周晗 耿軼釗 晏世偉3)

1) (北京師范大學(xué)物理學(xué)系,北京 100875)

2) (河北工業(yè)大學(xué)理學(xué)院,天津 300131)

3) (北京師范大學(xué)文理學(xué)院,珠海 519085)

p53 是一種腫瘤抑制蛋白,對(duì)阻礙癌癥發(fā)展、維持遺傳完整性起著至關(guān)重要的作用.在細(xì)胞核內(nèi),4 個(gè)p53 分子通過(guò)高度協(xié)同的方式、通過(guò)DNA 結(jié)合域與DNA 結(jié)合,形成穩(wěn)定的四聚體活性結(jié)構(gòu),并轉(zhuǎn)錄激活或抑制其靶向基因.然而,大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中存在大量p53 的突變,其中絕大部分突變發(fā)生在p53 的DNA 結(jié)合域,而p53 的DNA 結(jié)合域又是p53 形成四聚體活性結(jié)構(gòu)、調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄的重要區(qū)域.本文通過(guò)全原子分子動(dòng)力學(xué)模擬,研究了野生型p53 四聚體內(nèi)分子間的相互作用機(jī)制.結(jié)果表明,位于DNA 兩側(cè)的對(duì)稱(chēng)二聚體是一個(gè)穩(wěn)定的二聚體,在與DNA 結(jié)合前后都能維持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu).位于DNA 同側(cè)的兩個(gè)單體依靠?jī)蓚€(gè)接觸面提供的蛋白-蛋白相互作用和DNA 的骨架作用使四聚體活性結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定,這些相互作用為四聚體的形成機(jī)制提供了重要支撐.該工作厘清了p53 四聚體在動(dòng)力學(xué)過(guò)程中的內(nèi)部相互作用機(jī)制和關(guān)鍵殘基,揭示了四聚化過(guò)程中各個(gè)相互作用界面的關(guān)鍵位點(diǎn),對(duì)于理解p53 的抑癌機(jī)制、探索有效治癌策略、發(fā)展治癌藥物具有重要意義.

1 引言

p53 腫瘤抑制基因是最常見(jiàn)的癌變相關(guān)基因之一[1].在應(yīng)激環(huán)境下,p53 蛋白主要作為一種轉(zhuǎn)錄因子,促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[2],從而引起細(xì)胞周期停滯、損傷修復(fù)或細(xì)胞凋亡[3,4].在人類(lèi)癌癥中超過(guò)50%的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有p53 突變[5,6],其中錯(cuò)義突變廣泛發(fā)生在p53 的核心結(jié)合域,約占所有p53突變的95%[7].這種突變不但直接影響了p53 與DNA 的結(jié)合親和力,也會(huì)不同程度地影響其正確折疊[8],這對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞凋亡水平有很大的影響.因此,p53 是腫瘤治療中的關(guān)鍵靶點(diǎn).在針對(duì)p53 的靶向治療中,有兩種治療策略: 一種是針對(duì)野生型p53,利用化合物占據(jù)MDM2 蛋白的活性位點(diǎn),抑制MDM2 蛋白介導(dǎo)的p53 泛素化和核輸出[9–11];另一種是針對(duì)發(fā)生突變的p53,利用化合物結(jié)合,誘導(dǎo)突變型p53 的重新激活,恢復(fù)野生型功能[12].無(wú)論哪一種治療策略,都需要對(duì)p53 野生型結(jié)構(gòu)的分子特征有清晰的認(rèn)識(shí).

穩(wěn)定的p53-核心結(jié)構(gòu)域(p53 DNA binding domain,p53-DBD)在細(xì)胞核內(nèi)形成四聚體[13](見(jiàn)圖1),與特異性靶DNA 結(jié)合并調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)下游信號(hào)通路的改變.p53 核心結(jié)構(gòu)域的四聚化是p53 作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能核心.對(duì)于p53-DBD,各種結(jié)晶實(shí)驗(yàn)已經(jīng)得到了p53 識(shí)別DNA 的分子機(jī)制[14].p53-DBD 與DNA 的結(jié)合主要包括兩個(gè)結(jié)合槽,其中,環(huán)-片-螺旋基序(loopsheet-helix motif,LSH)與主槽對(duì)接,通過(guò)關(guān)鍵殘基K120,C277,R280,R285,A276,S241和R273 與DNA 形成氫鍵.來(lái)自環(huán)L3 的殘基R248 與小凹槽相互作用形成氫鍵.這些相互作用使得p53 可以與DNA 穩(wěn)定的結(jié)合.核心結(jié)構(gòu)域與DNA 的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)也解釋了各種突變體如何使其失活,并在結(jié)晶實(shí)驗(yàn)和分子動(dòng)力學(xué)模擬中得到了大量的證實(shí)[8,15,16].然而,游離的p53-DBD 主要以單體形式存在于溶液中[17],不易與DNA 的單一四分之一位點(diǎn)結(jié)合.顯然,它需要一種更穩(wěn)定的結(jié)合方式,才能夠使p53 發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活功能.

圖1 p53 核心結(jié)合域四聚體結(jié)構(gòu): A 鏈(藍(lán)色);B 鏈(紅色);C 鏈(綠色);D 鏈(橙色).藍(lán)線表示對(duì)稱(chēng)二聚體界面,紅線表示二聚體-二聚體界面Fig.1.The p53 core binding domain tetramer structure:Chain A (blue);Chain B (red);Chain C (green);Chain D(orange).Blue lines represent symmetric dimer interfaces,while red lines represent dimer-dimer interfaces.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,p53-DBD 主要以一種高度協(xié)同的方式結(jié)合DNA 一致序列[18].兩個(gè)p53-DBD相對(duì)于DNA 以對(duì)稱(chēng)的形式結(jié)合DNA 的半位點(diǎn)形成對(duì)稱(chēng)二聚體結(jié)構(gòu)(symmetrical dimer structure).Nicholls 等[19]在研究p53 的體外生物發(fā)生實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí),p53 二聚體是通過(guò)共翻譯形成的,這種二聚體是位于DNA 兩側(cè)的二聚體.實(shí)驗(yàn)上對(duì)對(duì)稱(chēng)二聚體的結(jié)構(gòu)已經(jīng)有了比較清楚的描述: 對(duì)稱(chēng)二聚體(圖1 中的A-B 和C-D)中的蛋白接觸界面,被稱(chēng)為對(duì)稱(chēng)界面.它由每個(gè)p53 分子的H1 螺旋殘基、Zn 配位體以及L2 和L3 環(huán)區(qū)域形成環(huán)-片-螺旋基序.疏水作用和由水介導(dǎo)的極性相互作用穩(wěn)定了對(duì)稱(chēng)二聚體[20].然而有實(shí)驗(yàn)表明,對(duì)稱(chēng)二聚體仍可能在一定時(shí)間后從DNA 上脫離[21,22].

為了保持p53-DBD 與DNA 的穩(wěn)定結(jié)合,兩個(gè)對(duì)稱(chēng)二聚體(A-B 和C-D)通過(guò)蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction)和堿基堆疊作用,在一個(gè)完整的DNA 響應(yīng)元件上構(gòu)成一個(gè)四聚體[13,20,23].隨著兩個(gè)對(duì)稱(chēng)二聚體之間接觸點(diǎn)的增加,四聚體與DNA 的配合物更加穩(wěn)定,半衰期與親和度有很大提高[24].Weinberg 等[22]進(jìn)行了野生型p53 四聚體和一個(gè)只能形成二聚體的L344A 突變體的對(duì)比實(shí)驗(yàn).結(jié)果表明,四聚體對(duì)DNA 的親和力是二聚體的6 倍.由此可見(jiàn),核心結(jié)合域與DNA的四聚體配合物是p53 行使功能的關(guān)鍵,而二聚體-二聚體相互作用則在二聚體組裝成四聚體的過(guò)程中起著十分重要的作用.

迄今為止,相繼出現(xiàn)了一系列關(guān)于p53-DBD四聚體結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[14,20,24–26],著重分析了四聚體分子中A-DNA,B-DNA 和A-B 之間的結(jié)構(gòu)和相互作用.對(duì)于DNA 同側(cè)A-D 和B-C 之間的蛋白-蛋白相互作用卻鮮有分析.目前,對(duì)這些蛋白-蛋白相互作用的細(xì)節(jié)和結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)還相當(dāng)匱乏.Cho 等[14]得到的不對(duì)稱(chēng)的p53-DBD 三體結(jié)構(gòu)中,由于處于DNA 同側(cè)的B,C 鏈結(jié)合的是非一致序列,導(dǎo)致B-C 之間的相互作用非常微弱.此外,在Kitayner 等[20]描述的p53 四聚體中,由于DNA不連續(xù)導(dǎo)致的錯(cuò)位,使得兩個(gè)對(duì)稱(chēng)二聚體之間幾乎沒(méi)有蛋白-蛋白相互作用.然而,如前所述,在四聚體的結(jié)構(gòu)中,二聚體-二聚體之間的相互作用是不可或缺的.

為了分析和研究p53 四聚體中位于DNA 同側(cè)和對(duì)側(cè)的兩種蛋白-蛋白相互作用,利用全原子分子動(dòng)力學(xué)模擬方法分別對(duì)這兩種相互作用進(jìn)行了系統(tǒng)分析.晶體結(jié)構(gòu)選擇Chen 等[23]提出的一種自組裝的p53 四聚體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 3KMD).這一結(jié)構(gòu)能夠保證p53 四聚體可以結(jié)合到一個(gè)連續(xù)的同源DNA 位點(diǎn),且DNA 不會(huì)彎曲.如圖1所示,結(jié)構(gòu)中每個(gè)p53-DBD 單體都與DNA 的一致序列結(jié)合.p53 四聚體內(nèi)包含以下3 類(lèi)接觸面:1) p53-DNA 接觸面;2) p53 對(duì)稱(chēng)二聚體接觸面(A-B,C-D,藍(lán)色線);3)二聚體-二聚體接觸面(AD,B-C,紅色線).由于DNA 兩側(cè)的p53 是對(duì)稱(chēng)分布,即A-B 和C-D 接觸面一致,A-D 和B-C 接觸面一致,所以本文將這個(gè)體系分為兩部分進(jìn)行模擬:1)由單體A,B 和DNA 組成的對(duì)稱(chēng)二聚體模型;2)由A,D 和DNA 組成的二聚體-二聚體界面模型.本文還分別計(jì)算了在沒(méi)有DNA 結(jié)合時(shí),兩種模型的二聚作用,分析兩種二聚模式是否都需要DNA才能穩(wěn)定,以及DNA 在兩種二聚體中的作用.

在本文模擬計(jì)算中,使用Amber14SB 和OL15力場(chǎng)分別模擬p53-DBD (殘基92-291)和DNA.Zn 離子與4 個(gè)殘基配位體(C176,C238,C242 和H179)結(jié)合.采用Lu 等[32]研究工作中的參數(shù),對(duì)Zn 離子的四配位體進(jìn)行描述.將整個(gè)結(jié)構(gòu)在TIP3P 水分子的立方盒子中溶劑化,采用所有原子與水盒邊緣之間最小距離為12 ? (1 ?=10–10m)的原則,防止周期性邊界條件造成不同盒子內(nèi)的分子有相互作用.通過(guò)添加0.15 mol/L 的Na+和Cl–來(lái)中和系統(tǒng).使用Gromacs2018[33]來(lái)執(zhí)行分子動(dòng)力學(xué)模擬.靜電相互作用使用離子網(wǎng)格Ewald(PME)方法來(lái)處理,實(shí)際空間截止距離為1.2 nm.范德瓦耳斯相互作用(van der Waals interaction)計(jì)算的截止距離為1.2 nm.使用 V-rescale 方法的外部溫度浴使溶質(zhì)和溶劑保持恒溫,壓力浴使用Parrinello-Rahman 方法維持恒壓,溫度和壓力保持在310 K 和1 Pa.使用Verlet 緩沖區(qū)每10 步更新一次,截止距離為1.2 nm.首先采用共軛梯度法最小化5000步,以消除空間沖突.并先后在NVT和NPT 條件下進(jìn)行0.1 ns 的模擬,以平衡系統(tǒng).文中所有結(jié)構(gòu)均采用VMD 軟件[34]進(jìn)行可視化處理.

本文首次揭示了四聚體中位于DNA 對(duì)側(cè)和同側(cè)的兩種二聚形式在“有”和“無(wú)” DNA 結(jié)合時(shí)的構(gòu)象差別和相互作用變化,得到各個(gè)p53 單體間協(xié)同結(jié)合的分子機(jī)制,并且證明這兩種二聚形式的模擬,可以復(fù)現(xiàn)p53-DBD 四聚體中的兩種蛋白-蛋白相互作用.系統(tǒng)地分析p53-DBD 四聚體的內(nèi)稟屬性,有助于開(kāi)發(fā)針對(duì)p53 的抗癌性藥物,例如恢復(fù)錯(cuò)誤折疊的突變型p53 的野生型功能,促進(jìn)其重新折疊成野生型p53 等.

2 對(duì)稱(chēng)二聚體內(nèi)的相互作用

p53-DBD 的四聚體結(jié)構(gòu)是通過(guò)兩個(gè)對(duì)稱(chēng)二聚體的蛋白-蛋白相互作用形成的.因此,首先分析對(duì)稱(chēng)二聚體中分子之間的作用機(jī)制,分別對(duì)p53 對(duì)稱(chēng)二聚體在“有”和“無(wú)”DNA 結(jié)合的體系進(jìn)行200 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬,以研究p53 對(duì)稱(chēng)二聚體在動(dòng)力學(xué)過(guò)程中的相互作用.如圖2 所示,選擇晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 3KMD)中的A,B 鏈和DNA 構(gòu)成的對(duì)稱(chēng)二聚體作為模擬的初始結(jié)構(gòu)(后文稱(chēng)為“有”DNA 結(jié)構(gòu)).為了分析DNA 的作用,在圖2 的結(jié)構(gòu)中剪去DNA 分子,構(gòu)成“無(wú)”DNA 對(duì)稱(chēng)二聚體的初始結(jié)構(gòu)(圖3).

圖2 p53 對(duì)稱(chēng)二聚體與DNA 復(fù)合物的初始結(jié)構(gòu)(a)由A,B 鏈和DNA 組成的p53 對(duì)稱(chēng)二聚體結(jié)構(gòu);(b) Zn 離子的配位結(jié)構(gòu);(c) DNA 軸垂直于圖平面的對(duì)稱(chēng)二聚體Fig.2.Initial structure of the p53 symmetric dimer-DNA complex: (a) The p53 symmetric dimer structure composed of chains A,B and DNA;(b) coordination structure of Zn ions;(c) symmetric dimer with the DNA axis perpendicular to the plane of the figure.

圖3 “無(wú)”DNA 的p53 對(duì)稱(chēng)二聚體初始結(jié)構(gòu)Fig.3.Initial structure of the p53 symmetric dimer without DNA.

2.1 對(duì)稱(chēng)二聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性

首先,計(jì)算了這兩組模擬中p53 對(duì)稱(chēng)二聚體的主鏈碳原子相對(duì)于其初始時(shí)刻的均方根偏差(root mean square deviation,RMSD),以檢驗(yàn)?zāi)M的收斂性以及DNA 的存在對(duì)二聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的影響.如圖4 所示,經(jīng)過(guò)20 ns 的模擬后,兩個(gè)p53 對(duì)稱(chēng)二聚體都達(dá)到穩(wěn)定.因此,選擇20—200 ns 的穩(wěn)定軌跡進(jìn)行分析.與有DNA 結(jié)合時(shí)的二聚體的RMSD (約(0.1791±0.0159) nm)相比,沒(méi)有結(jié)合DNA 時(shí)二聚體的RMSD 平均值和漲落(約為(0.2935±0.0576)nm)較大.所以,沒(méi)有DNA結(jié)合的情況下,p53 對(duì)稱(chēng)二聚體表現(xiàn)出更大的構(gòu)象變化和更低的穩(wěn)定性.這說(shuō)明,與DNA 的結(jié)合可以限制二聚體的構(gòu)象變化,增強(qiáng)二聚體穩(wěn)定性.另外還通過(guò)計(jì)算A,B 兩個(gè)蛋白的溶劑可及表面積,得到了A,B 兩個(gè)蛋白單體之間的埋沒(méi)表面積,即二聚體接觸面積.在有DNA 的對(duì)稱(chēng)二聚體中,接觸面積為425.76 ?2.在除去DNA 之后,接觸面積為416.38 ?2,說(shuō)明DNA 的結(jié)合不會(huì)對(duì)二聚接觸界面的大小有太大影響,即對(duì)稱(chēng)二聚界面是一個(gè)比較穩(wěn)定的界面.

圖4 對(duì)稱(chēng)二聚體在“有”和“無(wú)”DNA 結(jié)合時(shí)的RMSD 演化Fig.4.Evolution of RMSD for the symmetric dimer with and without DNA.

為了更深入地理解DNA 結(jié)合對(duì)對(duì)稱(chēng)二聚體內(nèi)相互作用的影響,對(duì)兩個(gè)p53 單體之間的相互作用進(jìn)行分析,如圖5 所示.以供體原子X(jué)與受體原子Y之間的距離小于3.5 ?,并且X-氫-Y三個(gè)原子形成的角度小于30°,作為判定原子X(jué)-Y形成氫鍵的標(biāo)準(zhǔn)[35].當(dāng)帶負(fù)電荷的天冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu)側(cè)鏈COO–[36]與帶正電荷的精氨酸(Arg)或賴(lài)氨酸(Lys)側(cè)鏈或原子之間的最小距離小于4 ?時(shí),判定兩殘基間形成鹽橋.本文的結(jié)論是持續(xù)度大于20%的氫鍵和鹽橋.A-B單體間的相互作用分析表明,兩單體之間沒(méi)有形成氫鍵,靜電相互作用是由E180 和R181 間的鹽橋構(gòu)成.與DNA 結(jié)合時(shí),來(lái)自E180(A)-R181(B)和R181(A)-E180(B)的兩個(gè)鹽橋,持續(xù)度分別為82.07%和50.53%.在除去DNA后,這兩個(gè)鹽橋的持續(xù)度有所變化,持續(xù)度分別為43.59%和70.51%.這些結(jié)果表明,在DNA 結(jié)合前后,位于A-B 單體H1 螺旋上的E180 和R181 間形成兩個(gè)鹽橋,一個(gè)穩(wěn)定性較強(qiáng),一個(gè)穩(wěn)定性較弱,兩個(gè)鹽橋的疊加對(duì)二聚體中的靜電相互作用有很大的貢獻(xiàn).

圖5 A-B 單體間的相互作用殘基(a) A-B 單體間形成鹽橋的殘基;(b) A-B 單體間參與范德瓦耳斯作用的殘基Fig.5.Residues involved in interactions between A and B monomers: (a) Residues forming salt bridges between A and B monomers;(b) residues involved in van der Waals interaction between A and B monomers.

為了分析與DNA 結(jié)合前后對(duì)稱(chēng)二聚體的親和力變化,采用分子力學(xué)/泊松-玻爾茲曼表面積(molecular mechanics/Poisson Boltzmann surface area,MM/PBSA)算法[37]計(jì)算對(duì)稱(chēng)二聚體的結(jié)合自由能.在無(wú)DNA 結(jié)合的情況下,二聚體的結(jié)合能為–23.84 kcal/mol.在與DNA 結(jié)合后,二聚體的結(jié)合能為–22.60 kcal/mol.表明在有無(wú)DNA 結(jié)合時(shí),對(duì)稱(chēng)二聚體的親和力是相似的,這與我們的靜電相互作用分析結(jié)果一致.2.2 節(jié)將說(shuō)明,這種結(jié)合能差異來(lái)源于DNA 分子的支撐作用.通過(guò)對(duì)A-B 間結(jié)合能的殘基分解,得到了二聚作用的殘基貢獻(xiàn)分布.圖6 列出了兩個(gè)體系中殘基貢獻(xiàn)絕對(duì)值大于1 kcal/mol 的殘基,一般認(rèn)為對(duì)復(fù)合物結(jié)合的能量貢獻(xiàn)大于1 kcal/mol 的殘基是關(guān)鍵殘基.由于A-B 單體在DNA 兩側(cè)對(duì)稱(chēng)分布,所以?xún)蓚€(gè)p53 單體的殘基貢獻(xiàn)差別很小.

圖6 與DNA 結(jié)合前(a)后(b)對(duì)稱(chēng)二聚體的殘基能量貢獻(xiàn)分布Fig.6.Residue energy contribution distribution of symmetric dimers with (a) and without (b) DNA.

由圖6 可以發(fā)現(xiàn),在與DNA 結(jié)合前后,對(duì)稱(chēng)二聚體結(jié)合的關(guān)鍵殘基完全一致,共有6 個(gè)關(guān)鍵殘基,分別為來(lái)自H1 短螺旋的P177,H178,H179,E180,R181 和來(lái)自L3 環(huán)的M243.E180 和R181 參與了靜電相互作用.P177,H178 和M243 雖未參與靜電相互作用,但P177(A)-P177(B),H178(A)-M243(B)和M243(B)-H178(A)之間緊密接觸,參與了范德瓦耳斯相互作用(VDW).兩個(gè)H179 殘基各自包含一個(gè)Zn 離子,提供了靜電相互作用.在這6 個(gè)殘基中,有4 個(gè)殘基在A-B 二聚體中的能量貢獻(xiàn)都很接近.但是,來(lái)自?xún)蓚€(gè)p53 單體中的E180 和R181 的貢獻(xiàn)有明顯的差別.這是由于DNA 的結(jié)合導(dǎo)致的構(gòu)象差別造成的.在DNA 結(jié)合時(shí),E180(A)-R181(B)鹽橋更穩(wěn)定.而除去DNA后,R181(A)-E180(B)鹽橋更穩(wěn)定.二聚作用的關(guān)鍵殘基中,有4 個(gè)殘基位于Zn 離子的配位體附近(P177,H178,H179 和M243),所以Zn 離子的穩(wěn)定將會(huì)影響二聚體的穩(wěn)定性.如果在Zn 離子周?chē)臍埢l(fā)生了突變[38],將會(huì)對(duì)二聚體的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響.

1.3.5 體表光學(xué)監(jiān)測(cè) 經(jīng)1.3.4行誤差校正后，啟動(dòng)OSMS軟件，再次掃描面部，靜態(tài)獲取新的體表參考影像Vision RT影像，在機(jī)架及影像臂不遮擋攝像頭條件下采集與參考影像比對(duì)后獲得的影像偏差值，3次采集監(jiān)測(cè)數(shù)值均值記錄為當(dāng)次影像偏差值。按照治療計(jì)劃參數(shù)進(jìn)行出束治療，同時(shí)啟動(dòng)OSMS軟件監(jiān)控面部位置變化，以Vision RT影像監(jiān)測(cè)當(dāng)次分次內(nèi)治療，位置變化超過(guò)誤差允許值2 mm，加速器出束治療被暫停，否則繼續(xù)出束治療，采集3次監(jiān)測(cè)數(shù)值均值記錄為當(dāng)次影像偏差值，治療結(jié)束再次重復(fù)CBCT位置驗(yàn)證，得到治療靶區(qū)位置誤差并記錄。

本文結(jié)果表明,除去DNA后,A-B 二聚體的結(jié)合狀態(tài)幾乎沒(méi)有發(fā)生改變,短時(shí)間內(nèi)不會(huì)由于DNA 的缺失而變構(gòu).前期的很多研究工作都表明,二聚體是通過(guò)疏水和極性相互作用來(lái)穩(wěn)定的[20].NMR 結(jié)果顯示H1 螺旋(P177-C182)在二聚過(guò)程中起到重要作用[39].通過(guò)X 射線晶體學(xué)確定的小鼠p53 二聚體結(jié)構(gòu)中[26],由R181 和E180 形成了兩對(duì)鹽橋,M243 與水介導(dǎo)形成氫鍵,R177 與H178廣泛參與了范德瓦耳斯接觸.這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與我們的模擬結(jié)果是一致的.然而,目前實(shí)驗(yàn)上尚沒(méi)有得到無(wú)DNA 結(jié)合情況下的對(duì)稱(chēng)二聚體結(jié)構(gòu)[18].

2.2 DNA 分子的作用

對(duì)p53-DNA 間的相互作用分析表明,A,B 單體與DNA 結(jié)合的關(guān)鍵殘基基本一致.如圖7 所示,來(lái)自環(huán)片-螺旋基序的殘基K120,R280,A276,R273 和S241 與主槽結(jié)合,環(huán)L3 上的R248 與次凹槽結(jié)合.唯一不同的殘基是S121,它在單體A 中與DNA 主鏈結(jié)合形成氫鍵,而在單體B 中沒(méi)有與DNA 形成氫鍵.

圖7 對(duì)稱(chēng)二聚體與DNA 結(jié)合的關(guān)鍵殘基.黃色殘基表示A,B 單體與DNA 結(jié)合的一致殘基,綠色表示與DNA結(jié)合不一致的殘基Fig.7.Key residues involved in the binding of the symmetric dimer to DNA.Yellow residues represent consistent residues between monomers A and B and DNA binding,while green residues represent inconsistent residues with DNA binding.

下面分別計(jì)算了p53 單體、對(duì)稱(chēng)二聚體與DNA的結(jié)合自由能.對(duì)稱(chēng)二聚體與DNA 的結(jié)合能(–147.64 kcal/mol)約為p53 單體與DNA 結(jié)合能(–70.47 kcal/mol)的兩倍,正是這種能量貢獻(xiàn),使得p53 不是以單體與DNA 結(jié)合的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活.同時(shí)還發(fā)現(xiàn),相比于蛋白-蛋白之間的結(jié)合,p53 蛋白與DNA 間的相互作用是更加牢固的.所以,DNA 是對(duì)稱(chēng)二聚體形成和穩(wěn)定的關(guān)鍵因素.如前所述,實(shí)驗(yàn)上尚未發(fā)現(xiàn)無(wú)DNA 結(jié)合下的對(duì)稱(chēng)二聚體的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[18],這里給出結(jié)合能的計(jì)算結(jié)果,提供了一種可能的解釋,我們推測(cè)對(duì)稱(chēng)二聚體的形成應(yīng)該是一種接受到轉(zhuǎn)錄信號(hào)后的協(xié)同作用.

通過(guò)能量分解,能量貢獻(xiàn)最大的3 個(gè)殘基是R273,R248,R280 (殘基結(jié)合貢獻(xiàn)大于 6 kcal/mol).而這3 個(gè)殘基正是p53 突變的熱點(diǎn)殘基(R248Q,R248W,R273H,R273C,R280K).這些突變型屬于接觸型突變,即這些殘基位于DNA 結(jié)合位點(diǎn)上,突變會(huì)導(dǎo)致p53-DBD 失去結(jié)合DNA 的能力、p53-DBD 不同程度的構(gòu)象變化以及DNA 結(jié)合表面的結(jié)構(gòu)重排[40,41].與此同時(shí),這些突變的p53 蛋白具有致癌潛力.它們可以以顯著負(fù)性的方式抑制任何剩余的野生型p53,也可以獲得促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥性的新功能[42].

3 二聚體-二聚體界面的相互作用

迄今為止,實(shí)驗(yàn)上得到的p53 核心結(jié)構(gòu)域包括野生型和突變型單體、二聚體,以及各種四聚物結(jié)構(gòu).然而,位于DNA 同側(cè)的二聚體結(jié)構(gòu)還沒(méi)有發(fā)現(xiàn).為了探究位于DNA 同側(cè)的二聚體在生理環(huán)境下的構(gòu)象特征,從p53 四聚體中提取出單體A,D 和DNA 的結(jié)構(gòu)(圖8)作為初始結(jié)構(gòu),對(duì)“有”和“無(wú)”DNA 結(jié)合的A-D 二聚體分別進(jìn)行200 ns 的分子動(dòng)力學(xué)模擬.由于在四聚體中DNA 兩側(cè)的p53 是對(duì)稱(chēng)的,兩個(gè)蛋白-蛋白相互作用界面也完全一致,所以選擇DNA 一側(cè)的A-D 二聚體就可以很好地描述二聚體-二聚體相互作用.

圖8 由 A,D 和DNA 組成的復(fù)合物初始結(jié)構(gòu)Fig.8.Initial structure of composite molecule including A,D and DNA.

3.1 無(wú)DNA 結(jié)合的A-D 二聚體不是一種合理的結(jié)構(gòu)

首先對(duì)有/無(wú)DNA 結(jié)合時(shí)A-D 二聚體的結(jié)構(gòu)構(gòu)象進(jìn)行對(duì)比.通過(guò)動(dòng)力學(xué)軌跡可以發(fā)現(xiàn),與DNA結(jié)合時(shí),A-D 二聚體接觸界面與晶體結(jié)構(gòu)相似,而無(wú)DNA 結(jié)合時(shí),A-D 接觸界面由原來(lái)的兩個(gè)接觸面變成一個(gè)接觸面,如圖9(c)和圖9(d)所示.通過(guò)計(jì)算A-D 兩單體質(zhì)心間距,發(fā)現(xiàn)當(dāng)沒(méi)有DNA結(jié)合時(shí),兩個(gè)單體質(zhì)心間距變小.在初始時(shí)刻,A-D單體的質(zhì)心間距為35.524 ?.通過(guò)計(jì)算兩個(gè)體系穩(wěn)定后A-D 的質(zhì)心間距的概率密度分布(圖9(a))可以看出,與初始時(shí)刻相比,無(wú)DNA 結(jié)合時(shí),AD 單體的質(zhì)心間距更小(最可幾值為33.925 ?).與DNA結(jié)合后,兩單體的質(zhì)心間距有微小的增大(最可幾值為36.623 ?).圖9(b)顯示了兩個(gè)體系穩(wěn)定后二聚界面接觸面積的概率密度分布.從圖9(c),(d)可以明顯看到,在與DNA 結(jié)合的A-D二聚體內(nèi),二聚體的接觸面積較小(380.2544 ?2),這是由于DNA 結(jié)合下的A-D 二聚體共形成兩個(gè)接觸面.而除去DNA后,單體由于相互作用逐漸靠近,兩個(gè)接觸面間的空腔逐漸消失變?yōu)橐粋€(gè)接觸面,接觸面積增加了2.1 倍(830.1783 ?2).這種構(gòu)象上的變化會(huì)使得相互作用區(qū)域發(fā)生改變,從而影響A-D 二聚體的構(gòu)象.

圖9 有/無(wú)DNA 結(jié)合時(shí),A-D 二聚體構(gòu)象上的差別(a) A,D 兩個(gè)單體質(zhì)心間距的概率密度分布;(b) A,D 分子間接觸面積的概率密度分布;(c)有DNA 的A,D 分子間二聚接觸面;(d)無(wú)DNA 的A,D 分子間二聚接觸面Fig.9.Differences in the A-D dimer conformation with/without DNA binding: (a) Probability density distribution of the distance between the centers of mass of A and D monomers;(b) probability density distribution of the interfacial contact area between A and D molecules;(c) dimeric contact area between A and D molecules in the presence of DNA;(d) dimeric contact area between A and D molecules in the absence of DNA.

如圖10(a)所示,從RMSD 的時(shí)間演化曲線可以看出,在沒(méi)有DNA 結(jié)合的A-D 二聚體中,兩單體在120 ns 后逐漸達(dá)到穩(wěn)定,RMSD 值在(0.5634±0.0391) nm 處穩(wěn)定.單體A,D 的RMSD 分別穩(wěn)定于(0.2983±0.0177) nm 和(0.2177±0.0143) nm附近.與對(duì)稱(chēng)二聚體的結(jié)果(圖4)相比,無(wú)DNA結(jié)合的A-D 二聚體的穩(wěn)定需要更長(zhǎng)的時(shí)間,且AD 二聚體的構(gòu)象變化更大.在120 ns 附近A-D 二聚體的RMSD 有明顯的升高.分別計(jì)算了105—120 ns 和120—135 ns 軌跡的平均結(jié)構(gòu)并進(jìn)行重疊,結(jié)果如圖10(b)所示,可以看出,120 ns 后單體A 整體向左上方移動(dòng),單體D 向右后方移動(dòng),這會(huì)導(dǎo)致分子間接觸面相互作用發(fā)生改變.單體間的移動(dòng)使得單體D 的L6 區(qū)域和單體A 的L7,L5'區(qū)域更加靠近,從而形成了更多的相互作用.例如,在120 ns后,位于L6 的G224,S227分別與L5'上的N210 形成新的氫鍵,位于L6 的V225 分別與位于L7 上的N263 和L264 形成新的氫鍵.

圖10 (a)無(wú)DNA 結(jié)合時(shí)A-D 二聚體 的RMSD演化;(b) 120 ns 前后A-D 二聚體的構(gòu)象重疊,兩單體的構(gòu)象發(fā)生了明顯的偏移,使得A-D 之間的相互作用增加.120 ns前后的構(gòu)象分別用銀色和橙色表示Fig.10.(a) RMSD evolution of the A-D dimer in the absence of DNA binding;(b) at around 120 ns,there is an overlap in the conformation of the A-D dimer,with noticeable deviations in the conformations of the two monomers,leading to an increased interaction between A and D.Conformations before and after 120 ns are represented in silver and orange,respectively.

對(duì)接觸界面的相互作用分析表明,穩(wěn)定后的A-D 二聚界面大約有8 個(gè)氫鍵和2 個(gè)鹽橋,穩(wěn)定性分析見(jiàn)表1.這些氫鍵和鹽橋分別來(lái)自R267-D228(鹽橋),R209-E224 (鹽橋),S94-L201,N210-D228,S94-G199,L264-V225,S99-D228,S96-T231,N263-V225 和N210-S227 (左側(cè)為單體A 的殘基號(hào),右側(cè)為單體D 的殘基號(hào)).這與晶體結(jié)構(gòu)中A-D 單體間的相互作用完全不同.從結(jié)構(gòu)和相互作用分析上來(lái)看,無(wú)DNA 結(jié)合的A-D 二聚體變?yōu)橐环N結(jié)合更為緊密的二聚形式.然而,這種結(jié)合更緊密的A-D二聚體卻不是一種合理的結(jié)構(gòu).將無(wú)DNA 結(jié)合時(shí)的模擬結(jié)果與有DNA 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行重疊,如圖11所示,除了A-D 接觸界面的變化外,上述形成的無(wú)DNA 結(jié)合的穩(wěn)定的A-D 二聚復(fù)合物(圖9(d))已經(jīng)不能與連續(xù)的同源DNA 序列結(jié)合.因此,在生理環(huán)境下,沒(méi)有DNA 結(jié)合時(shí),位于DNA 同側(cè)的二聚體不能保持合理的構(gòu)象,這不利于p53-DBD 四聚體的形成.這也解釋了為什么在四聚體的形成過(guò)程中,優(yōu)先形成對(duì)稱(chēng)二聚體.

表1 氫鍵、鹽橋穩(wěn)定性Table 1.Hydrogen bond and salt bridge stability.

圖11 無(wú)DNA 時(shí)的A-D 二聚體不能與DNA 結(jié)合Fig.11.A-D dimer can’t bind to DNA in the absence of DNA.

那么,這是否說(shuō)明游離的p53-DBD 會(huì)產(chǎn)生很多不合理的寡聚呢？答案是否定的.因?yàn)樵隗w內(nèi),p53-DBD 除了與DNA 形成四聚體的有效功能外,還會(huì)和其他蛋白之間存在蛋白-蛋白相互作用[43–45],這些相互作用使得p53 能夠通過(guò)多種途徑調(diào)控腫瘤發(fā)展.與此同時(shí),A-D 二聚體與DNA 的復(fù)合物能夠保持與晶體結(jié)構(gòu)相似的構(gòu)象狀態(tài),說(shuō)明DNA在其中起到了重要作用,下面將詳細(xì)分析DNA 在A-D 二聚體中的作用.

3.2 DNA在A-D 二聚體中的骨架作用

3.1 節(jié)計(jì)算了有/無(wú)DNA 結(jié)合時(shí)A-D 單體間的質(zhì)心距離,發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有DNA 結(jié)合時(shí),A-D 單體質(zhì)心間距相對(duì)較小;而有DNA 結(jié)合時(shí)A-D 單體間質(zhì)心距離相對(duì)較大.為了分析產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因,在有DNA 結(jié)合時(shí)的A-D 二聚體 200 ns 得到的分子結(jié)構(gòu)中剪去DNA 分子,采用傘形取樣方法[46],得到應(yīng)用在A-D 分子上的彈性應(yīng)力,此力原則上與DNA 分子的作用相同,抵消了A-D 分子間的靜電力和范德瓦耳斯力,從而保持A-D 分子間一定的空間距離不變.具體來(lái)說(shuō),在與DNA 結(jié)合的A-D 二聚體中,平衡后兩單體的平均質(zhì)心間距為3.6109 nm,以此平衡結(jié)構(gòu)作為初始結(jié)構(gòu),剪去DNA分子,對(duì)A-D 二聚體采用傘形取樣的方法,設(shè)置A-D 質(zhì)心的參考距離為 3.6109 nm,進(jìn)行 10 ns 的模擬,得到相應(yīng)的彈性應(yīng)力,如圖12(a)所示.在模擬初期,由于兩單體質(zhì)心間距大于參考距離,所以?xún)蓡误w之間的彈性應(yīng)力的方向沿著質(zhì)心軸向內(nèi),而在 4.5 ns后,質(zhì)心距離小于參考距離,所以彈性應(yīng)力的方向沿著質(zhì)心軸向外,最終彈性應(yīng)力穩(wěn)定在一個(gè)確定的大小.

圖12 (a)二聚體上的彈性應(yīng)力;(b)穩(wěn)定后,彈性應(yīng)力作用下A-D 二聚體的結(jié)構(gòu)Fig.12.(a) Elastic stress on the dimer;(b) structure of the A-D dimer under the action of elastic stress after stabilization.

如圖12(b)所示,在此情況下,A-D 單體間形成兩個(gè)清晰的接觸面.接觸面1 上有兩條穩(wěn)定氫鍵,分別為T(mén)170(A)-G199(D)和S166(A)-H233(D).接觸面2上,S99(A),R267(A)與V225(D)之間形成穩(wěn)定性較弱的氫鍵.與實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)晶結(jié)構(gòu)相比,雖然相互作用殘基有所差別,但是相互作用區(qū)域是一致的.本文的結(jié)果表明,與DNA 結(jié)合時(shí),A-D單體各自與DNA 的一致序列結(jié)合,DNA 分子提供骨架的支撐作用,使A,D 單體保持一定的空間距離.DNA 分子的支撐作用是DNA 同側(cè)二聚體穩(wěn)定的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制.

3.3 與DNA 結(jié)合的A-D 二聚體

A-D 二聚體可以在與DNA 結(jié)合時(shí),保持合理的構(gòu)象狀態(tài),對(duì)這個(gè)體系的穩(wěn)定性和相互作用進(jìn)行細(xì)致分析,探究在DNA 同側(cè)的單體在動(dòng)力學(xué)過(guò)程中的相互作用特點(diǎn).首先,對(duì)與DNA 結(jié)合的A-D 二聚體的穩(wěn)定性分析表明,p53 A-D 二聚體的RMSD在 120 ns 后達(dá)到穩(wěn)定(約(0.3231±0.0194)nm),如圖13(a)所示.此外,單體D在150 ns 后才達(dá)到穩(wěn)定,單體D 的RMSD 穩(wěn)定在(0.3505±0.011) nm,且在90—150 ns 期間有明顯上升,如3.1 節(jié)中的分析,說(shuō)明在這個(gè)時(shí)間前后單體D 存在構(gòu)象變化.

圖13 有DNA時(shí),A-D 二聚體 的穩(wěn)定 性(a) RMSD;(b) RMSFFig.13.Stability of A-D dimer in the presence of DNA:(a) RMSD;(b) RMSF.

通過(guò)計(jì)算殘基的均方根波動(dòng)(root mean square fluctuation,RMSF),可以得到各個(gè)殘基的靈活性情況.如圖13(b)所示.A,D 兩單體的RMSF 趨勢(shì)總體上是一致的,但單體D 的RMSF 在殘基92—94 處明顯增大.這是由于此區(qū)域正處于p53-DBD區(qū)域的結(jié)構(gòu)邊緣,此模型忽略了p53 的1—91 號(hào)殘基(N 端)和292-393 (C 端)殘基的影響.在除去92—94 這3 個(gè)殘基的影響后,單體D 也在 20 ns后一直保持穩(wěn)定(圖13(a)紫色線).這表明92—94段殘基的靈活性增強(qiáng)并不會(huì)影響單體D 其他區(qū)域的穩(wěn)定.而在單體A中,92—94 殘基區(qū)域正處于p53 A-D 二聚界面上,參與了蛋白-蛋白相互作用,所以,單體A 的N 端區(qū)域沒(méi)有靈活性增強(qiáng)的情況.此外,在186—225 殘基區(qū)間,發(fā)現(xiàn)A,D 單體的個(gè)別殘基(186,187,198 和225 等)靈活性有差別,這是由于這些殘基位于p53 A-D 二聚接觸界面的環(huán)路上,由于兩個(gè)單體是平行分布的,所以位于邊緣的環(huán)路受到的約束更少,導(dǎo)致殘基的靈活性更大.

對(duì)p53 A-D 二聚體界面的相互作用分析表明,A-D 單體之間存在兩個(gè)接觸面.在兩個(gè)接觸面上存在鹽橋和豐富的氫鍵網(wǎng)絡(luò),所有氫鍵和鹽橋的穩(wěn)定性分析見(jiàn)表2.如圖14 所示,位于接觸面1 上的T170(A)-G199(D)形成一條穩(wěn)定氫鍵,P92(A)-D186(D)之間形成兩條穩(wěn)定性很弱的氫鍵.位于接觸面2 上的K101(A),分別與D 鏈的E224 形成穩(wěn)定鹽橋,與P222,P223 形成不穩(wěn)定的氫鍵.接觸面2 上還有一條不穩(wěn)定氫鍵,來(lái)自Q100(A)-P223(D).結(jié)果表明,與接觸面2 上的復(fù)雜相互作用相比,接觸面1 上的氫鍵更穩(wěn)定,更簡(jiǎn)單.而接觸面2 上的殘基參與的相互作用更復(fù)雜.P222,P223 和E224位于L6環(huán),P92,K101 位于N 端無(wú)序區(qū)域,這些區(qū)域的靈活性較強(qiáng),導(dǎo)致接觸面2 的相互作用穩(wěn)定性也較差,這也促使某些殘基參與了更多的相互作用(如K101).此外,T170 和D186 位于L2 環(huán)上,G199 位于L5 環(huán)上,表明L2,L5,L6 以及N 端無(wú)序區(qū)域是A-D 二聚體內(nèi)靜電相互作用的關(guān)鍵區(qū)域.

表2 與DNA 結(jié)合時(shí)A-D 二聚體間的氫鍵、鹽橋穩(wěn)定性Table 2.Stability of hydrogen bonds and salt bridges between A-D dimers when binding to DNA.

圖14 與DNA 結(jié)合的A-D 二聚體間的(a)接觸面和(b)相互作用殘基Fig.14.Contact surface (a) and residues involved in the interaction (b) between the A-D dimer bound to DNA.

p53 的每個(gè)單體都與DNA 間形成廣泛的氫鍵網(wǎng)絡(luò).單體A 和單體D 與DNA 間平均有12 和11條氫鍵.如圖15 所示,對(duì)于單體A,K120,A276,R283,R280,R273,N239,N288 和S241 與主凹槽相互作用,其中R280 深深地插入主凹槽,形成2 條穩(wěn)定的氫鍵.R283,S241 和K291 只在單體A 中與DNA 形成氫鍵,而在單體D 中沒(méi)有.R248 和K291與次凹槽形成穩(wěn)定的氫鍵,但R248 并未插入到凹槽內(nèi)部,而是與DNA 主干形成3 條氫鍵.對(duì)于單體D,K120,A276,N239,R280,R273,N288 和S121與主凹槽相互作用.與單體A 不同的是與主凹槽相互作用的殘基增加了S121,與主凹槽形成兩條氫鍵.R248 與次凹槽形成穩(wěn)定的氫鍵.結(jié)果表明,A-D 兩單體與DNA 形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)和各氫鍵的穩(wěn)定性是有差別的,單體A 中S241 貢獻(xiàn)了一條穩(wěn)定性最強(qiáng)的氫鍵,在單體D 中沒(méi)有出現(xiàn).相反,單體D 中由S121 貢獻(xiàn)了兩條穩(wěn)定的氫鍵,在單體A中則沒(méi)有.這些相互作用確保了A,D 單體與DNA的穩(wěn)定結(jié)合,表明A-D-DNA 的復(fù)合物分子也是一個(gè)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),可以正確描述四聚體中的結(jié)構(gòu)特點(diǎn).

圖15 單 體A,D 與DNA 間相互作用的 關(guān)鍵殘基.黃色殘基表示A,D 單體與DNA 結(jié)合的一致殘基,綠色表示與DNA 結(jié)合不一致的殘基Fig.15.Key residues involved in the interaction between monomers A and D with DNA.Yellow residues represent consistent residues between monomers A and D and DNA binding,while green residues represent inconsistent residues with DNA binding.

通過(guò)結(jié)合自由能計(jì)算,在DNA 結(jié)合狀態(tài)下,A-D單體間的結(jié)合能為–17.17 kcal/mol,與2.2 節(jié)給出的對(duì)稱(chēng)二聚體的結(jié)合能(–22.60 kcal/mol)相比較小.因此,相對(duì)于對(duì)稱(chēng)二聚體,A 與D 單體之間相對(duì)結(jié)合較弱,這一結(jié)果與實(shí)驗(yàn)給出的結(jié)論是一致的.結(jié)合能的殘基分解如圖16 所示,A-D 二聚體的關(guān)鍵殘基包括來(lái)自單體A 的L93,K101,Q167和來(lái)自單體D 的D186,L201.如前所述,K101(A)和D186(D)分別參與了靜電相互作用.L93(A)-G199(D),L93(A)-E171(A),Q167(A)-H233(D),S94(A)-L201(D)和S95(A)-L201(D)之間形成范德瓦耳斯相互作用.

圖16 與DNA 結(jié)合的A-D 二聚體的能量分解Fig.16.Energy decomposition of the A-D dimer binding to DNA.

在結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中得到的p53-DBD 四聚體結(jié)構(gòu)[23],DNA 同側(cè)的兩單體間有大量的范德瓦耳斯接觸和氫鍵網(wǎng)絡(luò).二聚體-二聚體界面的氫鍵網(wǎng)絡(luò)組成主要包括: 接觸面1 由T170(A)-G199(D)形成氫鍵;接觸面2 的氫鍵網(wǎng)絡(luò)由K101,Q100-E224,以及K101-V225 組成.文中與結(jié)晶實(shí)驗(yàn)有差別的氫鍵位于接觸面2.如圖13(a)所示,通過(guò)觀察動(dòng)力學(xué)軌跡發(fā)現(xiàn),接觸面2 兩側(cè)殘基間距略有增加,且K101 殘基的靈活性較大,會(huì)利用其靈活性大的特性與E224 形成鹽橋.于此同時(shí),還與距離較近的P222 和P223 形成較弱的氫鍵.本文的結(jié)果表明,位于DNA 同側(cè)的A-D 二聚體可以形成穩(wěn)定的結(jié)合界面,雖然A-D 二聚體的親和力弱于對(duì)稱(chēng)二聚體,但是它介導(dǎo)的蛋白-蛋白相互作用是四聚體形成過(guò)程中的必要條件,它能夠促進(jìn)兩個(gè)對(duì)稱(chēng)二聚體的協(xié)同結(jié)合,進(jìn)而形成穩(wěn)定的p53 四聚體.

4 結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同作用

早期對(duì)DNA 與p53 蛋白家族(包括p53,p63和p73)結(jié)合的比較研究表明,p53 的H1 螺旋界面二聚化對(duì)協(xié)同結(jié)合至關(guān)重要[47].為了得到二聚體中兩個(gè)單體之間的關(guān)聯(lián)作用,計(jì)算了體系中所有主鏈碳原子(共400 個(gè))的動(dòng)態(tài)互相關(guān)圖(dynamics cross correlation map,DCCM)[48].圖17 提供了在模擬過(guò)程中蛋白質(zhì)殘基之間的相關(guān)運(yùn)動(dòng)的總體圖像,圖中的正高峰(深紅色)代表對(duì)應(yīng)的兩個(gè)殘基的運(yùn)動(dòng)有很強(qiáng)的相關(guān)性,而負(fù)值(藍(lán)色)區(qū)域則代表兩個(gè)殘基向相反的方向運(yùn)動(dòng)(anticorrelated motion).這兩種不同的相關(guān)性,特別是結(jié)構(gòu)中相距較遠(yuǎn)的蛋白質(zhì)之間的長(zhǎng)程關(guān)聯(lián),都與蛋白質(zhì)的生物功能密切相關(guān)[49].圖中左上角和右下角的信息是完全對(duì)稱(chēng)的,對(duì)角線上的兩個(gè)正方形中的信息代表單體內(nèi)部的殘基間的關(guān)聯(lián)作用.而我們重點(diǎn)關(guān)注的是結(jié)構(gòu)域之間的殘基相關(guān)性.

在不含DNA 的體系中,可以觀察到對(duì)稱(chēng)二聚體的A-B 單體之間有很強(qiáng)的正相關(guān)性.單體A 的176—181 區(qū)域分別與單體B 的123—125,137—139,176—181,237—245 以及276—277 區(qū)域的殘基有較強(qiáng)的正相關(guān)性,單體A 的242—243 區(qū)域與單體B 的178—179 區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)相關(guān)性.其中A (176—181)與B (176—181)的強(qiáng)相關(guān)區(qū)域最大,并且與A (242—243)-B (178—179)都是參與蛋白-蛋白相互作用的區(qū)域,這與第2 節(jié)所述不含DNA 對(duì)稱(chēng)二聚體系的結(jié)論一致.在與DNA 結(jié)合的對(duì)稱(chēng)二聚體中,只在A (176—181)-B (176—181)和A (242—243)-B (178—179)區(qū)域有較強(qiáng)的正相關(guān)性.這是由于DNA 分子的支撐作用,使得A-B分子之間的相關(guān)性降低,而且,通過(guò)DNA 分子的支撐,A-B-DNA 復(fù)合分子更加穩(wěn)定.這一點(diǎn)與RMSD 結(jié)果一致,在圖4中,A-B結(jié)合DNA后,系統(tǒng)表現(xiàn)出很強(qiáng)的穩(wěn)定性.綜上所述,通過(guò)動(dòng)態(tài)互相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖得到了對(duì)稱(chēng)二聚體協(xié)同結(jié)合DNA 的直接證據(jù),各分子單體之間有明顯的協(xié)同效應(yīng).除了參與蛋白-蛋白相互作用的區(qū)域之外,還發(fā)現(xiàn)了其他殘基的長(zhǎng)程正相關(guān)性.

四聚體結(jié)構(gòu)研究表明[24,50],對(duì)稱(chēng)二聚體中兩個(gè)p53 單體之間的作用在很大程度上強(qiáng)于A-D 二聚體中兩個(gè)p53 單體之間的作用.在無(wú)DNA 結(jié)合時(shí),A-D 二聚體由于沒(méi)有DNA 的支撐,兩單體的質(zhì)心逐漸減小,變?yōu)橐环N生物學(xué)上不合理的結(jié)構(gòu).從動(dòng)態(tài)相關(guān)圖上可以看出,即使在這種情況下,兩個(gè)p53 單體的動(dòng)態(tài)相關(guān)性仍然相對(duì)很弱.結(jié)合了DNA 后的A-D 二聚體,相比對(duì)稱(chēng)二聚體,A-D 二聚體中p53 單體間殘基的相關(guān)性較弱,在A (105—108,148)和D (180—184)的區(qū)間發(fā)現(xiàn)了較弱的正相關(guān)性.這一結(jié)論與A-D 二聚體中兩個(gè)p53 單體之間的相互作用較弱有關(guān).

5 總結(jié)

了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和內(nèi)部相互作用有多種途徑.通過(guò)X 射線單晶衍射、核磁共振、電子衍射等實(shí)驗(yàn)手段可以確定蛋白質(zhì)、多糖、核酸、病毒等生物大分子的晶體結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)通常是靜態(tài)的.在體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中觀察蛋白相互作用,常常受到體外環(huán)境以及溫度的限制,而且缺乏對(duì)結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)的描述和理解.分子動(dòng)力學(xué)模擬可以在合適的力場(chǎng)和參數(shù)設(shè)定下計(jì)算動(dòng)力學(xué)過(guò)程中晶體結(jié)構(gòu)的演化,同時(shí)可以設(shè)定分子處于目標(biāo)環(huán)境(如生理環(huán)境)下.因此,分子動(dòng)力學(xué)模擬能夠從原子層次上提供生物大分子結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的充足信息.為了理解p53-DBD四聚體中的兩種蛋白-蛋白相互作用在四聚體形成過(guò)程中的作用,本文分別對(duì)位于DNA 對(duì)側(cè)和同側(cè)的p53 蛋白進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬,觀察在動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定后蛋白-蛋白相互作用的演化,并分析DNA 在兩個(gè)模型中的重要性.應(yīng)該指出,采用全原子分子動(dòng)力學(xué)方法,對(duì)p53 活性四聚結(jié)構(gòu)中分子間相互作用的動(dòng)力學(xué)行為和穩(wěn)定性進(jìn)行系統(tǒng)的分析和討論,迄今為止未見(jiàn)報(bào)道.

本文的研究表明,在活性p53-DBD 四聚體中,對(duì)稱(chēng)二聚體是一種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu).在與DNA 結(jié)合中,對(duì)稱(chēng)二聚體主要依靠H1 短螺旋和L3 環(huán)上的殘基貢獻(xiàn)的非鍵相互作用,使對(duì)稱(chēng)二聚體保持穩(wěn)定的構(gòu)象和很強(qiáng)的二聚親和力.此外,對(duì)稱(chēng)二聚體還表現(xiàn)出很強(qiáng)的協(xié)同作用,這與對(duì)稱(chēng)二聚體協(xié)同結(jié)合DNA 的實(shí)驗(yàn)事實(shí)一致.位于DNA 同側(cè)的A-D 二聚體與DNA 結(jié)合時(shí),通過(guò)L2,L5,L6 環(huán)路以及N端無(wú)序區(qū)域組成的兩個(gè)接觸面形成相互作用,并維持穩(wěn)定的結(jié)合狀態(tài).但除去DNA后,A-D 二聚體會(huì)演化成一種不合理的結(jié)構(gòu),此結(jié)構(gòu)不利于p53-DBD 四聚體的形成.對(duì)DNA 的作用分析表明,DNA 在A-D 二聚體中起到了重要的骨架支撐作用.以上結(jié)果中各個(gè)p53 單體與DNA 的相互作用與實(shí)驗(yàn)上的結(jié)果一致,且蛋白-DNA 間的相互作用遠(yuǎn)強(qiáng)于兩種蛋白-蛋白相互作用,即與DNA 結(jié)合的二聚體受益于DNA 和二聚體的穩(wěn)定接觸.本工作對(duì)p53 核心結(jié)構(gòu)域的四聚體形成機(jī)制提供了見(jiàn)解,也表明了A-D 二聚體與DNA 的復(fù)合物是一個(gè)穩(wěn)定的系統(tǒng),能夠正確地反映四聚體內(nèi)的相互作用.

值得指出,p53-DNA 四聚體的結(jié)構(gòu)取決于它所結(jié)合的DNA 序列,p53-DBD 四聚體在DNA 上的二聚體-二聚體接觸在體內(nèi)未必是固定的[24],而可能是根據(jù)不同的細(xì)胞條件適應(yīng)不同的接觸.本文所研究的結(jié)構(gòu)是4 個(gè)p53 亞基與DNA 一致序列結(jié)合的結(jié)構(gòu),而在一些實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)了DNA 彎曲的四聚體[25].而且,由于計(jì)算資源所限,本文僅對(duì)對(duì)稱(chēng)和同側(cè)兩個(gè)二聚結(jié)構(gòu)做出了分析.今后,我們還將探索不同的四聚體中蛋白-蛋白相互作用,對(duì)p53 核心四聚體全原子結(jié)構(gòu)內(nèi)的相互作用做出更系統(tǒng)的分析和討論.