帥敏 樂山市中心血站 （四川 樂山 614000）

內(nèi)容提要： 目的：觀察并分析在血站核酸檢測中實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的應(yīng)用效果。方法：選取2023年1月～2023年6月17564分無償獻(xiàn)血者樣本，都是經(jīng)過乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗體初檢和復(fù)檢都合格的樣本，對其進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR的核酸檢測。結(jié)果：在17564無償獻(xiàn)血者的血液樣本中，經(jīng)過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測，共有25例乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸陽性，0例丙型肝炎病毒核糖核酸和人類免疫缺陷病毒（1型）核糖核酸陽性。在臨檢中心舉行的室間質(zhì)評中，所有檢驗(yàn)結(jié)論均正確，得分為100分。結(jié)論：在血站核酸檢測中采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，可有效減短病毒檢測窗口期，有助于血液安全水平的提高。

實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)具有高度的靈敏度和特異性，其能夠檢測到非常低濃度的目標(biāo)脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）或核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA），甚至在樣本中只有幾個分子的情況下也能夠進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測[1,2]。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的高靈敏度能夠及早發(fā)現(xiàn)這些病原體，從而采取相應(yīng)的措施，確保獻(xiàn)血的安全性。實(shí)時熒光定量PCR能夠大大縮短檢測時間，通過使用這種方法，血站能夠有效降低輸血危險的“窗口期”，確保輸血的高度安全[3,4]。基于此，本研究取2023年1月～2023年6月17564例無償獻(xiàn)血者，對其血液樣本進(jìn)行乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）DNA、丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）RNA和人類免疫缺陷病毒1型（Human Immunodeficiency Virus，HIV-1）RNA檢測，以實(shí)現(xiàn)無償獻(xiàn)血人群的核酸篩查目標(biāo)。現(xiàn)將細(xì)致報告如下。

1.材料與方法

1.1 一般材料

選取2023年1月～2023年6月17564份經(jīng)過HBV表面抗原（Hepatitis B Surface Antigen，HBsAg）、HCV抗體、HIV抗體初檢和復(fù)檢2次檢測結(jié)果均為陰性的無償獻(xiàn)血者樣本，全部樣本經(jīng)過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測。

試劑：①初檢試劑：乙型肝炎病毒檢測試劑盒（HBsAg）英科新創(chuàng)（廈門），丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒（ELISA）北京萬泰，人類免疫缺陷病毒酶免診斷試劑盒（HIV）北京萬泰。②復(fù)檢試劑：乙型肝炎病毒檢測試劑盒（HBsAg）DiaSorin（索靈），丙型肝炎病毒酶免檢測試劑盒（HCV）奧斯邦Ortho-Clinical Diagnostics，人類免疫缺陷病毒酶免診斷試劑盒（HIV）伯樂Bio-Rad。③核酸檢測試劑：乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 人類免疫缺陷病毒（1型）核酸檢測試劑盒（PCR熒光法），廣州達(dá)安基因股份有限公司。

儀器設(shè)備：①酶免檢測設(shè)備：STAR 全自動樣本處理系統(tǒng)（HAMILTON）；FAME24/20 全自動酶免檢測系統(tǒng)（HAMILTON）；愛康全自動血型檢測系統(tǒng)，AU400貝克曼全自動生化分析儀。②核酸檢測設(shè)備：DA3500S型全自動核酸提取儀；AFD4800實(shí)時熒光定量PCR儀；JW-1042R低速冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；開蓋機(jī)（珠海倍健電氣技術(shù)有限公司）；HR40-‖A2型生物安全柜（青島海爾特種電器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品檢測

對所有樣本進(jìn)行HBsAg、HCV抗體、HIV抗體檢測，經(jīng)過初檢和復(fù)檢兩次檢測結(jié)果均為陰性的樣本，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。

DA3500S全自動核酸提取儀采用八混樣進(jìn)行核酸檢測。每個樣本取200μL的血漿，總共1600μL。當(dāng)樣品數(shù)量不足8個時，檢測系統(tǒng)會自動計算每個樣本匯集量，使匯集總量達(dá)到1600μL。樣本匯集完成后，采用磁珠法進(jìn)行核酸提取。提取完成后，用AFD4800實(shí)時熒光定量PCR儀擴(kuò)增儀完成模板的擴(kuò)增。如果擴(kuò)增結(jié)果為陰性，那么該孔匯集的8個樣本都被判定為無反應(yīng)性。如果擴(kuò)增結(jié)果為陽性，那么該孔匯集的8個樣本都進(jìn)行拆分實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行單孔測試，單孔測試為陰性則判定為無反應(yīng)性；如果單孔檢測為某項(xiàng)目陽性則判定為該項(xiàng)目反應(yīng)性。

1.2.2 結(jié)果判讀

核酸樣本判讀規(guī)則見表1。

表1.核酸樣本判讀規(guī)則

1.2.3 質(zhì)量控制

對每一次檢測都做兩孔室內(nèi)質(zhì)控，一孔放在加樣的第一孔位置，用專用稀釋液稀釋后檢測，用于實(shí)驗(yàn)有效性的判定；第二孔放在混檢樣本的最后一孔，用已檢測結(jié)果為陰性的樣本的血漿稀釋后檢測，用于試劑性能的監(jiān)控，再加上一個陽性對照和一個陰性對照，以及每個孔內(nèi)均設(shè)的內(nèi)對照，其對照結(jié)果見表2判讀結(jié)果。每年均參加臨檢中心舉辦的室間質(zhì)評活動和省血液安全管理中心組織的室間質(zhì)評活動。

表2.陽性、陰性及內(nèi)對照結(jié)果判讀原則

1.3 觀察指標(biāo)

觀察全部血液樣本檢測結(jié)果和室間質(zhì)評檢測結(jié)果狀況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2.結(jié)果

2.1 一般結(jié)果描述

在17564例無償獻(xiàn)血者的血液樣本中，經(jīng)過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測，共有25例HBV-DNA陽性，0例HCV-RNA和HIV-RNA陽性。

2.2 國家舉辦室內(nèi)質(zhì)量控制評估檢測結(jié)果狀況

在國家衛(wèi)生計生委臨檢查中心舉行的室內(nèi)質(zhì)量控制評估中，所有檢驗(yàn)結(jié)論均正確，共計得分100分。

3.討論

實(shí)時熒光定量PCR是一種外體模擬自動進(jìn)行DNA復(fù)制過程的技術(shù)[5]。通過變性、退火和延伸三步反應(yīng)的循環(huán)，DNA模板被擴(kuò)增到了2的n次方倍。在此過程中向系統(tǒng)中添加熒光團(tuán)，實(shí)現(xiàn)對熒光信號的積累，從而可以實(shí)時監(jiān)控PCR全過程。在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期間可通過Ct值來定量分析模板數(shù)量，并以此模板為基準(zhǔn)測量待檢測樣本的復(fù)制數(shù)量，二者呈線性相關(guān)[6]。適用于定量分析的模板進(jìn)行后續(xù)操作。

實(shí)時熒光定量PCR是一種高效、準(zhǔn)確的核酸檢測技術(shù)，在血站核酸檢測中具有諸多優(yōu)勢[7,8]。首先，實(shí)時熒光定量PCR具有高靈敏度。能夠檢測到非常低濃度的核酸，甚至是單個分子水平的檢測，在早期感染的診斷中非常有用，特別是對于那些病毒或細(xì)菌感染，其病原體含量較低的情況下。其次，實(shí)時熒光定量PCR具有高特異性。在區(qū)分不同病原體的檢測中非常有效，可以準(zhǔn)確鑒定出感染的病原體類型。此外，實(shí)時熒光定量PCR具有快速高效的優(yōu)勢。相較于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，實(shí)時熒光定量PCR不需要進(jìn)行后續(xù)的凝膠電泳分析，而是通過實(shí)時監(jiān)測熒光信號的變化來定量檢測目標(biāo)序列。這種實(shí)時監(jiān)測的特點(diǎn)使得實(shí)時熒光定量PCR能夠在短時間內(nèi)可靠、準(zhǔn)確的完成檢測。另外，實(shí)時熒光定量PCR具有寬線性范圍，通過合理設(shè)計引物和探針，可以在不同濃度范圍內(nèi)都能夠準(zhǔn)確定量，在血站核酸檢測中非常適用，可以滿足不同樣本的檢測需求?？傊瑢?shí)時熒光定量PCR的應(yīng)用可以提高核酸檢測的準(zhǔn)確性和效率，為血站的病原體篩查和感染性疾病的診斷提供重要的技術(shù)支持[9,10]。

HBsAg、HCV和HIV的傳統(tǒng)篩查技術(shù)存在“窗口期”較長的問題[11]。相比之下，核酸檢驗(yàn)可以使三者的檢測“窗口期”由56d、82d、22d，縮成33d、22d和11d[12,13]。此外，該方法還可用于檢測免疫技術(shù)無法檢測到的抗體、隱性感染、隱性乙型肝炎病毒和病毒變體，從而更好地確保血液的安全[14]。經(jīng)本研究內(nèi)容得，在17564例無償獻(xiàn)血者的血液樣本中，經(jīng)過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測，共有25例HBV-DNA陽性，0例HCV-RNA和HIV-1-RNA陽性。由此可見，在血站檢測中，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)具有高靈敏度和良好的重復(fù)性，使其成為更好、更直接和更容易使用的選擇。使用該方法可以更好的整合實(shí)驗(yàn)步驟，提高實(shí)驗(yàn)室的自動化水平，進(jìn)一步簡化操作并提高效率，更高效地提取核酸，設(shè)計靈敏且特異的核酸測試方法[15]。在具體檢測操作時，有以下幾點(diǎn)內(nèi)容需要注意[16]：①確保樣本的質(zhì)量，使用無脂血、溶血和黃疸的合格樣本。②確保試劑的存放條件符合要求，常溫保存的提取試劑要保存在18°C～30°C，擴(kuò)增試劑要保存在-20°C～40°C，質(zhì)控品最好保存在-80°C，這樣可以認(rèn)為在較長一段時間內(nèi)的質(zhì)控品的品質(zhì)都是一致的。③定期校驗(yàn)核酸提取設(shè)備和PCR擴(kuò)增設(shè)備，及時發(fā)現(xiàn)設(shè)備性能的變化。④切實(shí)做好防污染措施，確保進(jìn)入擴(kuò)增的八聯(lián)管都蓋緊了，并及時將擴(kuò)增產(chǎn)物傳遞到廢物處理間，防止擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。⑤作好實(shí)驗(yàn)室被擴(kuò)增產(chǎn)物污染的應(yīng)急預(yù)案，除了及時消除被污染的擴(kuò)增產(chǎn)物外，同時啟用其他未被污染的區(qū)域和設(shè)備完成后續(xù)檢測；如果污染嚴(yán)重，本站無法完成何時檢測，則應(yīng)應(yīng)急啟動互為備份核酸檢測實(shí)驗(yàn)室的友鄰血站核酸實(shí)驗(yàn)室完成后續(xù)檢測。

在核酸擴(kuò)增檢測過程中，AFD4800實(shí)時熒光PCR儀，能夠快速、準(zhǔn)確地把目標(biāo)病毒模板以2的n次方倍數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過45個循環(huán)后可以達(dá)到2的45次方的天文數(shù)字，理論上只要有一個目標(biāo)病毒的模板存在都能被檢測出來。臺式冷凍離心機(jī)是必不可少的工具，它能在離心機(jī)高速旋轉(zhuǎn)時降低因空氣摩擦導(dǎo)致的樣本溫度升高，防止待測病毒被降解。生物安全柜則提供了一個安全的工作環(huán)境，確保操作人員安全，提高實(shí)驗(yàn)的效率和準(zhǔn)確性[17]。STAR全自動化樣本處理系統(tǒng)和FAME24/20全自動酶免檢測系統(tǒng)進(jìn)一步提高了酶免實(shí)驗(yàn)的自動化程度，減少了操作人員的工作量，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性?？傊?，以上列舉的設(shè)備在血站核酸檢測中發(fā)揮著各自的作用，共同構(gòu)建了一個高效、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)流程，為血站的工作提供了重要的支持。血站通過這些設(shè)備的使用，能夠更有效的發(fā)現(xiàn)處于窗口期的獻(xiàn)血者，確保臨床用血的安全供應(yīng)。

綜上所述，在血站核酸檢測中采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，可以有效縮短病毒檢測窗口期，能提升對窗口期無償獻(xiàn)血者的篩查能力，有助于血液安全水平的提高。