黃海陽(yáng)， 鐘少雯， 安云， 王宇新， 朱淑敏， 高潔， 盧曉敏， 董明國(guó)

（1.東莞市中醫(yī)院，廣東東莞 523000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；3.廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院，廣東廣州 511408）

胃癌前病變（precancerous lesions of gastric cancer，PLGC）是指在慢性萎縮性胃炎的基礎(chǔ)上伴有腸黏膜上皮化生（IM）或異型增生（DYS）改變[1]。Correa級(jí)聯(lián)反應(yīng)指明胃癌發(fā)生的病理演變過(guò)程：正常胃黏膜→非萎縮性胃炎→慢性萎縮性胃炎→胃黏膜腸上皮化生→胃黏膜異型增生→胃癌[2-3]。在我國(guó)，胃癌的發(fā)病率位居第2，僅次于肺癌[4]。現(xiàn)代年輕人常因飲食不節(jié)而罹患胃腸系統(tǒng)疾病，而常見(jiàn)的胃腸道疾病若不加以重視則可能演化為重癥或惡性腫瘤。胃癌前病變是胃炎演化為胃癌的“黃金截點(diǎn)”，也是臨床上預(yù)防胃癌的研究重點(diǎn)，正確認(rèn)識(shí)并應(yīng)對(duì)胃癌前病變、尋找針對(duì)胃癌前病變的有效治療藥物，是降低胃癌發(fā)生率的關(guān)鍵。

健胃消脹片為廣州中醫(yī)藥大學(xué)東莞醫(yī)院研制的中藥復(fù)方制劑，具有行氣消脹、健運(yùn)脾胃、調(diào)和氣血等功效，用于功能性消化不良、慢性胃炎、膽汁反流性胃炎等疾病，臨床療效確切。為拓展健胃消脹片的臨床應(yīng)用范圍，本課題組前期通過(guò)多個(gè)實(shí)驗(yàn)考察其對(duì)胃癌前病變相關(guān)疾病模型的干預(yù)效果，發(fā)現(xiàn)健胃消脹片對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠的胃黏膜有一定的保護(hù)作用，能增強(qiáng)胃黏膜屏障的防御和修復(fù)能力[5-6]，還能抑制胃酸分泌、促進(jìn)小腸運(yùn)動(dòng)[7]。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究擬進(jìn)一步考察健胃消脹片對(duì)胃癌前病變大鼠模型治療的潛在機(jī)制，為本病的臨床合理用藥提供參考依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40 只SPF 級(jí)6 周齡雄性SD 大鼠，體質(zhì)量220～240 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44005800008402。于SPF級(jí)環(huán)境檢疫飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，于動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案已經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批號(hào)：20210426006）。

1. 2 藥物及制備 健胃消脹片（由枳實(shí)、沉香、大腹皮、莪術(shù)、山藥、墨旱蓮、石斛、甘草、雞內(nèi)金、紫蘇梗等10味中藥組成），為廣東省東莞市中醫(yī)院院內(nèi)制劑（批號(hào)：20210426），使用時(shí)溶解于無(wú)菌生理鹽水，制成終質(zhì)量濃度25 mg·mL-1；葉酸片，福建海王福藥制藥公司生產(chǎn)（批號(hào)：21042810），使用時(shí)溶解于無(wú)菌生理鹽水，制成終質(zhì)量濃度0.5 mg·mL-1；雷尼替丁，廣東省恒健醫(yī)藥公司生產(chǎn)，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H44021173。

1.3 試劑與儀器 N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（MNNG，廣州市康明生命技術(shù)公司，批號(hào)：20210601）；蘇木素-伊紅（HE）染色液、阿利新藍(lán)-過(guò)碘酸雪夫氏（AB-PAS）染色液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）；大鼠胃泌素（GAS）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、大鼠胃動(dòng)素（MTL）ELISA 試劑盒、大鼠胰高血糖素（GC）ELISA試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、β-actin、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A（VEGFA）等抗體，Anti-Rabbit lgG（H+L）HRP 二抗（美國(guó)Affinity 公司）；內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗體（美國(guó)SAB 公司）。HM340E 型半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；Gemini AS 型自動(dòng)染色機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；冷凍高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；顯影儀（廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司）；1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4 分組、造模與給藥 40 只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取10只作為正常組，每天以2 mL生理鹽水灌胃，正常喂養(yǎng)，連續(xù)12周。其余30只大鼠應(yīng)用聯(lián)合造模法構(gòu)建胃癌前病變模型[8]：自由飲用質(zhì)量濃度為180 μg·mL-1的MNNG，并配合3 mg·mL-1的雷尼替丁水溶液2 mL/只灌胃，連續(xù)12 周。若HE染色結(jié)果顯示模型大鼠胃黏膜壁層細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，排列疏松、異常紊亂，胞核異形，出現(xiàn)杯狀細(xì)胞增生，腸化生現(xiàn)象等，AB-PAS染色結(jié)果顯示模型組大鼠胃組織黏膜層顯著變薄，則判斷胃癌前病變?cè)炷３晒?。成功造模后，將大鼠隨機(jī)分為模型組、葉酸組和健胃消脹片組，每組10 只。在造模第5 周開(kāi)始給藥：葉酸組，每只大鼠以4 mg·kg-1的葉酸溶液灌胃；健胃消脹片組，根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)的有效劑量范圍[5-7]結(jié)合動(dòng)物倫理要求，給予0.5 g·kg-1劑量的健胃消脹片混懸液灌胃。連續(xù)給藥7周。全部實(shí)驗(yàn)大鼠在末次給藥后禁食禁水12 h，麻醉滿(mǎn)意后，進(jìn)行標(biāo)本取材。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 大鼠體質(zhì)量測(cè)量 記錄給藥期間各組大鼠體質(zhì)量的變化。

1.5.2 胃部大體形態(tài)觀察 取出大鼠全胃，沿大彎側(cè)切開(kāi)，傾倒內(nèi)容物，生理鹽水沖洗干凈，觀察胃部大體觀病理變化與評(píng)分[9]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)損傷，計(jì)0分；黏膜充血、水腫，計(jì)1分；黏膜散在腫物突起，計(jì)2 分；黏膜腫物突起較多，計(jì)3 分；黏膜腫物突起成片，計(jì)4分。

1. 5. 3 脾臟系數(shù)和肝臟系數(shù) 取大鼠脾臟和肝臟，計(jì)算各組大鼠脾臟系數(shù)和肝臟系數(shù)。

1.5.4 血清GAS、MTL、GC含量測(cè)定 腹主動(dòng)脈取血，分離血清，根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟和方法，測(cè)定大鼠血清中GAS、MTL、GC含量。

1. 5. 5 HE 染色法觀察胃組織病理形態(tài) 分離大鼠胃組織，在干凈濾紙上縱向切段（含胃底、胃體、胃竇），以10%福爾馬林溶液固定24 h 以上，經(jīng)石蠟包埋后切片（厚度4 μm）。用自動(dòng)染色機(jī)對(duì)切片進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察比較各組胃組織病理形態(tài)變化，并對(duì)胃組織炎癥程度進(jìn)行評(píng)分[9]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1。

表1 胃組織炎癥程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring criteria for the degree of inflammation in gastric tissue

1.5.6 AB-PAS 染色法檢測(cè)胃組織黏膜層厚度將大鼠胃組織石臘切片，二甲苯脫蠟至水。阿利新藍(lán)染色液染色15 min，入過(guò)碘酸溶液氧化5 min，Schiff Reagent 浸染15 min，Leagene 蘇木素染色液染核1 min，酸性分化液分化3 s，Scott 藍(lán)化液返藍(lán)。每個(gè)步驟后均蒸餾水洗，然后逐級(jí)常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察，并用ImageJ軟件測(cè)量比較各組胃組織AB-PAS陽(yáng)性表達(dá)的黏膜層厚度。

1.5.7 Western Blot法檢測(cè)胃組織PI3K-Akt-eNOS通路相關(guān)蛋白表達(dá) 胃組織加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解緩沖液[蛋白磷酸酶抑制劑∶苯磺酰氟（PMSF）∶RIPA=1∶1∶10；組織與緩沖液比為1∶10]，勻漿裂解后在4 ℃、12 000g下離心10 min，收集上清，用二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。樣品加入SDS 緩沖液于恒溫金屬浴中100 ℃、10 min 加熱變性，十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離（30 min，80 V；40 min，120 V），將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入按體積比稀釋的PI3K（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、eNOS（1∶1 000）、β-actin（1∶4 000）等抗體4 ℃孵育過(guò)夜。TBS-0.1%Tween 20（TBST）洗滌膜3 次，每次8 min，加入二抗Anti-Rabbit lgG（H+L）（1∶4 000）室溫孵育1 h后，再按上述方法洗滌膜。通過(guò)顯影儀獲得蛋白質(zhì)圖像，利用ImageJ 軟件測(cè)量條帶灰度比，并以β-actin 為參照，分析各組目的蛋白表達(dá)的差異。每組選取3 個(gè)不同的樣本重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

1. 5. 8 免疫熒光染色法檢測(cè)胃組織VEGFA 蛋白表達(dá) 將胃組織石蠟切片經(jīng)60 ℃烘片3 h后經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，在枸櫞酸修復(fù)液中進(jìn)行抗原修復(fù)，用胎牛血清封閉30 min，滴加適宜稀釋比例的一抗（VEGFA）置濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗去一抗后滴加熒光二抗置濕盒中室溫避光孵育1 h。PBS洗去二抗，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS，滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行顯核。最后用甘油封片，并在熒光顯微鏡下立即觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）結(jié)合Post Hoc 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥期間各組大鼠體質(zhì)量變化比較 圖1 結(jié)果顯示：給藥期間各組大鼠體質(zhì)量百分比總體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。正常組大鼠體質(zhì)量百分比增長(zhǎng)速度最快，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)相比給藥前體質(zhì)量增長(zhǎng)幅度最大；模型組大鼠于治療第5周體質(zhì)量百分比開(kāi)始一度出現(xiàn)下降趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)相比治療組開(kāi)始給藥時(shí)體質(zhì)量增幅最??；葉酸組大鼠于治療第2周和第5 周、健胃消脹片組大鼠于治療第3 周和第5 周體質(zhì)量百分比均有所下降，但在給藥治療后期增幅比模型組大，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)相比給藥治療前的增幅均比模型組大。

圖1 給藥期間各組大鼠體質(zhì)量百分比變化比較Figure 1 Comparison of percentage change in body mass of rats among various groups during drug administration

2. 2 各組大鼠胃部大體觀病理變化比較 圖2、表2結(jié)果顯示：正常組大鼠胃部大體上無(wú)明顯病變的特點(diǎn)，色澤紅潤(rùn)，表面平滑，無(wú)水腫或充血、糜爛、結(jié)節(jié)腫塊；模型組大鼠胃部胃黏膜表面疣狀突起成片，顏色泛白，糜爛明顯，黏膜有明顯充血、水腫現(xiàn)象；葉酸組大鼠胃部胃黏膜輕微充血、水腫，顏色微紅，有部分突起，無(wú)明顯糜爛，胃部大體觀病理評(píng)分顯著低于模型組（P＜0.05）；健胃消脹片組大鼠胃部胃黏膜外表光滑，色澤微紅，無(wú)明顯疣狀突起，也未見(jiàn)明確的缺損，胃部大體觀病理評(píng)分顯著低于模型組（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠胃部大體觀Figure 2 Gross view of stomach in each group of rats

表2 各組大鼠胃部大體觀病理評(píng)分比較Table 2 Comparison of pathologic scores of the macroscopic view of the stomach of rats among various groups（）

表2 各組大鼠胃部大體觀病理評(píng)分比較Table 2 Comparison of pathologic scores of the macroscopic view of the stomach of rats among various groups（）

注：①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

胃部病變?cè)u(píng)分/分0.00±0.00 1.67±0.69①0.75±0.38②0.58±0.34③組別正常組模型組葉酸組健胃消脹片組鼠數(shù)/只10 10 10 10

2.3 各組大鼠臟器系數(shù)比較 表3 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠的脾臟系數(shù)、肝臟系數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，健胃消脹片組和葉酸組大鼠脾臟系數(shù)、肝臟系數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；2 個(gè)治療組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠臟器系數(shù)比較Table 3 Comparison of organ coefficients among various groups of rats（）

表3 各組大鼠臟器系數(shù)比較Table 3 Comparison of organ coefficients among various groups of rats（）

注：①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.01，與模型組比較

肝臟系數(shù)/%2.67±0.37 2.32±0.18①2.65±0.26②2.60±0.15②組別正常組模型組葉酸組健胃消脹片組鼠數(shù)/只10 10 10 10脾臟系數(shù)/%0.22±0.03 0.18±0.01①0.22±0.04②0.20±0.01②

2.4 各組大鼠血清GAS、MTL、GC含量比較 表4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清GAS含量升高，MTL、GC 含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，健胃消脹片組大鼠血清GAS 含量降低，MTL、GC 含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），葉酸組MTL含量升高（P＜0.01），GAS、GC含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠血清胃泌素（GAS）、胃動(dòng)素（MTL）、胰高血糖素（GC）含量比較Table 4 Comparison of serum gastrin（GAS），motilin（MTL）and glucagon（GC）levels in rats among various groups（）

表4 各組大鼠血清胃泌素（GAS）、胃動(dòng)素（MTL）、胰高血糖素（GC）含量比較Table 4 Comparison of serum gastrin（GAS），motilin（MTL）and glucagon（GC）levels in rats among various groups（）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，與正常組比較；③P＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組葉酸組健胃消脹片組GC/（pg·mL-1）60.77±7.24 46.48±5.76①54.01±15.28 59.50±6.44③鼠數(shù)/只10 10 10 10 GAS/（ng·L-1）10.21±0.52 11.56±0.47②10.90±0.61 10.20±0.63③MTL/（pg·mL-1）361.27±36.08 300.80±44.03①430.03±22.79③425.20±18.34③

2. 5 各組大鼠胃組織病理形態(tài)變化比較 圖3、表5結(jié)果顯示：正常組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞完全連續(xù)性，腺體整齊緊密排列，細(xì)胞間布局規(guī)整有序，內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)異型增生細(xì)胞，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)充血、水腫出現(xiàn)，黏膜和肌層沒(méi)有異常[10]，見(jiàn)圖3-b~c；模型組大鼠胃黏膜壁層細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，排列疏松、異常紊亂，胞核異形，出現(xiàn)杯狀細(xì)胞增生，腸化生現(xiàn)象（見(jiàn)圖3-e），提示胃組織癌前病變，同時(shí)出現(xiàn)血管充血，水腫現(xiàn)象[11-12]（見(jiàn)圖3-f），與正常組相比炎癥評(píng)分顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；葉酸組部分可見(jiàn)杯狀細(xì)胞增生（見(jiàn)圖3-h），血管充血、水腫現(xiàn)象仍較嚴(yán)重（見(jiàn)圖3-i），與模型組相比稍有好轉(zhuǎn)，炎癥評(píng)分亦有所降低（P＜0.05）；與模型組比較，健胃消脹片組大鼠胃黏膜壁層細(xì)胞排列尚規(guī)整，未見(jiàn)明顯杯狀細(xì)胞增生和腸化生（見(jiàn)圖3-k），血管充血現(xiàn)象已明顯改善（見(jiàn)圖3-l），炎癥評(píng)分顯著下降（P＜0.01）。以上結(jié)果提示健胃消脹片治療胃癌前病變大鼠后，胃組織癌前病變得到明顯改善。

圖3 各組大鼠胃組織HE染色結(jié)果（a、d、g、j，×200；b、c、e、f、h、i、k、l，×400）Figure 3 HE staining results of rat stomach tissues in each group（a，d，g，j，×200；b，c，e，f，h，i，k，l，×400）

表5 各組大鼠胃組織炎癥評(píng)分比較Table 5 Comparison of inflammation scores of gastric tissues of rats among various groups（）

表5 各組大鼠胃組織炎癥評(píng)分比較Table 5 Comparison of inflammation scores of gastric tissues of rats among various groups（）

注：①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

炎癥評(píng)分/分0.0±0.0 9.0±0.8①6.0±0.8②4.3±0.5③組別正常組模型組葉酸組健胃消脹片組鼠數(shù)/只10 10 10 10

2.6 各組大鼠胃組織黏膜層厚度比較 圖4、表6結(jié)果顯示：模型組大鼠胃組織AB-PAS陽(yáng)性表達(dá)層與正常組相比明顯變薄，即胃保護(hù)屏障變薄，黏膜層厚度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，健胃消脹片組和葉酸組大鼠胃組織黏膜層增厚，其中，健胃消脹片組AB-PAS陽(yáng)性表達(dá)程度高于葉酸組，且與模型組相比黏膜層厚度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠胃組織AB-PAS染色結(jié)果（×200）Figure 4 AB-PAS staining results of rat stomach tissues in each group（×200）

表6 各組大鼠胃組織黏膜層厚度比較Table 6 Comparison of the thickness of the mucous membrane layer in the gastric tissues of rats among various groups（）

表6 各組大鼠胃組織黏膜層厚度比較Table 6 Comparison of the thickness of the mucous membrane layer in the gastric tissues of rats among various groups（）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

黏膜層厚度/μm 398.94±66.04 232.20±20.06①336.23±71.71 333.74±42.72②組別正常組模型組葉酸組健胃消脹片組鼠數(shù)/只10 10 10 10

2. 7 各組大鼠胃組織PI3K-Akt-eNOS 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 圖5、表7 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠胃組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、eNOS 蛋白表達(dá)水平降低，其中PI3K、p-PI3K、p-Akt、eNOS 蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，葉酸組胃組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、eNOS 蛋白表達(dá)升高，其中p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；健胃消脹片組胃組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、eNOS 蛋白表達(dá)水平較模型組升高，其中p-PI3K、Akt、p-Akt、eNOS 蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

圖5 各組大鼠胃組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、eNOS蛋白的Western Blot條帶Figure 5 Western Blot bands of PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt，and eNOS proteins in rat stomach tissues of each group

表7 各組大鼠胃組織PI3K-Akt-eNOS通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 7 Comparison of relative expressions of PI3K-Akt-eNOS pathway-related proteins in gastric tissues of rats among various groups（）

表7 各組大鼠胃組織PI3K-Akt-eNOS通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Table 7 Comparison of relative expressions of PI3K-Akt-eNOS pathway-related proteins in gastric tissues of rats among various groups（）

注：①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組葉酸組健胃消脹片組eNOS/β-actin 1.00±0.06 0.42±0.04①0.76±0.23 0.91±0.12②鼠數(shù)/只10 10 10 10 PI3K/β-actin 1.00±0.03 0.78±0.04①0.83±0.08 1.02±0.20 p-PI3K/β-actin 1.00±0.16 0.22±0.04①0.84±0.30②0.99±0.04③Akt/β-actin 1.00±0.36 0.34±0.13 1.10±0.19③0.85±0.04②p-Akt/β-actin 1.00±0.08 0.19±0.19①0.73±0.21②0.93±0.19③

2.8 各組大鼠胃組織VEGFA蛋白表達(dá)比較 為觀察各組大鼠胃組織微血管生成和修復(fù)能力，利用免疫熒光染色法檢測(cè)胃組織VEGFA 蛋白的表達(dá)。圖6、表8 結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠胃組織VEGFA 蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01），提示胃癌前病變大鼠胃組織血管生成與修復(fù)能力受損。與模型組比較，葉酸組胃組織VEGFA 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），健胃消脹片組VEGFA蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），提示健胃消脹片治療胃癌前病變大鼠后，能明顯改善由癌前病變?cè)斐傻拇笫笪附M織血管生成與修復(fù)能力受損，且改善效果優(yōu)于葉酸。

圖6 各組大鼠胃組織VEGFA的免疫熒光染色結(jié)果（×200）Figure 6 Immunofluorescence staining results of VEGFA in the gastric tissues of rats in each group（×200）

表8 各組大鼠胃組織VEGFA蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較Table 8 Comparison of VEGFA protein positive expression in gastric tissues of rats among various groups（）

表8 各組大鼠胃組織VEGFA蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較Table 8 Comparison of VEGFA protein positive expression in gastric tissues of rats among various groups（）

注：①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

VEGFA陽(yáng)性表達(dá)率/%24.00±1.44 5.80±1.14①9.75±2.01②17.44±1.26③組別正常組模型組葉酸組健胃消脹片組鼠數(shù)/只10 10 10 10

3 討論

胃癌前病變是一個(gè)組織病理學(xué)概念，指相應(yīng)的病理變化比正常組織或其他病理改變更易發(fā)生癌變，如胃黏膜上皮異型增生、腸上皮化生等。輕中度非典型增生經(jīng)過(guò)及時(shí)治療大部分會(huì)減輕或消退，因此，及早干預(yù)是非常有效的防癌措施。

中醫(yī)認(rèn)為，胃為六腑之一，以通為順，滿(mǎn)而不能藏。胃癌前病變相關(guān)癥狀多表現(xiàn)為胃動(dòng)力減弱、腹脹隱痛等，既要消食導(dǎo)滯，更要從根本上強(qiáng)健脾胃，增加胃動(dòng)力[13-15]。健胃消脹片是我院的院內(nèi)制劑，臨床治療常見(jiàn)慢性胃病效果顯著，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究亦驗(yàn)證其藥效。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)健胃消脹片能下調(diào)胃癌前病變大鼠血清中的胃泌素（GAS）含量、上調(diào)胃動(dòng)素（MTL）和胰高血糖素（GC）含量，基于健胃消脹片具有行氣消脹、健運(yùn)脾胃的功效，提示其對(duì)胃癌前病變的改善作用可能與抑制潰瘍、改善胃動(dòng)力等機(jī)制有關(guān)。本研究病理分析結(jié)果顯示，健胃消脹片能顯著改善胃癌前病變大鼠胃部大體觀病理變化及胃黏膜壁層細(xì)胞排列疏松、異常紊亂，胞核異形和杯狀細(xì)胞增生、腸化生現(xiàn)象，并能改善炎癥，藥效結(jié)果優(yōu)于葉酸?，F(xiàn)代藥理研究表明，葉酸通過(guò)增強(qiáng)胃黏膜DNA 甲基化狀態(tài)、改善貧血等機(jī)制改善胃癌前病變[16-17]，但葉酸會(huì)促進(jìn)胃酸分泌，對(duì)胃的刺激性大。而本研究通過(guò)對(duì)胃組織病理形態(tài)的檢查發(fā)現(xiàn)，健胃消脹片對(duì)胃癌前病變大鼠胃組織黏膜層細(xì)胞排列疏松、血管充血現(xiàn)象的改善作用優(yōu)于葉酸；胃組織AB-PAS染色結(jié)果表明，健胃消脹片對(duì)胃癌前病變大鼠胃黏膜的修復(fù)作用亦優(yōu)于葉酸，提示健胃消脹片對(duì)胃癌前病變的改善作用可能與其促進(jìn)胃黏膜血液循環(huán)、保護(hù)黏液分泌功能細(xì)胞及加速黏膜屏障的重建有關(guān)。

持續(xù)的血管新生是腫瘤的基本特征之一，增殖活躍的腫瘤細(xì)胞分泌高水平的促血管生成因子，形成無(wú)序、不成熟、可滲透的腫瘤血管網(wǎng)絡(luò)，腫瘤灌注受損，形成更利于腫瘤侵襲的缺氧微環(huán)境[18]。研究[19]表明，促進(jìn)血管生成和修復(fù)能抑制胃癌癌前病變進(jìn)程。PI3K-Akt-eNOS 信號(hào)通路是調(diào)控體內(nèi)血管生成和修復(fù)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[20-22]，該信號(hào)通路的激活可促進(jìn)體內(nèi)損傷組織的微血管生成和修復(fù)[23-26]。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGFA是由VEGFA基因編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是糖基化的有絲分裂原，其特異性地作用于內(nèi)皮細(xì)胞，具有誘導(dǎo)血管生成和修復(fù)的作用[27]。本研究結(jié)果表明，胃癌前病變大鼠胃組織PI3K-Akt-eNOS通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均顯著降低，VEGFA 蛋白表達(dá)亦顯著下調(diào)，提示在胃癌前病變病理狀態(tài)下PI3K-Akt-eNOS 通路被抑制，胃組織微血管生成和修復(fù)能力變差。而健胃消脹片能激活PI3K-AkteNOS 通路，使該通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平升高，上調(diào)胃組織VEGFA 蛋白表達(dá)，表明健胃消脹片可能通過(guò)激活PI3K-Akt-eNOS 信號(hào)通路促進(jìn)胃損傷組織的血管生成和修復(fù)能力，從而改善胃癌前病變。

綜上所述，健胃消脹片對(duì)胃癌前病變大鼠的病理表征和胃組織損傷均有改善作用，其機(jī)制可能與激活PI3K-Akt-eNOS 信號(hào)通路從而改善胃損傷組織的血管生成和修復(fù)能力有關(guān)。本研究有待下一步進(jìn)行前瞻性的臨床研究，以論證健胃消脹片對(duì)胃癌相關(guān)病變的治療效果。但鑒于胃癌前病變是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，PI3K-Akt-eNOS信號(hào)通路的調(diào)控作用是否發(fā)生在胃癌前病變整個(gè)階段與其是否與胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)仍不清楚，這也是本課題將重點(diǎn)研究的方向。