fā)生的場景和行使的功能,可將其分為三類[6]。I型EMT在胚胎種植、胚胎和器官發(fā)育過程中出現(xiàn),過程既不產(chǎn)生纖維化,也沒有經(jīng)脈管系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移行為;Ⅱ型EMT在傷口愈合、組織再生、器官纖維化過程中出現(xiàn),常常是損傷性修復(fù)的結(jié)果,往往伴隨著炎性反應(yīng);Ⅲ型EMT發(fā)生于腫瘤細(xì)胞,導(dǎo)致腫瘤的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6]。本研究聚焦I型EMT過程,即胚胎種植過程中的EMT現(xiàn)象。

胚胎種植是指胚胎嵌入母體子宮壁的過程,是哺乳動物妊娠的關(guān)鍵步驟之一[7]。在胚胎發(fā)育過程中,囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞表現(xiàn)出上皮的特性,包括表達(dá)E-Cadherin等上皮特征性分子、具有頂-底極性、附著于基底膜、側(cè)壁與周圍細(xì)胞較為穩(wěn)定的細(xì)胞連接等[1]。而在進入子宮,與子宮內(nèi)膜相互作用以完成胚胎種植的過程中,滋養(yǎng)層細(xì)胞逐漸失去上皮表型,細(xì)胞連接消失、頂-底極性減弱、細(xì)胞骨架重塑、遷移能力增強[8],轉(zhuǎn)化為移動性、侵襲性更強的間充質(zhì)表型,即發(fā)生了EMT[9]。子宮內(nèi)膜上皮層作為與胚胎最先發(fā)生接觸的母體部位,相應(yīng)地也發(fā)生EMT過程,以適應(yīng)和促進胚胎的侵入過程。EMT過程受損,將會引起胚胎種植失敗[4]。EMT的時間和程度受到嚴(yán)格調(diào)控,過度的EMT會引起癌癥,而EMT不足將引起胎兒生長受限、子癇前期等妊娠期并發(fā)癥[10]。

目前大量體外實驗提示了胚胎種植過程中EMT的存在,但尚缺少動物實驗的結(jié)果,因此為了獲得子宮內(nèi)膜EMT的直接形態(tài)學(xué)證據(jù),我們以Rosa26mT/mG小鼠為基礎(chǔ),通過Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)建立模型小鼠,進行譜系追蹤研究。Rosa26是一個位于小鼠6號染色體的非編碼基因,在大部分組織和細(xì)胞中都有表達(dá),是常用的插入外源基因表達(dá)的安全位點。Rosa26mT/mG小鼠的Rosa26基因中,插入的tdTomato(mT) 盒兩側(cè)具有 loxP 位點,其后具有終止密碼子,無Cre重組酶存在時使細(xì)胞表達(dá)tdTomato紅色熒光,在表達(dá)Cre重組酶的組織中敲除了mT盒及其后的終止密碼子,允許位于下游的EGFP(mG) 盒表達(dá),使細(xì)胞呈現(xiàn)EGFP綠色熒光,而不表達(dá)Cre重組酶的組織仍然呈現(xiàn)出tdTomato紅色熒光。目前已有的標(biāo)記上皮的Cre體系包括Wnt7a-Cre、Sprr2f-Cre和Ltf-Cre[11]。其中,Sprr2f-Cre在小鼠子宮上皮中引起的loxP重組并不均勻,僅有部分上皮細(xì)胞完成重組[12]。而Wnt7a在子宮發(fā)育過程具有重要功能,Wnt7a-Cre的重組發(fā)生在子宮完全成熟之前,不適合用于成年后生育相關(guān)的譜系追蹤研究[13]。Ltf-Cre雖然存在著免疫細(xì)胞表達(dá)的問題[14],但在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中重組較為均勻、穩(wěn)定,且在出生后性成熟時期才開始表達(dá),是研究子宮內(nèi)膜EMT的最適重組系統(tǒng)[11]。因此,我們選擇構(gòu)建LtfcreRosa26mT/mG小鼠用于研究胚胎種植、激素作用過程中的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的EMT行為。通過將LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮冰凍切片與E-cadherin、Vimentin、CD45共染結(jié)合激光掃描共聚焦熒光顯微鏡,我們成功找到了上皮細(xì)胞EMT形成的間質(zhì)細(xì)胞,獲得了子宮內(nèi)膜EMT的直接形態(tài)學(xué)證據(jù),對女性生殖系統(tǒng)的EMT研究具有重大意義。

研究表明,小鼠著床部位存在EMT相關(guān)蛋白的改變,包括N-cadherin上調(diào)、E-cadherin和細(xì)胞角蛋白下調(diào),而假孕小鼠中未觀察到這一現(xiàn)象,提示EMT可能僅發(fā)生在胚胎植入時[4]。然而,本研究表明,8周齡性成熟的LtfcreRosa26mT/mG小鼠在未交配、無胚胎存在時,子宮內(nèi)膜已經(jīng)存在由上皮細(xì)胞EMT形成的間質(zhì)細(xì)胞,說明EMT可能不僅僅發(fā)生在胚胎植入時期,提示EMT可能參與子宮內(nèi)膜的其他功能,需要進一步深入研究。

雌激素和孕激素是胚胎種植成功的必要因素[15]。雌孕激素可通過下調(diào)E-cadherin、上調(diào)N-cadherin和Vimentin進而誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系Ishikawa細(xì)胞發(fā)生EMT,并增加人絨毛膜癌細(xì)胞系JAR球體的黏附與Ishikawa細(xì)胞的遷移能力[16]。雌激素受體β的拮抗劑PHTPP可以逆轉(zhuǎn)雌二醇在EMT中的作用[17]。濃度在0.1至10 μmol/L之間的雌激素可以調(diào)節(jié)EMT相關(guān)因子和肌動蛋白的重組,并增加子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的遷移和侵襲性[18]。雌二醇還通過上調(diào)MALAT1和下調(diào)miR200s表達(dá)在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)EMT,而MALAT1缺失或miR200c過度表達(dá)可顯著抑制雌二醇介導(dǎo)的EMT[17]。另一方面,孕酮在EMT誘導(dǎo)中的作用尚未得到證實[19-20]。在本研究中,我們利用LtfcreRosa26mT/mG小鼠建立了雌孕激素序貫刺激模型,發(fā)現(xiàn)E2刺激后間質(zhì)中EGFP+細(xì)胞數(shù)量顯著降低,E2刺激后休息2 d后間質(zhì)中EGFP+細(xì)胞數(shù)量顯著增加,P4刺激后間質(zhì)中EGFP+細(xì)胞數(shù)量又顯著降低,提示在體內(nèi)實驗中,雌孕激素均能快速抑制子宮內(nèi)膜EMT,雌激素的撤退能夠促進子宮內(nèi)膜EMT,這與體外實驗的結(jié)果矛盾,其原因可能在于動物體內(nèi)細(xì)胞類型的復(fù)雜性和激素響應(yīng)的延遲性,需要進一步深入研究。

鑒于EMT在成功植入中的重要性,通過藥物或其他治療手段調(diào)節(jié)EMT過程為提高輔助生殖技術(shù)的臨床妊娠率提供了新的思路。一些研究表明,表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)可能是介導(dǎo)雌激素誘導(dǎo)EMT的中間調(diào)控分子[21],在人類早期妊娠細(xì)胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)物中添加EGF可使這些細(xì)胞的侵襲性增加數(shù)倍。這種生長因子增強人類細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲的可能機制之一是增加細(xì)胞的運動性,這是與EMT過程相關(guān)的一個特定特征[22]。此外,據(jù)報道,單側(cè)宮內(nèi)輸注EGF加靜脈注射EGF可增加大鼠子宮的胚胎著床數(shù)量[23]。然而,迄今為止的大部分臨床研究都集中在子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志物上,對于EMT支持和增加胚胎著床的意義關(guān)注較少。因此,開發(fā)針對EMT相關(guān)信號分子的治療策略可能是提高臨床胚胎植入率的重要研究方向。

綜上所述,通過構(gòu)建LtfcreRosa26mT/mG小鼠進行譜系追蹤研究,我們首次在子宮內(nèi)膜中找到了上皮細(xì)胞EMT形成的間質(zhì)細(xì)胞,獲得了子宮內(nèi)膜EMT的直接形態(tài)學(xué)證據(jù)。另外,我們探究了圍胚胎著床期和雌孕激素序貫刺激對LtfcreRosa26mT/mG小鼠子宮內(nèi)膜中EMT的影響,發(fā)現(xiàn)EMT可能不僅僅發(fā)生在胚胎植入時期,EMT可能參與子宮內(nèi)膜的其他功能并受到雌孕激素的嚴(yán)格調(diào)控,需要后續(xù)進一步深入研究。