韓素平，李曉紅，徐寧寧，付 正*

（1.山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，山東 濟(jì)南 250002；2.濟(jì)南護(hù)理職業(yè)學(xué)院專業(yè)基礎(chǔ)部，山東 濟(jì)南 250102；3.宏濟(jì)堂制藥（商河）有限公司，山東 濟(jì)南 251600）

尿酸是白血病、惡性腫瘤化療以及心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)因子，因此，尿酸的檢測(cè)備受關(guān)注[1]。目前，臨床和實(shí)驗(yàn)室用于尿酸檢測(cè)的方法存在操作復(fù)雜、成本高、穩(wěn)定性差等問題[2]。

天然過氧化物酶結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、重復(fù)利用率低且價(jià)格高，而納米模擬酶在模擬天然酶活性的同時(shí)可彌補(bǔ)天然酶的不足，在諸多具有類酶活性的納米材料中，磁性Fe3O4因具有成本低、表面易功能化和良好的生物學(xué)兼容性受到研究人員的青睞[3]。本文通過兩步水熱法制備了Fe3O4@CeO2模擬酶，并通過與尿酸酶的催化反應(yīng)級(jí)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)尿酸高靈敏度、高選擇性、低成本、快速的可視化檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

透射電子顯微鏡，F(xiàn)EI Tecnai F20，賽默飛；紫外-可見分光光度計(jì)，UV-2450，島津；pHS-25 酸度計(jì)，雷磁。

尿酸和尿酸氧化酶，上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、H2O2，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸三鈉、乙二醇、醋酸、醋酸鈉、六水合硝酸鈰、氯化鐵、乙醇、六亞甲基四胺等，上海泰坦科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)中所用水為超純水。

1.2 過氧化物模擬酶的制備

將0.202 5 g 檸檬酸三鈉和0.651 3 g 氯化鐵充分溶解于20 mL 乙二醇后加入1.253 7 g 醋酸鈉，磁力攪拌20 min 混勻，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜，在200 ℃水熱反應(yīng)10 h。冷卻至室溫后分別用超純水、無水乙醇洗滌沉淀3 次并磁分離收集，60 ℃真空干燥，得到Fe3O4納米粒子。

取0.100 3 g 以上所得Fe3O4納米粒子分散至40 mL 50%的乙醇中，加入35 mg 六水合硝酸鈰和30 mg 六亞甲基四胺后轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中，在100 ℃下反應(yīng)2 h。冷卻后分別用超純水、無水乙醇洗滌沉淀3 次并磁分離收集，60 ℃真空干燥得到Fe3O4@CeO2過氧化物模擬酶。

1.3 Fe3O4@CeO2 模擬酶活性的探究

向盛有100 μL 5 mmol/L TMB 溶液的離心管中分別加入2 mL 醋酸鈉緩沖液（pH=4.0，0.2 mol/L）、10 μL 0.5 mg/mL 的Fe3O4@CeO2和10 μL 50 mmol/L的H2O2，37 ℃水浴中反應(yīng)20 min 后磁分離去除Fe3O4@CeO2，上清液轉(zhuǎn)移到吸收池中測(cè)量吸收光譜。

1.4 尿酸的比色檢測(cè)

尿酸檢測(cè)參考文獻(xiàn)[4]的方法，第一步，將10 μL 10 g/L 的尿酸氧化酶和200 μL 不同濃度的尿酸分散在pH=8.4 的硼酸鹽緩沖液中，混合液在37 ℃水浴中反應(yīng)20 min；第二步，10 μL 0.5 mg/mL 的Fe3O4@CeO2、100 μL 的TMB（5 mmol/L）、2 mL 醋酸鈉緩沖溶液（0.2 mol/L，pH=4.0）加入到第一步中的尿酸反應(yīng)液中充分混勻，37 ℃水浴中反應(yīng)20 min，磁分離Fe3O4@CeO2后測(cè)吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4@CeO2 的表征與模擬酶特性研究

按照1.2 步驟所制備的Fe3O4@CeO2的透射電子顯微鏡圖見圖1，CeO2納米粒子均勻負(fù)載在Fe3O4納米粒子表面形成分散性良好的核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4@CeO2。

圖1 Fe3O4@CeO2 納米復(fù)合物的TEM 圖

2.2 Fe3O4@CeO2 過氧化物模擬酶特性研究

以TMB 為反應(yīng)底物，H2O2為氧化底物，評(píng)價(jià)所制備Fe3O4@CeO2的過氧化物模擬酶特性。結(jié)果表明，H2O2不能單獨(dú)氧化TMB 使其變色；Fe3O4@CeO2和TMB 共存時(shí)，652 nm 處無明顯吸收；Fe3O4@CeO2、TMB 和H2O2共存的反應(yīng)體系在652 nm 處有較強(qiáng)吸收，證明生成了藍(lán)色的TMB 氧化產(chǎn)物。以上結(jié)果表明Fe3O4@CeO2具有良好的類過氧化物酶活性。

納米模擬酶和天然酶辣根過氧化物酶的催化活性均受體系pH 值影響[5]。實(shí)驗(yàn)了pH 從2 到10 變化對(duì)Fe3O4@CeO2類過氧化物酶催化性能的影響。結(jié)果表明，當(dāng)pH=4 時(shí)，652 nm 處吸光度值最大，證明此時(shí)Fe3O4@CeO2的催化活性最強(qiáng)。因此，實(shí)驗(yàn)選擇pH=4作為該納米模擬酶催化反應(yīng)的最佳pH 值。

研究了底物H2O2在不同濃度下Fe3O4@CeO2對(duì)TMB-H2O2體系的催化效果，圖2、圖3 表明，F(xiàn)e3O4@CeO2的催化活性隨H2O2濃度的增加先增大后趨于穩(wěn)定，在1～20 μmol/L 范圍內(nèi)的線性方程為A=0.012 22+0.012 1c，r=0.999（c 為H2O2濃度，A 為652 nm 處吸光度值）。

圖2 不同H2O2 濃度條件下652 nm 處的吸光度值

圖3 H2O2 的線性工作曲線

2.3 尿酸的測(cè)定

根據(jù)Fe3O4@CeO2能夠催化氧化過氧化物酶底物的酶學(xué)特性，與尿酸氧化酶催化氧化尿酸的反應(yīng)耦合，通過直接檢測(cè)H2O2從而實(shí)現(xiàn)尿酸的間接測(cè)定。圖4為該方法檢測(cè)尿酸的吸收光譜，652 nm 處吸收峰隨尿酸濃度的增加而增大，在10～100 μmol/L 范圍內(nèi)，尿酸濃度與吸光度呈線性，線性方程為A=0.172+0.002 96c，r=0.992（c 為尿酸濃度，A 為652 nm 處吸光度值），檢測(cè)限為7.9 μmol/L。

圖4 不同尿酸濃度下TMB-H2O2 體系的吸收光譜

血清樣品高速離心后取上清液稀釋20 倍后做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率為83%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.25%，表明該方法準(zhǔn)確度良好，可用于尿酸濃度的檢測(cè)。

3 結(jié)論

本研究通過兩步水熱法制備具有優(yōu)異催化活性的Fe3O4@CeO2磁性過氧化物模擬酶，并與尿酸氧化酶級(jí)聯(lián)構(gòu)建尿酸的酶催化反應(yīng)體系，實(shí)現(xiàn)尿酸高選擇性、低成本的比色檢測(cè)，測(cè)定尿酸的線性范圍為10～100 μmol/L，檢測(cè)限為7.9 μmol/L，為尿酸檢測(cè)提供了一種新思路。