袁振亞，袁牧，朱云霞，宋雪梅，林繼慧

(徐州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心,徐州 221009)

反復(fù)種植失敗(repeated implantation failure,RIF)是人類(lèi)輔助生殖技術(shù)(ART)從業(yè)者面臨的一大難題,在IVF-ET中的發(fā)生率約為10%[1]。多次移植失敗不僅會(huì)浪費(fèi)珍貴的胚胎,還會(huì)增加患者的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,探究RIF發(fā)生的影響因素、改善RIF患者IVF結(jié)局成為了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

子宮內(nèi)膜對(duì)于胚胎的最佳容受時(shí)期稱(chēng)為種植窗(window of implantation,WOI)。WOI發(fā)生偏移是RIF發(fā)生的重要因素之一[1-2]。通過(guò)子宮內(nèi)膜容受性檢測(cè)(endometrial receptivity testing,ERT)技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組標(biāo)記物進(jìn)行下一代測(cè)序(next-generation sequencing,NGS),可精確判斷RIF患者WOI具體時(shí)期,幫助及時(shí)調(diào)整移植策略,在WOI植入胚胎,可顯著改善RIF患者的移植結(jié)局[3-4]。2018年中國(guó)《胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查技術(shù)專(zhuān)家共識(shí)》指出,RIF是胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(preimplantation genetic testing,PGT)的重要指征之一[5],應(yīng)用PGT可顯著改善RIF患者的移植結(jié)局[6-7]。然而,仍有部分RIF患者接受ERT評(píng)估或接受PGT后無(wú)法獲得成功妊娠。目前,國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)ERT與PGT技術(shù)聯(lián)用的報(bào)道。為探究ERT與PGT技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的效果,本研究對(duì)聯(lián)用ERT與PGT技術(shù)的RIF患者的凍融胚胎移植(FET)周期進(jìn)行了回顧分析,為尋找新的RIF治療方法提供參考依據(jù)。

資料和方法

一、研究對(duì)象

本研究選取2018年1月至2023年1月在徐州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心接受FET的RIF患者。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患者符合本中心RIF的診斷標(biāo)準(zhǔn)(移植3次及以上均失敗或移植了高評(píng)分卵裂期胚胎數(shù)4～6個(gè)或高評(píng)分囊胚數(shù)3個(gè)及以上均失敗的患者)[5];(2)FET采用激素替代方案進(jìn)行內(nèi)膜準(zhǔn)備;(3)每個(gè)FET周期移植1枚囊胚。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)前次FET或自然受孕有異位妊娠史;(2)FET前子宮內(nèi)膜厚度小于7 mm;(3)男方患有嚴(yán)重畸精子癥(正常形態(tài)精子比例小于1%);(4)男方精子DNA碎片率大于30%;(5)患者宮腔解剖學(xué)異常(如粘連、子宮畸形等);(6)患者患有多囊卵巢綜合征;(7)患者患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病。

共納入了符合標(biāo)準(zhǔn)的RIF患者的730個(gè)FET周期,根據(jù)患者接受的評(píng)估檢測(cè)不同分成4組:僅接受PGT的FET周期為PGT組(n=121),僅接受ERT評(píng)估的FET周期為ERT組(n=147),接受ERT后移植PGT周期整倍體囊胚的FET周期為聯(lián)用組(n=138),同期未接受PGT與ERT的FET周期為RIF組(n=324)。

本研究通過(guò)了徐州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的倫理審查批準(zhǔn)(批件號(hào):[2023]生殖倫審第(01)號(hào))。

二、研究方法

1.ERT評(píng)估模型:中南大學(xué)湘雅醫(yī)院和江蘇億康基因科技有限公司合作開(kāi)發(fā)了ERT技術(shù)(專(zhuān)利號(hào):201910324707.0),構(gòu)建了子宮內(nèi)膜容受期及非容受期的轉(zhuǎn)錄組模型。采集受試者的子宮內(nèi)膜樣本,提取mRNA進(jìn)行高通量測(cè)序,獲得受試者的子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)代入模型進(jìn)行分析,可精準(zhǔn)地判斷受試者的WOI是否發(fā)生偏移,并推算出具體的WOI。

2.激素替代方案(HRT)及內(nèi)膜準(zhǔn)備:月經(jīng)第2天,全部患者使用長(zhǎng)效促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a,珠海麗珠)3.75 mg/次 1次/d,使用28 d后開(kāi)始雌二醇(雅培,荷蘭)4～6 mg/d連用14 d。當(dāng)內(nèi)膜厚度達(dá)到7.5 mm及以上時(shí),全部患者使用90 mg/d黃體酮陰道緩釋凝膠(默克雪蘭諾,英國(guó))、10 mg地屈孕酮(達(dá)芙通;雅培,荷蘭)每日口服2次,共轉(zhuǎn)化5 d。轉(zhuǎn)化第6天PGT組和RIF組停用黃體酮和地屈孕酮進(jìn)行FET;ERT組和聯(lián)用組停用黃體酮和地屈孕酮,接受ERT評(píng)估,在有明確ERT評(píng)估結(jié)果后,ERT組和聯(lián)用組再次進(jìn)行HRT,根據(jù)ERT結(jié)果調(diào)整使用黃體酮和地屈孕酮的轉(zhuǎn)化時(shí)長(zhǎng)后再行FET。

3.ERT評(píng)估:在ERT組、聯(lián)用組患者黃體酮轉(zhuǎn)化第6天使用一次性子宮內(nèi)膜樣本采樣器(蘇州序康醫(yī)療科技)伸入宮腔抽吸約3 mm大小的活檢樣本,推入RNA樣本保存液(蘇州序康醫(yī)療科技)4℃保存;使用RNeasy Micro Kit試劑盒(Qiagen,德國(guó))進(jìn)行mRNA提取,使用MALBAC白金微量 RNA 擴(kuò)增試劑盒(蘇州億康基因科技)進(jìn)行RNA擴(kuò)增,使用NGS 通用 Index 試劑盒(Illumina,美國(guó))和Miseq基因測(cè)序儀(Illumina,美國(guó))進(jìn)行mRNA測(cè)序;將測(cè)序結(jié)果代入子宮內(nèi)膜容受期模型,推算患者WOI,調(diào)整FET時(shí)間。PGT組、RIF組不進(jìn)行此步驟。

4.囊胚PGT:對(duì)PGT組和聯(lián)用組第5、6天的囊胚外滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行活檢,對(duì)活檢產(chǎn)物使用胚胎植入前染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒(北京中儀康衛(wèi))進(jìn)行全基因組擴(kuò)增,使用 Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)(Illumina,美國(guó))進(jìn)行NGS。數(shù)據(jù)下機(jī)后完成測(cè)序質(zhì)控,進(jìn)行生物信息學(xué)分析,獲得受檢囊胚遺傳學(xué)檢測(cè)信息,篩選整倍體囊胚進(jìn)行FET。ERT組、RIF組不進(jìn)行此步驟。

5.囊胚移植:在黃體酮轉(zhuǎn)化第6天,對(duì)RIF組實(shí)施囊胚移植;根據(jù)ERT評(píng)估結(jié)果調(diào)整移植時(shí)間,在WOI內(nèi)對(duì)ERT組實(shí)施囊胚移植;篩選整倍體囊胚,根據(jù)ERT評(píng)估結(jié)果調(diào)整移植時(shí)間,在WOI內(nèi)對(duì)聯(lián)用組實(shí)施囊胚移植;篩選整倍體囊胚,對(duì)PGT組實(shí)施囊胚移植。

三、觀察指標(biāo)

各組患者基礎(chǔ)資料,包括女方年齡、男方年齡、不孕年限、不育年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)激素水平;FET相關(guān)資料,包括移植日內(nèi)膜厚度、胚胎種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%、HCG陽(yáng)性率=HCG陽(yáng)性FET周期數(shù)/FET周期數(shù)×100%、宮內(nèi)妊娠率=宮內(nèi)妊娠FET周期數(shù)/FET周期數(shù)×100%、異位妊娠率=異位妊娠FET周期數(shù)/FET周期數(shù)×100%、流產(chǎn)率=流產(chǎn)FET周期數(shù)/獲宮內(nèi)妊娠FET周期數(shù)×100%、活產(chǎn)率=活產(chǎn)分娩周期數(shù)/FET周期數(shù)×100%;ERT組患者WOI偏移率=ERT組WOI偏移患者數(shù)/ERT組患者數(shù)×100%;聯(lián)用組患者WOI偏移率=聯(lián)用組WOI偏移患者數(shù)/聯(lián)用組患者數(shù)×100%;接受ERT評(píng)估的患者WOI偏移率(ERT組與聯(lián)用組WOI偏移患者數(shù)/ERT組與聯(lián)用組患者數(shù)×100%)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、患者一般資料

本研究共納入了符合標(biāo)準(zhǔn)的患者的730個(gè)FET周期,其中PGT組121周期(n=121),ERT組147周期(n=147),聯(lián)用組138周期(n=138),RIF組324周期(n=324)。

患者一般資料的分析結(jié)果顯示,各組間的女方年齡、男方年齡、不孕年限、不育年限、BMI、基礎(chǔ)激素水平[卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、泌乳素(PRL)及黃體生成素(LH)]均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 患者一般資料[(-±s),M(P25,P75)]

二、ERT組和聯(lián)用組的ERT評(píng)估結(jié)果

接受ERT評(píng)估的ERT組和聯(lián)用組共285個(gè)周期,其中273個(gè)周期出現(xiàn)了WOI后移,即在常規(guī)內(nèi)膜準(zhǔn)備情況下,按月經(jīng)周期推算出的最佳移植時(shí)期實(shí)際為容受前期,實(shí)際的WOI較常規(guī)WOI推后1～2 d,接受ERT評(píng)估的患者WOI偏移率達(dá)到了95.79%(273/285)。ERT組WOI偏移率達(dá)到了96.60%(142/147);聯(lián)用組WOI偏移率達(dá)到了94.93%(131/138)。

三、各組FET周期臨床結(jié)局比較

PGT組、ERT組、聯(lián)用組和RIF組移植優(yōu)質(zhì)囊胚占比分別為89.26%(108/121)、85.71%(126/147)、87.68%(121/138)和83.95%(272/324),組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。各組移植當(dāng)日的內(nèi)膜厚度、異位妊娠率、流產(chǎn)率也均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表2)。

表2 患者FET周期結(jié)局[(-±s),%]

聯(lián)用組的胚胎種植率、宮內(nèi)妊娠率、活產(chǎn)率均顯著高于其余3組(P<0.05);聯(lián)用組的HCG陽(yáng)性率顯著高于PGT組與RIF組(P<0.05),雖高于ERT組,但差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);PGT組的胚胎種植率、HCG陽(yáng)性率、宮內(nèi)妊娠率均顯著高于RIF組(P<0.05);PGT組的活產(chǎn)率高于RIF組,但差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);ERT組的HCG陽(yáng)性率、宮內(nèi)妊娠率均顯著高于RIF組(P<0.05);ERT組的胚胎種植率、活產(chǎn)率均高于RIF組,但差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);ERT組與PGT組的胚胎種植率、HCG陽(yáng)性率、宮內(nèi)妊娠率、活產(chǎn)率均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表2)。

四、RIF患者活產(chǎn)的影響因素

Spearman相關(guān)分析顯示,RIF患者FET后獲得活產(chǎn)與實(shí)施PGT、接受ERT、接受優(yōu)質(zhì)囊胚移植顯著正相關(guān)(P<0.05);與女方年齡、男方年齡顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05);與不孕類(lèi)型(原發(fā)不孕/繼發(fā)不孕)、不育類(lèi)型(原發(fā)不育/繼發(fā)不育)、不孕年限、不育年限、BMI、FSH、E2、P、PRL、LH、移植當(dāng)日內(nèi)膜厚度、冷凍日囊胚發(fā)育天數(shù)(D5/D6)、受精方式(ICSI/IVF)、囊胚D3卵裂球數(shù)的相關(guān)性不顯著(P>0.05)。以“獲得活產(chǎn)”作為因變量,“實(shí)施PGT”、“接受ERT”、“接受優(yōu)質(zhì)囊胚移植”、“女方年齡”、“男方年齡”5個(gè)變量為協(xié)變量,進(jìn)行Logistic回歸分析,結(jié)果表明:實(shí)施PGT、接受ERT、接受優(yōu)質(zhì)囊胚移植、女方年齡4個(gè)變量是獲得活產(chǎn)的獨(dú)立影響因素(P<0.05)(表3)。其中“實(shí)施PGT”的校正后OR=1.975,說(shuō)明接受PGT后移植整倍體囊胚獲得活產(chǎn)的概率是不接受PGT的1.975倍;“接受ERT”的校正后OR=1.711,說(shuō)明接受ERT評(píng)估后在WOI移植獲得活產(chǎn)的概率是不接受ERT的1.711倍;“接受優(yōu)質(zhì)囊胚移植”的校正后OR=1.677,說(shuō)明選擇優(yōu)質(zhì)囊胚進(jìn)行FET獲得活產(chǎn)的概率是選擇非優(yōu)質(zhì)囊胚的1.677倍;“女方年齡”的校正后OR=0.941<1,說(shuō)明女方年齡越大,獲得活產(chǎn)的概率越低(表3)。

表3 影響活產(chǎn)的多因素Logistic回歸分析

討 論

從目前的研究結(jié)果來(lái)看,導(dǎo)致RIF的原因主要有胚胎因素與子宮內(nèi)膜容受性因素。PGT技術(shù)提供了有力的胚胎學(xué)支持,讓RIF的診斷不僅依靠臨床假設(shè)[8]。ERT技術(shù)的出現(xiàn)則首次從分子生物學(xué)角度闡述了RIF發(fā)生的可能機(jī)制,并開(kāi)辟了臨床治療RIF的新途徑[1,3]。應(yīng)用PGT技術(shù)幫助篩選整倍體胚胎,或經(jīng)ERT評(píng)估后在WOI內(nèi)完成胚胎移植,均可改善RIF患者的FET結(jié)局[3,6]。然而,仍有一部分RIF患者通過(guò)PGT移植整倍體胚胎或在WOI內(nèi)接受胚胎移植未獲成功妊娠和活產(chǎn),這說(shuō)明對(duì)于同一個(gè)RIF患者,胚胎染色體異常和子宮內(nèi)膜容受性不佳兩種因素可能同時(shí)存在,且可能還有更多未被闡明的影響RIF成功率的因素。為探究這些患者生育問(wèn)題的解決方法,我們分析比較了聯(lián)用ERT與PGT、單獨(dú)接受ERT和單獨(dú)應(yīng)用PGT的RIF患者的FET結(jié)局。研究結(jié)果證明,聯(lián)用ERT與PGT是治療RIF的一次成功嘗試。經(jīng)過(guò)ERT評(píng)估后,在WOI內(nèi)移植整倍體囊胚,可進(jìn)一步顯著改善RIF患者的FET結(jié)局。

探究RIF治療方法的最終目的是使RIF患者獲得活產(chǎn)。女方年齡、接受ERT、實(shí)施PGT、囊胚質(zhì)量是影響RIF患者活產(chǎn)率的4個(gè)重要因素。在未進(jìn)行PGT的情況下,篩選優(yōu)質(zhì)胚胎用于移植是提高RIF患者成功率的關(guān)鍵之一。相比形態(tài)學(xué)表現(xiàn)欠佳的胚胎,優(yōu)質(zhì)胚胎具有更高的整倍體率、更好的發(fā)育潛能[9]。在母胎界面,囊胚需要先脫出透明帶才能完成在子宮內(nèi)膜種植的過(guò)程。FET的過(guò)程需要讓胚胎經(jīng)歷冷凍和凍融的操作,可能會(huì)導(dǎo)致透明帶硬化影響囊胚孵出,導(dǎo)致種植失敗。優(yōu)質(zhì)囊胚具有很強(qiáng)的抗逆能力,可在凍融后快速?gòu)?fù)蘇擴(kuò)張,降低透明帶硬化對(duì)胚胎種植的影響[10]。

本研究發(fā)現(xiàn),在僅接受PGT和PGT、ERT均未接受的兩類(lèi)RIF患者中,未獲活產(chǎn)患者的女方年齡均顯著高于獲得活產(chǎn)患者(P<0.05),且獲得活產(chǎn)患者移植優(yōu)質(zhì)囊胚占比均顯著高于未獲活產(chǎn)(P<0.05),提示女方患者年齡、囊胚質(zhì)量可能是影響活產(chǎn)的重要因素,且即便是整倍體囊胚,優(yōu)質(zhì)的囊胚可能具有更佳的發(fā)育潛能;然而,在僅接受ERT和同時(shí)接受PGT與ERT的兩類(lèi)RIF患者中,獲得活產(chǎn)者與未獲活產(chǎn)者的女方年齡、移植優(yōu)質(zhì)囊胚占比均沒(méi)有顯著差異(P>0.05),提示可能還有其它原因影響RIF患者的活產(chǎn)率。

本研究中接受ERT評(píng)估的RIF患者WOI偏移率達(dá)到了95.79%,與本中心前期研究持平,顯著高于其他研究的WOI偏移率(P<0.05),這可能與嚴(yán)格根據(jù)指征篩選受試者有關(guān)[1,3]。外源激素可影響子宮內(nèi)膜多個(gè)基因的表達(dá),因此,人工激素內(nèi)膜準(zhǔn)備的用藥方案不同,也可能導(dǎo)致ERT評(píng)估WOI偏移率出現(xiàn)差異[1]。

本研究共納入RIF患者730個(gè)FET周期,分為了4個(gè)研究組,每組的樣本量、患者選擇具有一定局限性。雖然在IVF中RIF的發(fā)生率約為10%,但其中一部分患者伴有子宮內(nèi)膜厚度不夠、宮腔解剖學(xué)異常、男方精子異常等會(huì)明顯影響種植率或胚胎質(zhì)量的因素,這些患者的FET周期在本研究中需要被剔除;本研究各組患者女性平均年齡<34歲,IVF結(jié)局較好,但高齡、胚胎質(zhì)量差、無(wú)法在IVF中獲得囊胚的RIF患者的FET周期則無(wú)法被納入本研究,而以上患者雖然在RIF患者群體中占比不高,卻是ART治療的一大難點(diǎn)。因此,需要更多、更深入的研究來(lái)開(kāi)發(fā)這部分患者的RIF治療方法。

除胚胎整倍性與子宮內(nèi)膜WOI以外,胚胎種植成功率也受多種因素的影響。子宮內(nèi)膜母胎界面的免疫異常被認(rèn)為會(huì)干擾胚胎種植,可能為導(dǎo)致RIF的原因之一[8,11-13];子宮內(nèi)膜的血流灌注狀態(tài)也與內(nèi)膜容受性相關(guān),從而影響胚胎種植[14];細(xì)胞調(diào)控因子(包括microRNA、lncRNA、circular RNA等)廣泛參與了子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)的基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與相互作用的調(diào)控,對(duì)胚胎的成功種植具有重要意義[15-16]。針對(duì)以上因素,研究人員嘗試了一系列臨床應(yīng)對(duì)措施,包括應(yīng)用低分子肝素改善母體高凝狀態(tài);對(duì)免疫過(guò)度活躍患者應(yīng)用免疫抑制劑,如外源糖皮質(zhì)激素糾正輔助性T細(xì)胞1/輔助性T細(xì)胞2的異常、環(huán)孢素A抑制效應(yīng)T細(xì)胞激活等;對(duì)免疫不活躍患者進(jìn)行內(nèi)膜機(jī)械刺激改善血流狀態(tài);宮腔灌注改善胚胎粘附環(huán)境等,改善了RIF患者的移植結(jié)局[8]。此外,多種細(xì)胞調(diào)控因子被認(rèn)為是反映子宮內(nèi)膜容受性的分子標(biāo)志物,在未來(lái)具有被應(yīng)用于臨床判斷子宮內(nèi)膜容受狀態(tài)的重要價(jià)值[17]。

在國(guó)外,PGT技術(shù)被認(rèn)為可以有效改善RIF患者移植結(jié)局,而子宮內(nèi)膜容受性分析(endometrial receptivity analysis,ERA)技術(shù)、聯(lián)用ERA和PGT技術(shù)對(duì)RIF患者的臨床應(yīng)用效果存在爭(zhēng)議[18-20]。目前來(lái)看,ERT技術(shù)在國(guó)內(nèi)RIF患者中的應(yīng)用效果良好,PGT技術(shù)能夠改善RIF患者FET結(jié)局的觀念也被廣泛認(rèn)可[3,5-7]。本研究結(jié)果證明,聯(lián)用ERT與PGT技術(shù),可在PGT或ERT應(yīng)用的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步顯著提升RIF患者FET的胚胎種植率、宮內(nèi)妊娠率與活產(chǎn)率,為尋找新的RIF治療方法提供了依據(jù),但此聯(lián)用技術(shù)在高齡、胚胎質(zhì)量差或IVF僅有卵裂期胚胎的RIF患者中應(yīng)用效果仍需更多分析和研究。