李沅 梁慧媛 董雙鵬 王翔宇 天津市醫(yī)療器械質量監(jiān)督檢驗中心 （天津 300384）

內容提要： 采用A級建模方法，進行體內體外相關性分析，獲得具有顯著性意義的直線回歸方程，體內(d)=3.42×體外(h)-0.367，通過體內體外相關性的建立，可以預測藥物在體內的吸收情況。

雷帕霉素藥物洗脫支架近年來在冠狀動脈介入治療領域的應用數(shù)量日趨增多，然而對藥物洗脫支架中有關藥物涂層的體內體外相關性的研究報道較少，尚處于起步階段。本文以某公司生產的洗脫支架為例，開展它的體外釋放率與體內體外相關性研究。體內體外相關性指藥物的體內性質與體外性質之間的關系通過數(shù)學模型建立起來[1]。藥物的療效主要取決于作用部位的血藥濃度和作用時間，然而單純依賴體內試驗獲得相關數(shù)據(jù)，不僅操作繁瑣而且時限長、實驗要求高，因此，通過模擬體內環(huán)境，利用體外實驗來準確預測藥物在體內的行為就顯得尤為重要。本文于2013年～2014年通過設計合理的體內體外實驗，建立合適的體內體外相關性模型，不僅可以準確地預測藥物在體內的特征，還可以指導并優(yōu)化其處方設計。

1.體外實驗

1.1 一般材料

實驗樣品：美國某公司提供的藥物洗脫支架。

儀器設備：高效液相色譜儀，水浴搖床。

試劑：乙腈（色譜純）、醋酸銨（色譜純）、solutol試劑、鹽酸、其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 體外洗脫液的制備

以醋酸銨緩沖液制備1%的Solutol溶液，超聲波脫氣，然后乙腈與1%的Solutol（聚乙烯醇660 12-羥基硬脂酸）溶液1:1混合作為浸提介質，使用0.1mol/L鹽酸調節(jié)pH為6.0。

1.2.2 對照品溶液的制備

標準儲備液（200 μg/mL），然后用移液管準確吸取2.5、7.5、12.5、25、37.5mL儲備液至100mL容量瓶，制得5、15、25、50、75 μg/mL對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

使用移液管，在洗脫玻璃瓶中加入適當體積的洗脫液，18mm支架洗脫液4.0mL。支架要完全浸沒于洗脫介質中，使支架與洗脫介質充分接觸，利于支架上藥物的有效浸提。

1.2.4 體外洗脫程序

在進行洗脫前應平衡搖床溫度和轉速，搖床內水浴用水應覆蓋玻璃瓶底部以上2cm，需要時補水。為模擬人體血液環(huán)境進行試驗，將恒溫水浴溫度設定為37.0°C，溫度不允許偏離（37.0±0.5）°C；為模擬人體血液流速，將轉速平衡到100r/min。使用移液管在洗脫玻璃瓶中加入適當體積的洗脫液，具體容量為4.0mL，將支架放進含有洗脫液的玻璃瓶中，同時打開計時器。當達到特定時間點時（時間采樣間隔是10min、20min、30min、45min、60min、240min）。用一個由0.016in不銹鋼絲制成的掛鉤（或等效物）從玻璃瓶中取出支架。處于掛鉤上時，為防止各個時間點的交叉污染，使用一塊錐形無絨布的尖端部分僅僅觸及支架最末端的底部，擦除支架內剩余的液體，然后將支架移至下一個含有洗脫液的玻璃瓶中，蓋上取出支架的玻璃瓶，混合均勻，繼續(xù)進行洗脫試驗至下一個時間點。

1.2.5 計算公式

時間T時玻璃瓶中的藥物含量(μg)見公式（1）：

其中，Asam：供試品峰面積；Astd：對照品峰面積；V：玻璃瓶內洗脫液的體積（mL）；Cstd：對照品濃度（μg/mL）

1.2.6 體外釋放率分析

選取3批18mm支架，每批每個洗脫時間點各一枚，按1.2.3項下的條件制備供試品溶液，按照表1的色譜條件取20μL供試品、標準品及空白溶液進行測試，按外標法以峰面積計算含量。

表1.HPLC色譜條件

表2.HPLC梯度洗脫時間表

1.3 結果

3批樣品體外釋放率的測定結果，見圖1。

圖1.18mm 支架上藥物體外釋放曲線

從圖1得出：3批支架的釋放曲線趨勢基本一致，10min的釋放率在30%～40%，20min的釋放率在50%～60%，30min的釋放率在70%～80%，45min的釋放率均達到80%以上，60min的釋放率均達到90%以上，240min基本達到100%。藥物在4h內幾乎都能從支架中釋放出來，其中，以前30min的釋放量最大，占整個緩釋周期量的70%左右。釋放曲線都經歷了初期的快速釋放階段和后期的平緩釋放階段，符合緩釋制劑體外釋放曲線趨勢圖，滿足臨床預期用途。由于3批支架的結果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，表明批與批之間的生產工藝穩(wěn)定。

2.體內實驗

2.1 一般材料

選取3個月月齡的體重在25～35kg的小型豬（天津裕達實驗動物養(yǎng)殖有限公司）。

2.2 方法

2.2.1 體內釋放程序

參考《中華人民共和國藥典》關于藥物緩釋、控釋和遲釋制劑指導原則進行。以上述小型豬為觀察對象，選取18mm支架3枚，每個時間點各植入1枚。植入支架前3d和植入支架后的每天每只動物經口飼給予阿司匹林（100mg/d）和氯吡格雷（75mg/d），直至規(guī)定的取樣時間。術前每只動物分別給予氯胺酮麻醉，經股動脈建立通道后，給予肝素，于右冠狀動脈植入支架，術后給予抗生素預防感染。

術后0.5d、1d、3d、5d、7d、14d在肝素化下分別麻醉處死動物，立即取出支架段血管，磷酸鹽緩沖溶液沖洗后取出支架待測。

對于藥物洗脫支架，可通過確定血液藥物濃度數(shù)據(jù)以及通過測量支架中殘留藥物含量對藥物的體內釋放進行評估。盡管在體內體外相關性研發(fā)時可采用一種或兩種方法生成的數(shù)據(jù)，但對于藥物洗脫支架，全身藥物水平可能非常低或低于檢出限。因此，在構建體內體外相關性模型時從取出的支架上測得體內釋放數(shù)據(jù)將變得更加可行。

2.2.2 體內藥物回收分析

從動物體內取出的支架按照供試液下的條件制備待測液，按照表1的色譜條件進行測試，支架理論帶藥量即為0天帶藥量，然后依次測定不同時間點取出的藥物支架的帶藥量即為取出支架上殘留的藥量。

2.2.3 體內藥物吸收分析

通過0d支架的理論載藥量減去各個時間點的藥物回收，得出豬體內的藥物吸收含量。

2.3 結果

2.3.1 體內藥物回收分析

豬體內18mm支架上藥物回收量，具體見表3。

表3.豬體內18mm支架上藥物回收量(μg)

2.3.2 體內藥物吸收分析

豬體內的藥物吸收含量，具體見表4。

表4.豬體內支架上藥物吸收量(μg)

為使其在直觀上和數(shù)學上易于和體外藥物洗脫百分率相比較，將數(shù)據(jù)由體內藥物吸收（μg）轉化為體內藥物洗脫百分率，將體內吸收率和時間的對應關系進行曲線擬合，從圖2中可以得出在豬體內的藥物吸收達到100%，滿足支架的預期用途。藥物在10d內幾乎都能從支架中釋放出來，其中以前1d的釋放量最大，占整個緩釋周期量的70%左右。釋放曲線都經歷了初期的快速釋放階段和后期的平緩釋放階段，符合緩釋制劑體外釋放曲線趨勢圖。釋放曲線體現(xiàn)了支架在體內的釋放情況。

圖2.18mm 支架上藥物體內吸收曲線

3.體內體外線性方程分析

體內和體外的洗脫曲線是相似的，縱坐標釋放率相同，但橫坐標不同，體外釋放的橫坐標時間為“d”，體外釋放的橫坐標時間為“min”。為了更好地確定體內和體外洗脫時間之間的關系，計算相同藥物洗脫百分率下的體內體外部分反應時間對應關系見表5。

表5.體內體外時間對應關系

本文采用A級相關性方法，對體內藥物吸收數(shù)據(jù)與體外藥物溶出數(shù)據(jù)進行比較研究，將試樣體內吸收曲線上和體外釋放曲線對應的各個時間點的吸收百分率和釋放百分率利用線性最小二乘法回歸原理進行回歸，其前提條件是當藥物釋放為體內藥物吸收的限速因素時，可得到直線回歸方程，見圖3。

圖3.體內體外線性相關性圖

通過圖1～3可以得出：體內和體外部分反應時間之間的數(shù)學關系是線性的，線性相關系數(shù)高達0.96。在線性相關的條件下，體外釋放曲線與體內吸收曲線可以通過換算因子達到部分或完全重合。模型創(chuàng)建后，可以利用藥物在體外釋放的數(shù)據(jù)來預測藥物在體內的吸收情況，即藥物體外溶出度與藥物體內吸收值之間的相關性。本文體內體外相關性線性方程為：體內(d)=3.42×體外(h)-0.367，這意味著體內和體外試驗數(shù)據(jù)的關系近似于3d和1h的關系。也就是說，體外1h洗脫的藥量將相當于體內3d的洗脫量。表明可以通過體內體外相關性的建立來預測體內的吸收情況。

4.討論

藥物洗脫支架是由藥物和器械組成的復合式產品[2]。影響藥物洗脫支架上藥物釋放的因素很多，主要包括藥物及載體本身的理化性質、藥物與載體的結合方式、藥物在載體中的分布狀況及其裝載模式。藥物一般通過物理分散、靜電吸附或化學鍵合的方式固定在載體中，藥物在載體中的分布直接影響其釋放動力學[3-5]。

藥物涂層支架的技術難點之一在于研究藥物釋放技術，保證在適當?shù)臅r間有適當劑量的藥物釋放到血管壁中。既不能使藥物在較短時間內全部釋放，又不能使藥物的釋放時間過長。因為藥物釋放時間短，不能達到在置入支架后抑制平滑肌細胞增生起到防止再狹窄的作用，而釋放時間過長，又會導致置入的支架在血管內移動。因此需要精確測定藥物涂層支架的藥物釋放速率，計算藥物釋放時間。

藥物體外溶出度試驗是指藥物在指定的介質中溶出的速率和程度，藥物的體內釋放特性可通過體外溶出度試驗來反映，反映其在體內的生理循環(huán)過程，包括吸收、分布、代謝和排泄。雖然現(xiàn)在藥劑學水平不能達到溶出度試驗結果與體內完全一致，只是建立了一定的相關性，但通過體外溶出度試驗的方法可以檢驗和控制產品質量。溶出度試驗雖非必然與體內完全相關，但多數(shù)情況下是相關的。溶出試驗是介于藥品質量控制和生物等效性二者之間的一項強有力的技術措施，它是利用體外試驗來代替體內動物試驗的方法，由于與生物利用度密切聯(lián)系，因此可作為質量控制的一項重要手段。為模擬人體的血液流動，溶出度試驗裝置需要設定合理的轉速，為模擬人體體液，釋放介質多選用醋酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖溶液等。

要想獲得體內外相關性，應收集兩組數(shù)據(jù)。第一組數(shù)據(jù)應包括體外數(shù)據(jù)，通常是洗脫試驗中的藥物釋放數(shù)據(jù)，而且通常以作為時間函數(shù)的藥物釋放百分比形式表示。第二組數(shù)據(jù)為體內數(shù)據(jù)。對于藥物洗脫支架，全身藥物水平可能非常低或低于檢測限。因此，在構建體內體外相關性模型時從取出的支架上測得體內釋放數(shù)據(jù)將變得更加可行。

當獲得體外和體內數(shù)據(jù)時，應研究并闡述體外和體內數(shù)據(jù)組之間相關的數(shù)學模型。確定體外釋放和體內組織吸收之間是否存在相關性的一種機制是描述相同時間點的體外藥物釋放量和體內藥物釋放量，以觀察是否存在點-點關系（A級相關性）。嘗試研究此種關系時，應固定體內數(shù)據(jù)組。一旦生成該信息，就確定了藥物洗脫支架產品的相關性能。另一方面，可通過改變釋放試驗條件而修改體外釋放性能，以獲得體外藥物釋放百分比與體內藥物釋放分數(shù)之間的一致性。

目前利用體外模型來預測體內的特征曲線還處于不斷研究和改善的階段，另外由于藥物的理化性質、生物藥劑學特征、設計劑型、藥物載體的不同等各種綜合因素的影響，很難建立一個通用的體外模型，因此體內體外相關性的研究只能逐例建模。如何選擇最優(yōu)模型，并最大準確度地預測藥物制劑的體內行為，對于用藥安全、制劑開發(fā)等重要課題有著深遠的意義。

本文體內外相關性的根本目標是確定藥物洗脫支架產品體外釋放行為和體內性能之間有意義的相關性，從而可將體外釋放數(shù)據(jù)代替體內性能使用。因此，體內體外相關性研發(fā)和評價的主要目標是利用體外釋放試驗作為體內生物適用性的替代方法。確定體內體外相關性的另一個主要附加目的是當申請為放大比例和批準后的生產工藝改變時，最小化所需要的人體試驗的數(shù)量。在確定體內體外相關性時考慮以下因素：支架中藥物釋放機制、影響釋放動力學的配方和制造工藝因素、體外方法條件、體內支架展開因素等。