方麗 徐超 國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心 （北京 100081）

內(nèi)容提要： 隨著遺傳性耳聾相關(guān)基因的研究進(jìn)展以及檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新基因、新位點(diǎn)以及新技術(shù)應(yīng)用到耳聾相關(guān)基因檢測(cè)的體外診斷試劑領(lǐng)域。文章對(duì)已批準(zhǔn)產(chǎn)品以及此類產(chǎn)品在注冊(cè)申報(bào)中臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)注點(diǎn)作簡(jiǎn)要闡述。

2021年3月，世界衛(wèi)生組織發(fā)布了首份《世界聽力報(bào)告》[1]，聽力損失影響全球超過15億人，約占全球人數(shù)的五分之一。目前我國有聽力語言障礙的殘疾人2057萬，耳聾在新生兒中的發(fā)病率為1‰～3.47‰，遺傳因素致聾比例達(dá)50%～60%[2,3]。60%的重度耳聾與遺傳有關(guān)，另外40%可能與環(huán)境因素有關(guān)。在遺傳性耳聾中，根據(jù)是否伴有多個(gè)系統(tǒng)病變又分為綜合征型耳聾與非綜合征型耳聾。遺傳性耳聾的遺傳方式主要有四種，常染色體顯性遺傳（15%～20%）、常染色體隱性遺傳（約80%）、性連鎖（1%）及線粒體遺傳性耳聾（1%）[3]。遺傳性耳聾具有較強(qiáng)的基因異質(zhì)性。中國人群中最常見的致聾基因有GJB2、SLC26A4，其中GJB2基因235delC突變是中國耳聾患者中發(fā)生頻率最高的突變形式，有18.26%的耳聾患者攜帶此突變；其次是SLC26A4基因c.919-2A＞G突變是中國大前庭水管患者群的熱點(diǎn)突變，15.23%的耳聾患者攜帶此突變，74.8%的大前庭水管患者攜帶此突變[4-6]。

1.國內(nèi)相關(guān)產(chǎn)品的注冊(cè)情況

采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)遺傳性耳聾相關(guān)基因突變對(duì)于耳聾患者的遺傳學(xué)診斷以及早期干預(yù)和治療至關(guān)重要[7-9]。隨著耳聾相關(guān)基因的研究進(jìn)展以及檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，申報(bào)產(chǎn)品從最初的單個(gè)基因單突變位點(diǎn)檢測(cè)逐漸到多基因多突變位點(diǎn)的檢測(cè)。申報(bào)產(chǎn)品所采用的方法學(xué)多種多樣，如熒光PCR方法、熒光PCR熔解曲線法、PCR-反向點(diǎn)雜交法，以及微陣列芯片法、聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法、飛行時(shí)間質(zhì)譜法等。

截至2023年6月，已批準(zhǔn)的遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測(cè)試劑共11個(gè)，檢測(cè)的基因位點(diǎn)已覆蓋四個(gè)基因的20余個(gè)突變位點(diǎn)（表1），樣本類型包括靜脈全血和干血斑。目前所批準(zhǔn)的檢測(cè)試劑的預(yù)期用途均為“用于遺傳性耳聾的輔助診斷”。

表1.已批準(zhǔn)的基因及突變位點(diǎn)

近年來遺傳性耳聾相關(guān)基因的檢測(cè)產(chǎn)品所申報(bào)的突變位點(diǎn)逐漸增多，后續(xù)還會(huì)有更多的涉及新位點(diǎn)檢測(cè)產(chǎn)品的申報(bào)。對(duì)于境內(nèi)未有已批準(zhǔn)同類產(chǎn)品的新基因變異的臨床證據(jù)應(yīng)如何認(rèn)可，是此類產(chǎn)品技術(shù)審評(píng)中的疑難問題之一。另外我國已批準(zhǔn)的遺傳性耳聾相關(guān)基因的檢測(cè)產(chǎn)品的預(yù)期用途均為遺傳性耳聾的輔助診斷。針對(duì)新生兒耳聾基因篩查，臨床上陸續(xù)有《遺傳性耳聾基因變異篩查技術(shù)專家共識(shí)》[4]《遺傳性耳聾篩查規(guī)范》[2]對(duì)外發(fā)布，全國較多城市啟動(dòng)新生兒遺傳性耳聾基因篩查。在臨床上針對(duì)新生兒進(jìn)行聽力與耳聾基因的聯(lián)合篩查，可作為常規(guī)物理聽力篩查的補(bǔ)充，特別是可發(fā)現(xiàn)常規(guī)物理聽力篩查無法檢出的藥物性致聾基因攜帶者和遲發(fā)性耳聾基因攜帶者，從而進(jìn)行早期干預(yù)和指導(dǎo)等[10-14]。目前已有申報(bào)新生兒篩查用途的檢測(cè)試劑已完成臨床試驗(yàn)并進(jìn)入注冊(cè)申報(bào)。

2.臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)注點(diǎn)

針對(duì)此類試劑的注冊(cè)現(xiàn)狀以及申請(qǐng)人在注冊(cè)申報(bào)中所面臨的難點(diǎn)，國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心在2020年啟動(dòng)了指導(dǎo)原則的編寫工作，經(jīng)過企業(yè)調(diào)研、邀請(qǐng)行業(yè)內(nèi)權(quán)威專家的研討、征求生產(chǎn)企業(yè)的意見等流程，于2021年該指導(dǎo)原則已對(duì)外發(fā)布，旨在給申請(qǐng)人在注冊(cè)申報(bào)過程中提供技術(shù)指導(dǎo)[15]。以下針對(duì)指導(dǎo)原則中對(duì)該類試劑在臨床試驗(yàn)開展過程中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注的問題逐一進(jìn)行闡述。

2.1 預(yù)期用途的聲稱

目前，遺傳性耳聾相關(guān)基因突變檢測(cè)在遺傳性耳聾的輔助診斷以及新生兒遺傳性耳聾基因突變篩查等領(lǐng)域有重要意義。例如通過對(duì)具有耳聾癥狀和/或體征的人群，以及其他需要進(jìn)行耳聾基因突變檢測(cè)的人群，如有耳聾家族史的人群等進(jìn)行耳聾基因突變的檢測(cè)可用于遺傳性耳聾的輔助診斷；對(duì)新生兒進(jìn)行遺傳性耳聾基因突變篩查，可作為常規(guī)物理聽力篩查的補(bǔ)充，特別是可發(fā)現(xiàn)常規(guī)物理聽力篩查無法檢出的藥物性致聾基因攜帶者和遲發(fā)性耳聾基因攜帶者，從而進(jìn)行早期干預(yù)和指導(dǎo)等。新生兒耳聾基因篩查聯(lián)合聽力篩查，可以有效提前遺傳性耳聾患兒的干預(yù)時(shí)間。新生兒遺傳性耳聾基因突變篩查用途的應(yīng)用應(yīng)符合國家及地方衛(wèi)生管理部門的相關(guān)規(guī)定。申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)申報(bào)產(chǎn)品所聲稱的預(yù)期用途，分別設(shè)計(jì)臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注不同的預(yù)期用途，入組人群應(yīng)不同，臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)亦不同。以下針對(duì)上述的兩個(gè)預(yù)期用途的臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)做重點(diǎn)闡述。

2.2 臨床試驗(yàn)入組人群

對(duì)于預(yù)期用途為遺傳性耳聾的輔助診斷的檢測(cè)試劑，入組人群應(yīng)為具有耳聾癥狀和/或體征人群以及有耳聾家族史的人群。臨床試驗(yàn)中不建議入組健康體檢人群或孕前檢查人群等，不正確的入組人群會(huì)導(dǎo)致入組人群的偏倚，無法正確地評(píng)價(jià)試驗(yàn)體外診斷試劑的臨床性能。

對(duì)于預(yù)期用途為新生兒遺傳性耳聾基因突變的篩查的檢測(cè)試劑，入組人群則應(yīng)為新生兒。臨床設(shè)計(jì)應(yīng)采用前瞻性入組病例的形式開展臨床試驗(yàn)。

2.3 臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的選擇

遺傳性耳聾相關(guān)基因突變檢測(cè)試劑屬于體外診斷試劑三類產(chǎn)品，按照法規(guī)要求，應(yīng)選擇至少三家經(jīng)醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)備案的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展臨床試驗(yàn)[16]。

對(duì)于開展新生兒耳聾基因篩查臨床試驗(yàn)的臨床機(jī)構(gòu)，臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)具有相關(guān)資質(zhì)，應(yīng)是各地衛(wèi)生健康部門指定的進(jìn)行新生兒耳聾基因篩查的臨床機(jī)構(gòu)。建議選擇不同地區(qū)的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展臨床試驗(yàn)，且臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)具有遺傳性耳聾的診療能力、常規(guī)開展遺傳性耳聾相關(guān)基因的檢測(cè)。操作人員應(yīng)經(jīng)過相應(yīng)的培訓(xùn)，并能熟練操作實(shí)驗(yàn)。

2.4 臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)

臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)與申報(bào)產(chǎn)品所聲稱的預(yù)期用途息息相關(guān)，預(yù)期用途不同，所采用的臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)亦應(yīng)不同。以下分別針對(duì)預(yù)期用途為“遺傳性耳聾輔助診斷”“新生兒耳聾基因篩查”的檢測(cè)試劑的臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行詳細(xì)闡述。

2.4.1 預(yù)期用途為“遺傳性耳聾輔助診斷”

對(duì)于有同類產(chǎn)品的申報(bào)產(chǎn)品，臨床試驗(yàn)中可選擇與已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行比較研究的方式。選擇已上市同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑時(shí)應(yīng)充分考慮其預(yù)期用途、方法學(xué)、樣本類型、所檢測(cè)的基因位點(diǎn)、分析性能等方面應(yīng)與申報(bào)產(chǎn)品具有良好的可比性。而對(duì)于尚無同類產(chǎn)品的申報(bào)產(chǎn)品，臨床試驗(yàn)中應(yīng)選擇參考方法（如一代測(cè)序法）進(jìn)行比較研究。此部分臨床試驗(yàn)可以回顧性富集入組臨床樣本，但不應(yīng)入組臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)留存的核酸。

對(duì)于申報(bào)產(chǎn)品中包含新基因位點(diǎn)的產(chǎn)品，除了與參考方法進(jìn)行比較研究外，還應(yīng)針對(duì)新位點(diǎn)的臨床意義提供臨床證據(jù)。如新突變位點(diǎn)的臨床意義已獲行業(yè)認(rèn)可（如：國內(nèi)相關(guān)指南或?qū)＜夜沧R(shí)），且上述認(rèn)可基于充分的中國人群的臨床研究數(shù)據(jù)，提交相關(guān)的指南或?qū)＜夜沧R(shí)即可。

如新突變位點(diǎn)未獲行業(yè)認(rèn)可，申請(qǐng)人首先應(yīng)提供該基因新突變位點(diǎn)與耳聾表型相關(guān)的遺傳學(xué)證據(jù)，包括但不限于：耳聾患者和正常人群的等位基因突變頻率、耳聾患者家系共分離、生物信息學(xué)分析、權(quán)威數(shù)據(jù)庫的信息等基于中國人群的充分的研究數(shù)據(jù)，對(duì)基因突變和表型的關(guān)系進(jìn)行評(píng)估，新突變位點(diǎn)應(yīng)具有明確致病性。申請(qǐng)人應(yīng)注意，針對(duì)新突變位點(diǎn)的家系研究，應(yīng)符合該突變位點(diǎn)家系內(nèi)基因型與聽力表型共分離，并不要求在臨床試驗(yàn)中開展該研究，可以是發(fā)表的文獻(xiàn)、研究成果等[17]。臨床試驗(yàn)中也應(yīng)納入新突變位點(diǎn)陽性的病例，應(yīng)分析基因型與臨床表型的相關(guān)性，可通過隨訪或其他臨床驗(yàn)證資料來證明。建議同時(shí)對(duì)所檢出攜帶新突變位點(diǎn)的耳聾患者進(jìn)行家系分析。

2.4.2 預(yù)期用途為“新生兒耳聾基因篩查”

針對(duì)此預(yù)期用途的臨床試驗(yàn)應(yīng)包括兩部分，篩查用途的確認(rèn)和臨床檢測(cè)準(zhǔn)確性的評(píng)價(jià)。

篩查用途的確認(rèn)應(yīng)前瞻性入組新生兒，申報(bào)試劑對(duì)所有入組受試者進(jìn)行檢測(cè)，病例基因變異狀態(tài)采用臨床參考標(biāo)準(zhǔn)（如：一代測(cè)序法）進(jìn)行確認(rèn)，評(píng)價(jià)申報(bào)試劑的臨床性能。對(duì)于聽力篩查異常的新生兒，應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的聽力檢查以確認(rèn)其聽力狀態(tài)以及基因突變狀態(tài)以避免申報(bào)試劑的假陰性。同時(shí)對(duì)先天性耳聾的新生兒應(yīng)提供病例的臨床診斷結(jié)果，臨床診斷結(jié)果應(yīng)有充分的依據(jù)，如采用現(xiàn)有條件下公認(rèn)的、可靠的、權(quán)威的疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)，疾病診療指南中明確的疾病診斷方法，行業(yè)內(nèi)的專家共識(shí)等。對(duì)于申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)出的遺傳性耳聾相關(guān)基因純合突變或復(fù)合雜合突變的新生兒，應(yīng)通過隨訪最終確認(rèn)該患兒的聽力狀態(tài)，以避免申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)的假陽性。

對(duì)于臨床檢測(cè)性能的評(píng)價(jià)，申請(qǐng)人還應(yīng)同時(shí)選擇已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品或參考方法作為對(duì)比試劑，與申報(bào)試劑進(jìn)行一定例數(shù)的比較研究試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)申報(bào)試劑的臨床準(zhǔn)確性。此部分驗(yàn)證位點(diǎn)應(yīng)涵蓋申報(bào)產(chǎn)品的所有突變位點(diǎn)。此部分研究可使用部分已確診（回顧性）的陽性病例進(jìn)行研究。應(yīng)在試驗(yàn)方案和報(bào)告中對(duì)病例選擇的方式和原因進(jìn)行明確的說明。

應(yīng)注意，申請(qǐng)新生兒遺傳性耳聾基因篩查預(yù)期用途的申報(bào)產(chǎn)品，其檢測(cè)的基因及突變位點(diǎn)，均應(yīng)為已得到行業(yè)內(nèi)公認(rèn)的、與遺傳性耳聾具有明確致病性關(guān)系的基因位點(diǎn)。并且對(duì)于篩查試劑，應(yīng)結(jié)合基因突變位點(diǎn)在中國人群的攜帶頻率考慮篩查的衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)考慮，不建議將攜帶頻率較低的突變位點(diǎn)納入新生兒篩查的檢測(cè)試劑的檢測(cè)范圍內(nèi)。

2.5 臨床試驗(yàn)樣本量

適宜的樣本量是保證臨床試驗(yàn)?zāi)軌虺浞衷u(píng)價(jià)試驗(yàn)體外診斷試劑的關(guān)鍵性因素。建議采用單組目標(biāo)值法進(jìn)行樣本量的估算，應(yīng)根據(jù)陽性符合率、陰性符合率分別進(jìn)行最低陽性樣本量及陰性樣本量的估算。對(duì)于常見的基因位點(diǎn)，總陽性樣本量、總陰性樣本量應(yīng)滿足上述最低樣本量的要求。同時(shí)對(duì)于臨床中較為常見的純合突變，如GJB2的c.235delC、SLC26A4的c.919-2A＞G能夠，臨床試驗(yàn)中應(yīng)納入一定例數(shù)。

對(duì)于在中國人群中攜帶率較低、臨床中較為罕見的突變位點(diǎn)，為了能夠在一定程度上評(píng)價(jià)試驗(yàn)體外診斷試劑對(duì)于此類突變位點(diǎn)的臨床檢測(cè)性能，臨床試驗(yàn)中也應(yīng)納入一定的例數(shù)，每種突變位點(diǎn)不少于5例。按照衛(wèi)健委2019年發(fā)布的《罕見病診療指南》[18]，遺傳性耳聾相關(guān)基因突變所導(dǎo)致的非綜合征性耳聾屬于罕見病，因此按照國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《用于罕見病防治醫(yī)療器械注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》[19]的相關(guān)規(guī)定，此類檢測(cè)試劑可以附條件上市，對(duì)于在臨床試驗(yàn)中納入病例較少的罕見位點(diǎn)，申請(qǐng)人可以上市后進(jìn)一步完成相關(guān)臨床驗(yàn)證工作。

對(duì)預(yù)期用途為新生兒耳聾基因篩查的申報(bào)試劑，根據(jù)臨床發(fā)病率、臨床診治情況及其他因素綜合考慮，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法估算最低陽性樣本量以及總樣本量。對(duì)于我國相對(duì)常見的遺傳性耳聾突變位點(diǎn)，如GJB2的c.235delC、c.299_300delAT、c.176-191del16，SLC26A4的c.919-2A＞G、c.2168A＞G、線粒體DNA 12S rRNA的m.1555A＞G突變等，應(yīng)通過前瞻性臨床試驗(yàn)檢出突變病例，總例數(shù)應(yīng)滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求；其他人群突變率相對(duì)更低的突變位點(diǎn)也應(yīng)盡可能在前瞻性臨床試驗(yàn)中檢出。

2.6 樣本類型

一般來說，用于遺傳性耳聾的輔助診斷，一般為抗凝外周血樣本類型；用于新生兒耳聾基因篩查的一般為干血斑樣本類型。對(duì)于同時(shí)聲稱抗凝外周血和干血斑兩種樣本類型的申報(bào)試劑，鑒于兩種樣本類型在樣本基質(zhì)、核酸總量等方面存在較大差異，在臨床試驗(yàn)中應(yīng)分別估算樣本量，分別進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。新生兒干血斑樣本的采集應(yīng)符合衛(wèi)健委發(fā)布的《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范》的相關(guān)要求。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

以四格表分別總結(jié)申報(bào)試劑與對(duì)比試劑/方法的定性檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算陽性符合率、陰性符合率、總符合率及其相應(yīng)的95%置信區(qū)間。除總體統(tǒng)計(jì)外，還要針對(duì)每一個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)純合突變以及雜合突變（或均質(zhì)突變和異質(zhì)突變）應(yīng)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以評(píng)價(jià)申報(bào)試劑與對(duì)比試劑/方法檢測(cè)結(jié)果的一致性。

對(duì)于與對(duì)比試劑/方法檢測(cè)不一致的樣本，應(yīng)結(jié)合臨床診斷背景信息、第三方檢測(cè)試劑等綜合進(jìn)行分析。

3.小結(jié)

隨著遺傳性耳聾基因相關(guān)研究的深入，越來越多的新基因和新位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)并被用于遺傳性耳聾的檢測(cè)。申請(qǐng)人在設(shè)計(jì)開發(fā)產(chǎn)品時(shí)，應(yīng)注意作為應(yīng)用于臨床的體外診斷試劑，并非檢測(cè)試劑所包括的基因及位點(diǎn)越多越好，而是應(yīng)關(guān)注納入的基因位點(diǎn)是否有充分的遺傳學(xué)證據(jù)的支持。尤其在應(yīng)用于新生兒耳聾基因的篩查中，應(yīng)考慮社會(huì)經(jīng)濟(jì)學(xué)因素，嚴(yán)格按照衛(wèi)健委相關(guān)部門的政策執(zhí)行。