劉家煜 江西省贛州市會昌縣人民醫(yī)院 （江西 贛州 342600）

內(nèi)容提要： 目的：對比分析膠體金法與熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法在流感樣呼吸道感染病原體實驗室檢測。方法：選取2023年4月本院收治的245例流感癥狀上呼吸道感染患者，以熒光定量PCR法檢查結(jié)果為金標準，比較熒光定量PCR法、膠體金法的陽性檢出率。結(jié)果：245例流感癥狀上呼吸道感染患者，用熒光定量PCR法檢測出陽性165例，用膠體金法進行甲型流感病毒抗原檢測出陽性96例，通過對比兩種不同檢測方法發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR法的檢測靈敏度高于膠體金法，Kappa值為0.904。熒光定量PCR法對不同病毒類型的診斷陽性率均高于膠體金法。結(jié)論：熒光定量PCR檢測具有檢測速度快、準確度高、假陽性率低等優(yōu)點，有利于提高醫(yī)務(wù)人員對流感病毒的檢測質(zhì)量，對合理控制流感疫情具有積極的影響。

呼吸道感染按部位可分為上呼吸道感染和下呼吸道感染[1]。不同的病原體感染可能表現(xiàn)出相似的癥狀和影像學改變，而同一病原體感染的癥狀和影像學改變則具有異質(zhì)性，給呼吸道感染的臨床診斷帶來了很大困難[2]。目前，呼吸道流感病毒分為三種類型：甲型、乙型和丙型。甲型流感病毒經(jīng)常以流行病的形式出現(xiàn)，且具有極強的變異性，可導致全球流感大流行；乙型流感病毒經(jīng)常在局部地區(qū)流行；丙型流感病毒主要以分散形式出現(xiàn)，主要攻擊嬰幼兒，通常不會引起大流行。因此，對甲型和乙型流感病毒進行抗原檢測非常重要[3]。對于呼吸道流感病毒感染，一般通過鼻咽抽吸物或鼻咽拭子進行檢測。不過，鼻咽標本中病原體的檢測通常要通過活檢才能明確，而活檢可能會導致鼻咽黏膜出血并發(fā)炎癥感染[4]。膠體金檢測是將抗原-抗體免疫反應(yīng)與膠體金標記和跟蹤技術(shù)相結(jié)合，對抗原和抗體進行定性檢測的一種技術(shù)。由于膠體金檢測具有迅速、方便、廉價、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，在臨床檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。熒光探針聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）方法可定性檢測人體咽拭子樣本中上述六種病原體的核酸，可對呼吸道病原體感染進行分子診斷，具有提前、迅速、靈敏度高、準確度高等優(yōu)點，能更好地幫助醫(yī)生診斷感染源，實現(xiàn)抗生素的合理使用，減少耐藥菌株的出現(xiàn)和流行。在現(xiàn)階段的流感病毒檢測工作中，主要采用膠體金法和熒光定量PCR檢測方法來快速檢測病毒[5]。本研究旨在對比分析流感病毒抗原檢測膠體金法與流感病毒核酸檢測熒光定量PCR法在流感樣呼吸道感染病原體實驗室檢測，為臨床診斷流感樣呼吸道感染病原體提供幫助。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

選取2023年4月本院收治的245例流感癥狀上呼吸道感染患者，其中男性140例，女性105例，年齡24～58歲，平均（35.28±10.06）歲。患者家屬簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審核、通過。

納入標準：①臨床表現(xiàn)為高燒、頭痛、全身疼痛、四肢無力、咳嗽和喉嚨痛；②肺部呼吸音粗糙或有干濕性啰音；③無其他感染性疾病。排除標準：①年齡不滿18歲；②妊娠期、孕期患者；③患有自身免疫性疾病。

1.2 方法

膠體金法：利用免疫層析技術(shù)，采用雙抗體夾心法檢測流感病毒抗原。檢測時，將處理后的待測樣品液體滴加在測試卡的加樣孔，當待測樣本中含有甲型流感病毒抗原且抗原濃度高于最低檢出量時，病毒抗原先和標記抗體形成反應(yīng)復(fù)合物，在層析作用下，復(fù)合物沿著硝酸纖維素膜向前移動，被硝酸纖維素膜上檢測區(qū)預(yù)先包被的甲型流感病毒核蛋白單克隆抗體捕獲，在檢測區(qū)上形成一條紅色反應(yīng)線。如果檢測卡上的對照區(qū)和檢測區(qū)都出現(xiàn)紅色條帶，則檢測結(jié)果為陽性；如果檢測卡上的紅色條帶僅出現(xiàn)在對照區(qū)，則檢測結(jié)果為陰性。

熒光定量PCR：充分振蕩混勻病毒采樣溶液，取200μL采樣溶液，使用達安Stream SP96全自動核酸提取儀以磁珠法提取樣品核酸，提取好的核酸產(chǎn)物用達安基因核酸擴增試劑在全自動ABI7500熒光定量PCR儀上進行核酸擴增，檢測樣本中是否含有甲型流感病毒核酸目的基因。

1.3 觀察指標

①診斷結(jié)果：由兩名經(jīng)驗豐富的醫(yī)師對膠體金法和熒光定量PCR進行鑒別診斷，并比較其檢測的陽性率。②不同病毒類型診斷陽性率：比較膠體金法和熒光定量PCR對甲、乙、丙三種類型病毒的診斷陽性率。

1.4 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，對符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗。采用Kappa檢驗進行一致性分析，P＜0.05提示數(shù)據(jù)差異在統(tǒng)計學研究中有意義。

2.結(jié)果

2.1 診斷結(jié)果

245例流感癥狀上呼吸道感染患者，用熒光定量PCR法檢測出陽性165例，用膠體金法進行甲型流感病毒抗原檢測出陽性96例，通過對比兩種不同檢測方法發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR法的檢測靈敏度高于膠體金法，Kappa值為0.904，見表1。

表1.膠體金法、熒光定量PCR檢測的診斷結(jié)果(n)

2.2 不同病毒類型的診斷陽性率

熒光定量PCR法對不同病毒類型的診斷陽性率均高于膠體金法，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2.膠體金法、熒光定量PCR檢測的診斷陽性率比較(n/%)

3.討論

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，具有很強的傳染性，通常表現(xiàn)為發(fā)熱，伴有畏寒、寒戰(zhàn)、頭痛、肌肉和關(guān)節(jié)痛、極度乏力、食欲不振等全身癥狀，常伴有咽痛和咳嗽，可有鼻塞、流涕、胸骨后不適、顏面潮紅和眼結(jié)膜輕度充血，以及嘔吐、腹瀉等癥狀。流感病毒主要分為甲、乙、丙三種類型，甲型和乙型流感病毒主要在亞洲地區(qū)和國內(nèi)地區(qū)引起流感。引起呼吸道感染的病原菌種類繁多，發(fā)病時間短，潛伏期長，傳播速度快，傳染性強，且不同的病毒對患者的影響具有一定的差異性，往往會導致大規(guī)模的流行病，如果不能合理控制，還會導致流感合并暴發(fā)其他感染類疾病，嚴重者甚至危及生命，對人類健康造成極為不利的影響[6]。在臨床過程中，由于流感患者的初期癥狀與普通感冒有很強的相似性，容易造成醫(yī)務(wù)人員的誤診，不利于第一時間有效發(fā)現(xiàn)流感疫情和合理控制疫情。在流感病毒檢測中，病毒培養(yǎng)是一種金標準方法，但是，由于病毒培養(yǎng)時間相對較長，操作步驟繁瑣，因此在流感疫情監(jiān)測中的應(yīng)用相對較少。從檢測效率的角度來看，膠體金法抗原檢測和熒光定量PCR的核酸檢測速度相對較快，能在較短時間內(nèi)出檢測報告，更好地滿足臨床需求。但經(jīng)過詳細分析，研究人員發(fā)現(xiàn)膠體金法抗原檢測產(chǎn)生抗體的時間不同，化驗結(jié)果會有延遲或假陽性、假陰性；而熒光定量PCR利用熒光探針技術(shù)和光電導體，可以將DNA雜交的高特異性和光譜學的高精確性結(jié)合起來，直接檢測基因擴增過程中熒光信號的變化，從而得出定量結(jié)果。與準確度更高的熒光定量PCR相比，膠體金法抗原檢測不利于保證其準確性[7]。

本研究結(jié)果顯示，熒光定量PCR法的檢測準確度高于膠體金法，分析其原因在于，熒光定量PCR檢測從提取病毒RNA到顯示檢測結(jié)果大約需要2.5～4h，高速度和高通量使96個樣品的定量分析都可在2～3h內(nèi)完成，比其他方法耗時更短。同時，熒光定量PCR檢測是PCR技術(shù)、熒光標記技術(shù)、激光技術(shù)和數(shù)字成像技術(shù)的結(jié)合。熒光信號的產(chǎn)生與每個擴增產(chǎn)物是一一對應(yīng)的，其對甲型流感病毒具有高度特異性，能將DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性結(jié)合起來，利用熒光探針和光電導直接檢測基因擴增過程中熒光信號的變化，得出定量結(jié)果，從而對分子進行高精度的定量分析。在這種情況下，引物和探針都能控制目標序列，特異性好，假陽性率低[8]。此外，熒光定量PCR檢測法操作簡便、速度快，可利用計算機和分析軟件將PCR擴增、產(chǎn)物檢測和定量分析整合在一起，結(jié)果觀察直觀，避免誤判。而且PCR擴增和產(chǎn)物分析均在全封閉條件下進行，擴增和檢測可在同一試管中一步完成，無須開蓋，不易污染，避免了傳統(tǒng)開放式PCR檢測造成的環(huán)境污染和假陽性結(jié)果[9]。

細菌感染往往繼發(fā)于病毒感染，隨著臨床上抗感染藥物的增多，耐藥細菌菌株的數(shù)量也在增加，病毒變種也很常見，因此，快速準確地識別導致感染的病原體并選擇有效的抗生素或抗病毒藥物非常重要。但有研究結(jié)果表明，選擇藥物治療可能只是兩擊之一，更重要的方法還是要準確判斷感染菌[10]。在傳統(tǒng)的PCR中，PCR擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物通常通過凝膠電泳進行分離，并通過熒光染色進行檢測，但長期的臨床應(yīng)用證實了用這種終點方法對PCR產(chǎn)物進行定量是不可靠的。在熒光定量PCR中，PCR反應(yīng)的整個擴增過程都被實時監(jiān)控，與擴增相關(guān)的熒光信號被持續(xù)分析，監(jiān)控到的熒光信號的變化可以隨著反應(yīng)時間的推移繪制成曲線。在PCR反應(yīng)的早期階段，熒光水平與背景無法明顯區(qū)分，隨后熒光進入指數(shù)期、線性期和最后的高原期，可以檢測到PCR反應(yīng)指數(shù)期某一點上的PCR產(chǎn)物量，并由此推斷出原始模板的含量。與傳統(tǒng)檢測方法相比，熒光定量PCR檢測技術(shù)不僅能有效檢測基因突變，還能準確檢測癌基因的表達。不僅如此，熒光定量PCR檢測技術(shù)還采用先進的高精度逐管檢測系統(tǒng)，進一步提高了熒光強度檢測的準確性。本研究結(jié)果顯示，熒光定量PCR法的靈敏度、準確度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均高于膠體金法，說明實時熒光定量PCR不僅具有傳統(tǒng)PCR的高靈敏度，而且其檢測結(jié)果既可定性又可定量，靈敏度高，無需凝膠電泳，節(jié)省了實驗時間，提高了生產(chǎn)效率。此外，實時熒光定量PCR檢測的結(jié)構(gòu)設(shè)計經(jīng)過精心優(yōu)化，穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)可以減少溫度、振動等因素對儀器運行的影響，從而保證實驗過程中數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，避免重復(fù)性工作，縮短醫(yī)護人員和患者的時間，提高了患者的舒適度和接受度，促進了患者診斷效果的提高[11]。

綜上所述，熒光定量PCR檢測具有檢測速度快、準確度高、假陽性率低等優(yōu)點，有利于提高醫(yī)務(wù)人員對流感病毒的檢測質(zhì)量，對合理控制流感疫情具有積極的影響。