崔婷婷，喬牡冬

（中國(guó)地質(zhì)調(diào)查局呼和浩特自然資源綜合調(diào)查中心，呼和浩特 010010）

醬油由多種谷物多種工藝釀造而成，是生活中常用的調(diào)味品[1-2]，醬油中常添加一定的防腐劑用于保鮮，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定使用的防腐劑有26種，其中對(duì)羥基苯甲酸甲酯屬于對(duì)羥基苯甲酸酯類。對(duì)羥基苯甲酸甲酯(尼鉑金酯)為白色結(jié)晶粉末，具有抗菌功能，應(yīng)用范圍廣，毒性低[3-4]，可以穿過(guò)細(xì)胞膜，讓蛋白質(zhì)變性，抑制細(xì)胞的呼吸酶活性和傳遞酶活性，起到防腐作用[5-6]，應(yīng)用于化妝品、食品等行業(yè)[7]。對(duì)羥基苯甲酸甲酯毒性較低，比鈉鹽、山梨酸、苯甲酸防腐效果好并且穩(wěn)定，常作為防腐劑使用。過(guò)量使用防腐劑可能會(huì)對(duì)人體造成傷害，影響生育能力[8]。目前，國(guó)家對(duì)于食品中添加防腐劑的量有嚴(yán)格的控制，GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定：醬油中對(duì)羥基苯基酸甲酯的最大使用量為0.25 g/kg。當(dāng)前，對(duì)于對(duì)羥基苯甲酸甲酯的檢測(cè)方法有氣相色譜法[9]、液相色譜法[10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[12]。醬油中的對(duì)羥基苯甲酸甲酯在檢測(cè)過(guò)程中，檢測(cè)結(jié)果與使用限量可能會(huì)接近，甚者則超過(guò)臨界值，測(cè)定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)人員對(duì)于結(jié)果的判斷，所以針對(duì)醬油中對(duì)羥基苯甲酸甲酯含量測(cè)定的不確定度評(píng)定，可以更加客觀、合理地評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果[13-15]。

依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.31—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的測(cè)定》，利用氣相色譜儀檢測(cè)醬油中對(duì)羥基苯基酸甲酯的含量。按照J(rèn)JF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》和JJG 196—2006《常用玻璃量器鑒定規(guī)程》要求，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)估，分析不確定度的主要來(lái)源，通過(guò)對(duì)醬油樣品重復(fù)測(cè)定、醬油樣品稱量、對(duì)羥基苯基酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液量取、對(duì)羥基苯基酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液純度、對(duì)羥基苯基酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中所使用的玻璃器具、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度進(jìn)行評(píng)定，以期提供科學(xué)、合理的檢測(cè)數(shù)值，從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，保證最終結(jié)果的可靠性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：GC-2010 型，日本島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司。

電子天平：BSA200S-WEⅠ型，感量為0.001 g，德國(guó)賽多利斯公司。

超純水機(jī)：XYG-90-H 型，北京湘順源科技有限公司。

對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 μg/mL，批號(hào)為80699JA，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

丙酮、乙醚：均為色譜純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

無(wú)水乙醇：色譜純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司。

鹽酸：色譜純，天津市匯源化工有限公司。

氯化鈉、碳酸氫鈉：分析純，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠。

硫酸鈉：分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確量取對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的對(duì)羥基苯甲酸甲酯中間液。用移液管分別吸取對(duì)羥基苯甲酸甲酯中間液5、2、1、0.4 mL于10 mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成質(zhì)量濃度分別為50、20、10、4 μg/mL 的對(duì)羥基苯甲酸甲酯系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品處理

采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.31—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的測(cè)定》方法處理醬油樣品，采取直接取樣的方法，稱取5 g (精確至0.001 g)醬油樣品于小燒杯中，并轉(zhuǎn)移至125 mL 分液漏斗中，用10 mL 飽和氯化鈉溶液分次洗滌小燒杯，合并洗滌液于125 mL分液漏斗，加入1 mL鹽酸溶液(37%濃鹽酸和水體積比為1∶1)酸化，搖勻，分別以75、50、50 mL 無(wú)水乙醚各提取1 次，每次2 min，放置1～2 min，棄去水層，合并乙醚層于250 mL分液漏斗中，加入10 mL飽和氯化鈉溶液洗滌一次，再分別以碳酸氫鈉溶液30、30、30 mL洗滌三次，棄去水層。用濾紙吸去漏斗頸部水分，將有機(jī)層經(jīng)過(guò)無(wú)水硫酸鈉(約20 g)濾入濃縮瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮近干，用氮?dú)獬埩羧軇?，?zhǔn)確加入2.0 mL無(wú)水乙醇溶解殘留物，作為樣品溶液。

1.2.3 氣相色譜儀工作條件

色譜柱：HP-5 毛細(xì)管柱[30 m×0.25 mm，0.25 μm，日本島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司]；進(jìn)樣口溫度：220 ℃；檢測(cè)器溫度：260 ℃；分流比：10∶1；色譜柱流量：1.0 mL/min；H2流量：40 mL/min；尾吹氣流量：3 mL/min；空氣流量：400 mL/min；程序升溫：100 ℃保持1 min，以20 ℃/min 升溫至170 ℃，再以12 ℃/min 升溫至220 ℃，保持10 min，以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持6 min；定量方法：色譜峰面積外標(biāo)法。

1.2.4 測(cè)量模型

依據(jù)GB 5009.31—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的測(cè)定》測(cè)定醬油樣品中對(duì)羥基苯甲酸甲酯的含量，按照式(1)進(jìn)行計(jì)算：

式中：wx——醬油樣品中對(duì)羥基苯甲酸甲酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；

ρ——由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的樣品溶液中對(duì)羥基苯甲酸甲酯的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——定容體積，mL；

f——換算因子，0.907 8；

m——醬油樣品質(zhì)量，g。

2 測(cè)量不確定度來(lái)源

根據(jù)1.2.4測(cè)量模型和檢測(cè)過(guò)程分析，醬油中對(duì)羥基苯甲酸甲酯含量測(cè)量不確定度的來(lái)源有：(1)醬油樣品重復(fù)測(cè)定引入的不確定度；(2)醬油樣品稱量引入的不確定度；(3)對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液量取引入的不確定度；(4)對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度引入的不確定度；(5)對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中所使用的玻璃器具引入的不確定度；(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過(guò)程引入的不確定度。

3 不確定度分量的評(píng)定

3.1 樣品重復(fù)測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)

樣品重復(fù)測(cè)定屬于A類不確定度?？瞻揍u油樣品加入對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg/mL)，6次重復(fù)檢測(cè)(n=6)，測(cè)定值(ρi)分別為20.894、19.928、18.428、18.804、18.497、18.560 μg/mL，平 均 值ρˉ=19.185 μg/mL。重復(fù)測(cè)定引入的不確定度為u(R)按照貝塞爾公式計(jì)算：

將測(cè)定數(shù)據(jù)代入式(2)，計(jì)算結(jié)果為：

3.2 樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

使用BSA200S-WEⅠ電子天平稱量醬油樣品，依據(jù)其檢定校準(zhǔn)證書(shū)，最大允許誤差為0.5 mg。按照矩陣分布評(píng)定，擴(kuò)展因子k= 3，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m)=0.5/k=0.289 mg，醬油樣品稱樣質(zhì)量(m)為5.017 g，則稱量醬油樣品引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液量取引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vs，0)

單標(biāo)線移液管1.0 mL 量取對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，最大允許誤差0.005。按照矩陣分布評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)不確定度，k= 3，則對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液量取引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(Vs，0)=0.005/k=0.002 887 mL，對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液量取為1.0 mL，則：

3.4 對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(ρs，0)

由對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液證書(shū)可知，質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)值ρs=1 000 μg/mL，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為2%(k=2)，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.5 對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程所用玻璃器具產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vs)

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中玻璃器具的主要不確定度為溫度和容量允許誤差(δ)。實(shí)驗(yàn)具體操作溫度為25 ℃，而國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)程JJG 196—2006《常用玻璃量器鑒定規(guī)程》中檢定溫度要求為20 ℃，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的玻璃器具檢定溫度與實(shí)際操作溫度相差5 ℃，只需考慮液體的體積膨脹[16]。對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的溶劑為丙酮，丙酮的膨脹系數(shù)為0.001 49 ℃-1，則溫度變化產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(VT)=(0.001 49×5×V)/k(V為玻璃器具規(guī)格，按均勻分布計(jì)算k= 3)；容量允許誤差(δ)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(Vδ)=δ/k(按均勻分布k= 3)，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(Vs，i)=相 對(duì) 標(biāo) 準(zhǔn) 不 確 定 度 為urel(Vs，i)=u(Vs,i)/Vs,i。對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液稀釋過(guò)程按照1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制，共使用10 mL容量瓶5 次，1 mL 移液管2 次，0.5、2、5 mL 移液管各1 次。配制對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)玻璃器具校準(zhǔn)引入的不確定度見(jiàn)表1。根據(jù)表1數(shù)據(jù)，對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液配制中玻璃器具引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

表1 玻璃器具引入的不確定度Tab.1 Uncertainty introduced by glassware

將各不確定度分量數(shù)據(jù)帶入公式(3)，計(jì)算得：

3.6 對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過(guò)程產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(L)

根據(jù)GB 5009.31—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的測(cè)定》，分別配制并測(cè)定5種不同濃度的對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用對(duì)應(yīng)色譜峰面積的對(duì)數(shù)Y及溶液質(zhì)量濃度ρ數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為Y=0.007 947 80ρ，相關(guān)系數(shù)r=0.998，標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Tab.2 Standard curve data table

對(duì)空白醬油樣品加入對(duì)羥基苯甲酸甲酯進(jìn)行6次重復(fù)檢測(cè)，平均質(zhì)量濃度ρˉ為19.185 μg/mL，由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按(4)計(jì)算：

式中：s——對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的標(biāo)準(zhǔn)

P——樣品平行檢測(cè)次數(shù)，P=6；

n——對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)次數(shù)，n=6；

ρˉ標(biāo)——標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的平均質(zhì)量濃度，ρˉ標(biāo)=36.047 8 μg/mL。

將上述帶入公式(4)計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(L)=0.000 011 μg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(L)=u(L)/ρ=0.000 001。

3.7 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(ρx)

綜上，試驗(yàn)過(guò)程中，影響檢驗(yàn)結(jié)果的各個(gè)因素引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表3。由表3可知，醬油樣品重復(fù)性測(cè)定、醬油樣品稱量是不確定度的主要來(lái)源，而對(duì)羥基苯基酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液量取、對(duì)羥基苯基酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液純度、對(duì)羥基苯基酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中所使用的玻璃器具、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度影響不大。

表3 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度一覽表Tab.3 List of relative standard uncertainty

合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

將各不確定度分量數(shù)據(jù)帶入公式(5)，計(jì)算得urel(ρx)=0.080 280。無(wú)對(duì)羥基苯甲酸甲酯的醬油空白樣品加入對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)得平均值為ρˉ=19.185 μg/mL，醬油樣品最后注入氣相色譜儀的定容體積V=2.0 mL，樣品取樣質(zhì)量為5.017 g，換算因子f為0.907 8，根據(jù)1.2.4測(cè)量模型，對(duì)羥基苯甲酸甲酯的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.94 mg/kg。

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.8 擴(kuò)展不確定度U

醬油中對(duì)羥基苯甲酸甲酯含量測(cè)定的擴(kuò)展不確定度為U=ux×k=3.080 325 mg/kg (置信概率P=95%，包含因子k=2)。

3.9 結(jié)果報(bào)告

氣相色譜法測(cè)定空白醬油樣品加入20 μg/mL對(duì)羥基苯甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)測(cè)定6次，其平均含量為(6.94±3.08) mg/kg，k=2。

4 結(jié)語(yǔ)

利用氣相色譜法測(cè)定醬油中對(duì)羥基苯甲酸甲酯的含量過(guò)程進(jìn)行不確定度評(píng)定，醬油樣品重復(fù)性測(cè)定、醬油樣品稱量是不確定度的主要來(lái)源，而對(duì)羥基苯基酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液量取、對(duì)羥基苯基酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液純度、對(duì)羥基苯基酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中所使用的玻璃器具、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度影響不大，因此在測(cè)定過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)人員實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，注意標(biāo)準(zhǔn)操作，避免由于個(gè)人原因帶來(lái)的誤差，最大程度地保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作的嚴(yán)謹(jǐn)性，從而提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。