楊杰源，朱易春，賴雅芬，張超，田帥，謝穎

（1 江西理工大學(xué)贛州市流域污染模擬與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 贛州 341000；2 江西理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，江西 贛州 341000）

厭氧氨氧化（Anammox）是指厭氧條件下厭氧氨氧化菌（anaerobic ammonium oxidation bacteria，AnAOB）以亞硝酸鹽（NO2-）作為電子受體將氨氮（NH4+）轉(zhuǎn)化為氮?dú)猓∟2）的生物脫氮過程[1]。與傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)相比，厭氧氨氧化過程不需要氧氣參與、無需有機(jī)碳源和酸堿中和劑，同時還具備了污泥產(chǎn)量低、脫氮效率高和占地面積小等特點(diǎn)。因此，世界各地已經(jīng)建設(shè)了超過110個厭氧氨氧化工藝的污水處理廠用于處理各種廢水[2]。

厭氧氨氧化工藝的廣泛應(yīng)用仍面臨著一些阻礙：①生物反應(yīng)器中AnAOB 繁殖速度緩慢，導(dǎo)致工藝啟動時間較長[3]；②由于厭氧氨氧化細(xì)菌傾向于聚集生長[4]，污泥顆?；窃黾游⑸镓S度、截留生物量和縮短厭氧氨氧化工藝啟動時間的有效方法[5]。但當(dāng)顆粒尺寸過大時，底物向顆粒內(nèi)部的傳質(zhì)阻力大大增加，抑制了內(nèi)部微生物的代謝過程[6]，從而影響了厭氧氨氧化顆粒污泥的活性；③在高氮負(fù)荷運(yùn)行條件下，厭氧氨氧化顆粒污泥會分泌過多胞外聚合物（EPS），過度分泌EPS 致使產(chǎn)生的氣體封堵在顆粒污泥內(nèi)部，導(dǎo)致污泥漂浮和生物質(zhì)流失，進(jìn)而造成反應(yīng)器崩潰[7]。為此，如何有效提高系統(tǒng)穩(wěn)定性和增強(qiáng)厭氧氨氧化菌的生長代謝是實(shí)現(xiàn)厭氧氨氧化工藝廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。

低強(qiáng)度超聲波應(yīng)用于厭氧氨氧化工藝可有效提高脫氮效能[8-10]。低強(qiáng)度超聲波作用于微生物主要表現(xiàn)在促進(jìn)傳質(zhì)、增加酶活性、加速細(xì)胞代謝三個方面[11-13]，能有效增強(qiáng)污泥微生物活性，提升污水生物處理效能。因此，低強(qiáng)度超聲波技術(shù)是改善顆粒污泥的傳質(zhì)效能和增強(qiáng)厭氧氨氧化細(xì)菌活性的潛在策略。

本文研究了低強(qiáng)度超聲波周期性輻照對Anammox-膨脹顆粒污泥床反應(yīng)器（EGSB）性能的影響，考察了反應(yīng)器脫氮性能、污泥量、顆粒粒徑分布、EPS、污泥zeta 電位和接觸角以及微生物群落的變化情況，以揭示低強(qiáng)度超聲波增強(qiáng)Anammox-EGSB 工藝處理高氨氮無機(jī)廢水效果的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 接種污泥及模擬廢水

所使用的成熟厭氧氨氧化顆粒污泥取自實(shí)驗(yàn)室中膨脹顆粒污泥床反應(yīng)器（EGSB），該反應(yīng)器已穩(wěn)定運(yùn)行半年以上，水力停留時間恒定為8h，氮容積氮去除率（NRR）為1.1kg N/(m3·d)。接種后實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器的污泥特征如下：呈紅色顆粒狀，初始平均混合液懸浮物（MLSS）和混合液揮發(fā)性懸浮物（MLVSS）分別為13.50g/L和7.21g/L，MLVSS/MLSS為0.53。

實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器進(jìn)水為人工合成的模擬廢水，其中NH?+-N 為200～400mg/L、NO?--N 為220～480mg/L，控制進(jìn)水亞硝態(tài)氮與氨氮比例在1.2∶1左右。模擬廢水組成如下所示：NH4Cl 0.76～1.83g/L，NaNO21.08～2.37g/L，KH2PO40.025g/L，CaCl2·2H2O 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.20g/L，NaHCO32.13g/L，并適量投加微生物生長所需的微量元素[14]。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置及運(yùn)行參數(shù)

實(shí)驗(yàn)運(yùn)行使用的EGSB反應(yīng)器結(jié)構(gòu)如圖1所示，該反應(yīng)器內(nèi)徑為5.5cm，有效容積為2.2L，反應(yīng)器使用不透光電加熱膜覆蓋并控制溫度在34℃±1℃?；亓鞅脤⒎磻?yīng)器的部分流出物再循環(huán)到進(jìn)水口，回流比設(shè)置為500%。使用蠕動泵（BT100-2J，Longer，UK）將廢水送入反應(yīng)器。設(shè)置兩個并聯(lián)的反應(yīng)器用于無機(jī)高氨氮廢水處理，而兩個反應(yīng)器（RC、RU）對厭氧氨氧化污泥采用不同的處理方法。RU進(jìn)行周期性（4d）[15]的低強(qiáng)度超聲波（聲能密度為0.2W/mL，超聲有效工作時間為2min）輻照，而RC作為對照反應(yīng)器，不經(jīng)超聲處理。

圖1 實(shí)驗(yàn)所使用的Anammox-EGSB反應(yīng)器

使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（JY88-IIN，中國）對厭氧氨氧化顆粒污泥進(jìn)行低強(qiáng)度超聲波處理。超聲波粉碎機(jī)的固定頻率為20kHz，功能范圍在0～250W。超聲探頭的直徑為6mm。在超聲波處理時，污泥被放置于用保鮮膜密封的燒杯中，保持厭氧環(huán)境。隨后將超聲探頭浸入污泥表面下1～2cm進(jìn)行間歇性超聲輻照（超聲1s，停止1s）。

實(shí)驗(yàn)過程中，通過控制進(jìn)水濃度變化改變反應(yīng)器的氮容積負(fù)荷（NLR）。以反應(yīng)器的總氮（TN）去除率到達(dá)85%作為反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行的評價標(biāo)準(zhǔn)，在反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行后提高氮負(fù)荷，具體參數(shù)調(diào)整見表1。

表1 反應(yīng)器運(yùn)行工況

1.3 常規(guī)分析

每隔一天采集水樣進(jìn)行檢測，NH?+-N 采用納氏試劑分光光度法，NO?--N 使用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法，NO3--N 使用紫外分光光度法測定。通過重量法測定生物質(zhì)的MLSS和MLVSS。污泥粒徑分布采用圖像分析法。使用超聲波-熱提取法從污泥中提取EPS，提取的樣品采用苯酚-硫酸法和改良Lowry 法測定EPS 中多糖（PS）和蛋白質(zhì)（PN）含量，EPS 成分采用三維熒光光譜儀（RF-6000，日本島津）：激發(fā)波長和發(fā)射波長分別在200～400nm和220～500nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，步長為5nm，掃描速度為3000nm/min。zeta 電位和接觸角分別采用zeta 電位分析儀（Malvern Zetasizer Nano ZS90，英國）和接觸角測量儀（Dataphysics OCA20，德國）。采用美國Thermo Fisher Scientific 公司生產(chǎn)的Nicolet 6700 型傅里葉紅外光譜分析儀（FTIR）表征污泥表面官能團(tuán)：取2mg 干燥污泥樣品、200mg光譜純KBr研細(xì)均勻，壓片測試，波數(shù)范圍400～4000cm-1，掃描次數(shù)32，分辨率4cm-1。

1.4 比厭氧氨氧化活性測定及生長模型擬合

在各個階段穩(wěn)定運(yùn)行時，取適量顆粒污泥于厭氧培養(yǎng)瓶中，加入反應(yīng)底物（NH4+-N 100mg/L、NO2--N 100mg/L）并 添 加NaHCO3調(diào) 節(jié)pH 為7.5±0.1后，通入10min的高純氮?dú)猓?9.9%）去除水中的溶解氧后，將其放置于恒溫?fù)u床（避光、35℃、150r/min）反應(yīng)。每間隔30min 使用注射器收集上清液，測定樣品中NH?+-N、NO?--N 的變化情況，選取基質(zhì)降解對時間線擬合的最大斜率，根據(jù)式(1)計(jì)算最大比厭氧氨氧化速率。

式中，SAA為比厭氧氨氧化活性，mg N/(gVSS·d)；ΔN為基質(zhì)（NH?+-N、NO?--N）的降解量，mg N/L；ΔT為反應(yīng)時間，min；VSS 為厭氧培養(yǎng)瓶中污泥濃度，mg/L。

此外，根據(jù)在不同階段下獲得的SAA 使用簡化的Gompertz 方程模型式(2)、式(3)計(jì)算AnAOB 增長率（μSAA）和倍增時間（TD-SAA）[16-17]。

式中，μSAA表示厭氧氨氧化活性的增長率，d-1；t表示運(yùn)行天數(shù)，d；L表示為滯后期，d；TD-SAA表示厭氧氨氧化活性的倍增時間，d。

1.5 高通量測序分析

在EGSB反應(yīng)器運(yùn)行至117d后，采集污泥樣品并儲存在-20℃下待測定。使用OMEGA 試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit提取基因組DNA。細(xì)菌PCR 擴(kuò)增所用引物采用Miseq 測序平臺的16SrRNA 通用引物V3～V4 引物，引物序列338F/806R（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'/5'-GGA CTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。高通量測序委托上海生工科技有限公司（Sangon Biotech）完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 低強(qiáng)度超聲波對EGSB 反應(yīng)器的長期運(yùn)行影響

圖2 顯示了RC和RU在不同氮負(fù)荷下脫氮性能的變化。由于母體反應(yīng)器的進(jìn)水NH?+-N、NO?--N均為200mg/L，為了使接種污泥能更快地適應(yīng)環(huán)境變化和維持穩(wěn)定運(yùn)行。實(shí)驗(yàn)第一階段的進(jìn)水NH?+-N、NO?--N 分別設(shè)置為200mg/L、220mg/L，與母體反應(yīng)器相近。在厭氧氨氧化污泥接種第5d 后，兩個反應(yīng)器的脫氮性能均恢復(fù)至穩(wěn)定，TN去除率維持在87.46%±2.64%，NRR為(2.64±0.02)kg N/(m3·d)。

在穩(wěn)定運(yùn)行至第9d 時，開始對RU反應(yīng)器進(jìn)行周期性超聲波輻照。RU的脫氮性能出現(xiàn)了明顯波動，出水總氮呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第19d下降至最低點(diǎn)，TN 去除率為77.01%，隨后逐漸開始恢復(fù)，在第31d 恢復(fù)至原來水平。其間，RC的TN去除率一直維持在87.53%±2.24%。出現(xiàn)該現(xiàn)象可能是由于厭氧氨氧化菌逐漸適應(yīng)超聲波的加入所導(dǎo)致。同時在前期超聲輻照時，可以觀察到RU的出水渾濁并夾雜著少許絮狀污泥。這可能是由于超聲波處理使沉降性能差及無法適應(yīng)環(huán)境的污泥排出反應(yīng)器。

第Ⅱ階段（41～67d），將進(jìn)水NH?+-N、NO?--N分別提升至250mg/L、300mg/L，NLR為3.77kg N/(m3·d)。RC和RU的脫氮性能均出現(xiàn)了下降，TN去除率分別下降至72.6%±1.8%和72.3%±2.6%。這是由于突然的氮負(fù)荷沖擊導(dǎo)致微生物活性受到了影響。研究發(fā)現(xiàn)，氮負(fù)荷沖擊會破壞厭氧氨氧化反應(yīng)，對厭氧氨氧化菌活性造成暫時性的抑制[18]。實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，在第51d后兩個反應(yīng)器脫氮性能開始逐漸提升，直到第59d時TN去除率均恢復(fù)至85%。

第Ⅲ階段（69～91d），將進(jìn)水NH?+-N、NO?--N分別提升到300mg/L、360mg/L，NLR為4.52kg N/(m3·d)。RC的TN去除率下降至72.12%。RU在低強(qiáng)度超聲波作用下，可以保持較好的脫氮性能，TN 去除率維持在81.10%。雖然NO?--N作為厭氧氨氧化菌的底物，但較高濃度的亞硝態(tài)氮會導(dǎo)致細(xì)菌活性降低甚至損害其細(xì)胞結(jié)構(gòu)。而合適的超聲波輻照可以增強(qiáng)厭氧氨氧化菌的活性，促進(jìn)對底物的利用效率，從而降低高氮負(fù)荷對微生物細(xì)胞的抑制?？梢姡?dāng)受到氮負(fù)荷沖擊時，低強(qiáng)度超聲波輻照能有效提高Anammox-EGSB的運(yùn)行穩(wěn)定性。

第Ⅳ階段（93～117d），進(jìn)水NH?+-N、NO?--N濃度分別提升至400mg/L、480mg/L，NLR 為6.03kg N/(m3·d)。RU在經(jīng)過7d的脫氮性能波動后，恢復(fù)至穩(wěn)定[TN 去除率為86.20%±0.60%，NRR 為(5.20±0.04)kg N/(m3·d)]。然而，RC在受到氮負(fù)荷沖擊后TN 去除率迅速下降至了68.04%，即使經(jīng)過24d 的適應(yīng)后其TN 去除率也只能維持在74.81%±0.76%，NRR 為(4.51±0.04)kg N/(m3·d)。在第四階段結(jié)束時，RU的TN去除率比RC提升了11.40%。由此表明，低強(qiáng)度超聲波輻照不僅提高了Anammox-EGSB 反應(yīng)器的運(yùn)行穩(wěn)定性，同時有效增強(qiáng)了其在無機(jī)高氨氮廢水中的脫氮性能。

2.2 超聲處理對污泥特性的影響

2.2.1 污泥濃度

如圖3所示，兩個Anammox-EGSB反應(yīng)器的初始平均MLSS 和MLVSS 分別為13.50g/L 和7.21g/L，MLVSS/MLSS 為0.53。第一階段結(jié)束后（39d）發(fā)現(xiàn)RC的MLSS 和MLVSS 有小幅度上漲。相反，RU則出現(xiàn)明顯的下降趨勢，MLSS和MLVSS分別下降至12.10g/L和5.78g/L，同時MLVSS/MLSS 也下降至0.48。出現(xiàn)反應(yīng)器污泥流失的原因主要是在低強(qiáng)度超聲波的作用下部分絮狀污泥被分散，同時不適宜無機(jī)高氨氮環(huán)境的微生物且衰老細(xì)胞對超聲波的耐受性較差，進(jìn)而細(xì)胞溶解進(jìn)入上清液中被排出[19]。而性能較差的污泥快速流失可能會使RU中剩余的污泥具有較高的生物活性，同時在后續(xù)運(yùn)行中具有更充足的底物供給和生存空間。在后續(xù)三個階段運(yùn)行中發(fā)現(xiàn)，RU生物量的增長明顯高于RC，由此推測在低強(qiáng)度超聲波刺激下，厭氧氨氧化菌的增殖速率可能具有明顯增加。MLVSS/MLSS可近似表征污泥中活性微生物含量，其比值大小一定程度上可以反映出厭氧氨氧化污泥的活性高低。在圖3中可以發(fā)現(xiàn)，RC中MLSS/MLVSS 一直處于較為穩(wěn)定的狀態(tài)，這是由于其微生物的增殖和衰老細(xì)胞流失所導(dǎo)致的動態(tài)平衡。而RU則有明顯的增加趨勢，這說明在低強(qiáng)度超聲波作用下污泥中微生物的增殖大于衰老細(xì)胞流失速度。同時有研究表明，單位體積污泥中活性微生物含量的提高可有效提升污泥消耗底物的能力，同時抵抗外界干擾和適應(yīng)能力也會得到提升[20]。

2.2.2 粒徑分布

圖4顯示了不同階段反應(yīng)器中厭氧氨氧化顆粒污泥的粒徑分布。在第39d、57d、89d、117d從每個反應(yīng)器中取樣。在第39d 時RC和RU的平均粒徑分別為0.49mm 和0.53mm，同時發(fā)現(xiàn)RU中粒徑為0.1～0.2mm的顆粒污泥明顯少于RC，這意味著在低強(qiáng)度超聲波的作用下，反應(yīng)器中粒徑較小及沉降性能差的污泥流失導(dǎo)致RU的顆?；瘍?yōu)于RC，這也與污泥濃度的變化情況相符。由于EGSB反應(yīng)器較高的上升流速及污泥的產(chǎn)氣會對生物絮體施加剪切力，從而增強(qiáng)厭氧氨氧化污泥的造粒過程[21]。因此在第57d 時，RC和RU的平均粒徑分別提升至0.78mm 和0.81mm。第87d 時，RC和RU已基本完全顆?；?，同時兩組反應(yīng)器的粒度分布出現(xiàn)了不一樣的峰值。RC的顆粒主要集中在0.8～1.4mm，污泥占比47.37%，而RU的污泥顆粒主要集中在0.6～1.1mm，污泥占比52.68%。有研究表明，粒徑為0.5～1.0mm的厭氧氨氧化顆粒污泥具有最高的機(jī)械強(qiáng)度[22]。因此可以推測超聲波所產(chǎn)生的高頻率振動和空化作用會對顆粒污泥產(chǎn)生沖擊，不利于厭氧氨氧化污泥形成粒徑較大的顆粒，致使顆粒污泥維持在機(jī)械強(qiáng)度較高的粒徑范圍內(nèi)。第117d時RC和RU平均粒徑分別提升到了1.31mm和1.17mm，同時兩個反應(yīng)器污泥粒徑分布的差異更加顯著。RC中顆粒污泥粒徑持續(xù)增長，粒徑為1.5～2.0mm的顆粒占大多數(shù)，占比為33.45%。而RU的顆粒污泥主要集中在1.0～1.5mm，占比為39.18%。有研究表明，顆粒大小為1.0～1.5mm顆粒污泥的生物量和厭氧氨氧化菌的相對豐度值最大[22]。而粒徑較大的污泥脫氮性能會有所下降，這是由于顆粒內(nèi)部的微生物對底物的獲取存在一定的限制和障礙[23]。同時內(nèi)部微生物可能會由于缺少底物而死亡，顆粒內(nèi)部形成空洞，并使得污泥顆粒漂浮在反應(yīng)器的上清液中[7]，進(jìn)而導(dǎo)致反應(yīng)器生物質(zhì)的流失、出水管道堵塞等威脅反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行的問題。因此，使用合適的低強(qiáng)度超聲波對Ananmmox-EGSB 反應(yīng)器進(jìn)行周期性輻照，控制顆粒污泥粒徑在一個合適的范圍內(nèi)，不僅能有效提高反應(yīng)器的脫氮性能，還有助于降低反應(yīng)器崩潰的風(fēng)險。

圖4 各階段穩(wěn)定運(yùn)行時反應(yīng)器厭氧氨氧化顆粒污泥粒徑分布情況

2.3 超聲處理對EPS的影響

2.3.1 超聲處理對EPS組分及含量的影響

EPS是由微生物在生長過程中分泌的復(fù)雜和富有黏性的物質(zhì)，可作為微生物的保護(hù)屏障并為其在不利環(huán)境中存活提供有利條件。與其他微生物相比，厭氧氨氧化菌會分泌更多EPS，從而具有了更高的聚集能力和疏水性[24]。微生物中的EPS可以分為兩種：松散結(jié)合型LB-EPS 和緊密結(jié)合型TBEPS。LB-EPS 為細(xì)胞的黏附或聚集的主要表面，在細(xì)胞的外層。而TB-EPS則緊密穩(wěn)定地結(jié)合在微生物的細(xì)胞表面，作為細(xì)胞免受各種抑制物質(zhì)影響的最終保護(hù)層。

為了研究低強(qiáng)度超聲波對反應(yīng)器中微生物EPS的影響，在第Ⅳ階段穩(wěn)定時，收集污泥樣品進(jìn)行提取分析。厭氧氨氧化顆粒污泥的EPS主要含量如圖5所示。RU污泥中的總EPS（T-EPS）含量[(101.65±2.02)mg/g VSS]明 顯 高 于RC[(90.74±0.34)mg/g VSS]，提高了12.1%。而T-EPS 的提高主要?dú)w因于PN 的增加（表2）。顯然，超聲波輻照有助于誘導(dǎo)微生物分泌更多的PN，有助于維持細(xì)菌致密和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，以適應(yīng)不利環(huán)境的影響，還能提高其代謝活性[25]。這解釋了在氮負(fù)荷沖擊時，RU的穩(wěn)定性要優(yōu)于RC。

表2 超聲波處理對EPS的含量和成分的影響 單位：mg/g VSS

圖5 超聲波處理對不同分層EPS含量的影響

細(xì)胞所分泌的EPS在顆粒污泥聚集中起到?jīng)Q定性的作用[26]。EPS 中含有大量的疏水性氨基酸和高水平的結(jié)構(gòu)松散蛋白質(zhì)，能有效提高顆粒污泥的疏水性，進(jìn)而導(dǎo)致厭氧氨氧化污泥的高聚集能力[27]。PN和PS在EPS中極大地影響著顆粒污泥的表面電荷和疏水性。為此，對厭氧氨氧化顆粒污泥樣品zeta電位和接觸角進(jìn)行測定，結(jié)合EPS各組分的變化情況進(jìn)行分析。由于厭氧氨氧化顆粒污泥的zeta電位為負(fù)，因此較高的zeta電位意味著較低的表面電荷和排斥力，細(xì)菌的聚集性能增強(qiáng)。而接觸角反映出顆粒污泥的親疏水性，接觸角越大意味著疏水性越好。疏水性可以引發(fā)生物質(zhì)的顆?；?，是促進(jìn)細(xì)菌聚集的關(guān)鍵因素。如表3所示，RU的zeta電位和接觸角均低于RC，表明低強(qiáng)度超聲波會減弱厭氧氨氧化顆粒污泥的聚集性。有研究發(fā)現(xiàn)，超聲波通過破壞氫鍵等分子間作用力，使厭氧氨氧化顆粒污泥表層的EPS 結(jié)構(gòu)局部剝落和溶解[28]。由此推測，由于超聲波對EPS的剝落作用導(dǎo)致了顆粒污泥中所含有的疏水性氨基酸降低，從而影響小顆粒進(jìn)一步往大顆粒聚集。這也解釋了在87d后RU中厭氧氨氧化顆粒污泥平均粒徑要低于RC。顆粒表層的EPS脫落有助于促進(jìn)底物與代謝產(chǎn)物進(jìn)出顆粒內(nèi)部的速率，提高顆粒污泥對底物的利用率，改善了厭氧氨氧化細(xì)菌的生存環(huán)境，進(jìn)而增強(qiáng)了厭氧氨氧化顆粒污泥的脫氮效能。

表3 不同厭氧氨氧化顆粒污泥樣品的zeta電位和接觸角

2.3.2 超聲處理對EPS成分的影響

利用3D-EEM光譜檢測了EPS中具有熒光特性的有機(jī)物，不同的峰位代表著不同的物質(zhì)[29]。如圖6所示，峰A 為色氨酸或類蛋白質(zhì)（Ex/Em=280～290nm/325～350nm），B 峰為芳香族蛋白（Ex/Em=235～240nm/320～325nm），峰C 為酪氨酸蛋白物質(zhì)（Ex/Em=230～240nm/300～325nm）。在LB-EPS 中，RC和RU均存在類色氨酸蛋白和芳香族蛋白，這說明超聲波處理對LB-EPS中蛋白質(zhì)的組成幾乎沒有影響。但RU中峰A 和峰B 的熒光強(qiáng)度均高于RC，表明在超聲波作用下芳香族蛋白質(zhì)物質(zhì)、色氨酸或類蛋白質(zhì)的含量有所增加。此外，在TB-EPS中發(fā)現(xiàn)，RU除了色氨酸或類蛋白質(zhì)含量有所增加以外，還明顯出現(xiàn)了與酪氨酸蛋白物質(zhì)相關(guān)的峰C。這些變化表明，超聲波處理可能增加了微生物的蛋白質(zhì)合成能力，從而提高厭氧氨氧化菌的生長。

圖6 不同類型EPS的三維熒光光譜

2.4 超聲輻照對污泥表面官能團(tuán)的影響

為了進(jìn)一步揭示超聲波對厭氧氨氧化顆粒污泥親疏水性的影響。采用FTIR 表征RC、RU污泥表面官能團(tuán)，探究超聲輻照對顆粒污泥表面官能團(tuán)的影響。如圖7 中所示，RC和RU的FTIR 峰的位置基本一致，這表明了低強(qiáng)度超聲波輻照并不能對顆粒污泥表面的官能團(tuán)種類產(chǎn)生影響。在波長為3300cm-1左右的特征峰主要?dú)w因于—OH 和—NH 的伸縮振動，—OH 是由污泥產(chǎn)生的有機(jī)物（醇類、酚類或者糖類等），—NH 可能是由于蛋白質(zhì)中的胺類物質(zhì)產(chǎn)生所導(dǎo)致的。在波長為2928cm-1左右的特征峰主要?dú)w因于亞甲基—CH2不對稱伸縮振動，可能是由于脂肪族或者烴類化合物的產(chǎn)生所導(dǎo)致。而波長為1430cm-1左右的特征峰為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的COO—基團(tuán)中C= = O對稱伸縮振動所導(dǎo)致。對比RU和RC各特征峰的峰強(qiáng)發(fā)現(xiàn)，RU的3300cm-1和1430cm-1峰強(qiáng)要高于RC，而2928cm-1的峰強(qiáng)有所降低。結(jié)果表明，經(jīng)過低強(qiáng)度超聲波輻照后顆粒污泥表面的羥基、羧基、氨基等親水官能團(tuán)有所增多，從而導(dǎo)致厭氧氨氧化顆粒污泥疏水性變差。這也解釋了超聲波輻照后顆粒污泥的粒徑并沒有進(jìn)一步增大的原因。

圖7 厭氧氨氧化顆粒污泥的紅外光譜圖

2.5 顆粒污泥中的厭氧氨氧化活性

在第1d、39d、59d、87d和109d對污泥中的厭氧氨氧化活性進(jìn)行測定。如圖8 所示，在前59d 厭氧氨氧化的活性相對較低，增長速度較為緩慢。這可能是由于接種后的厭氧氨氧污泥未能快速地適應(yīng)新環(huán)境，而氮負(fù)荷較低也是影響厭氧氨氧化菌生長的主要原因[30]。當(dāng)反應(yīng)器在NLR 為3.77kgN/(m3·d)穩(wěn)定運(yùn)行時（第59d），可以觀察到RU和RC中的污泥活性都在迅速增加。細(xì)菌的生長速率可以有效評價反應(yīng)系統(tǒng)中生物量富集和厭氧氨氧化能力。為此，通過簡化的Gompertz 方程模型擬合SAA 值與運(yùn)行時間，確定厭氧氨氧化菌的增長速率及其倍增時間。擬合結(jié)果表明，RC中厭氧氨氧化菌的生長速率（μSAA）為0.0107d-1，倍增時間（TD-SAA）為64.8d。而RU的生長速率（μSAA）為0.0127d-1，倍增時間（TD-SAA）為54.5d。這說明了低強(qiáng)度超聲波輻照有利于厭氧氨氧化菌的生長富集，同時也反映了超聲波輻照能加快Anammox-EGSB的啟動速度。

圖8 厭氧氨氧化顆粒污泥的活性變化情況

2.6 污泥的微生物分析

2.6.1 細(xì)菌多樣性指數(shù)分析

表4 為Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表，所有樣本的覆蓋度值均超過99%，表明本次測序足以覆蓋整個微生物群落。表中的Ace、chao1 指數(shù)能反映出微生物群落的豐富度情況，Shannon、Simpson指數(shù)則表示微生物群落的多樣性。RU的Shannon指數(shù)低于RC，這是由于低強(qiáng)度超聲波的長期輻照對微生物產(chǎn)生了篩選作用，部分不適應(yīng)環(huán)境、活性低的微生物細(xì)胞被淘汰出反應(yīng)器，從而導(dǎo)致RU的微生物群落多樣性降低。Simpson 指數(shù)能表明微生物群落中優(yōu)勢種群生物量在總生物量中的占比情況。RU的Simpson 指數(shù)要大于RC，這說明低強(qiáng)度超聲波促進(jìn)了反應(yīng)器中部分優(yōu)勢菌種的生長繁殖，同時耐受性較差的微生物不斷死亡，優(yōu)勢種群得到了有效的富集，優(yōu)勢更為明顯。

表4 不同厭氧氨氧化顆粒污泥樣品的Alpha多樣性數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

2.6.2 細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)分析

由圖9(a)可知，RC在門水平上的主要菌門（＞1%）分別為浮霉菌門Planctomycetes（52.57%）、變形菌門Proteobacteria（31.23%）、酸桿菌門Acidobacteria（1.92%）、擬干菌門Bacteroidetes（1.41%）和綠彎菌門Chloroflexi（1.02%）。而RU在門水平上的主要菌門（＞1%） 分別為浮霉菌門Planctomycetes（74.75%）、變形菌門Proteobacteria（8.09%）、酸桿菌門Acidobacteria（3.67%）、綠彎菌門Chloroflexi（1.40%）、放線菌門Actinobacteria（1.93%）和裝甲菌門Armatimonadetes（1.31%）?？梢姴煌T微生物對超聲波刺激具有不同的耐受性。經(jīng)過超聲波周期性輻照后，Planctomycetes、Chloroflexi、Armatimonadetes 和Acidobacteria 的相對豐度值都得到了提升。Planctomycetes 具有較高的相對豐度是由于厭氧氨氧化菌的豐富存在[31]，該菌門的提升有助于提高反應(yīng)器的脫氮性能。Chloroflexi 是一種兼性厭氧微生物，其存在有助于為厭氧氨氧化菌建立一個嚴(yán)格的厭氧環(huán)境[32]。有研究發(fā)現(xiàn)，Armatimonadetes可為厭氧氨氧化細(xì)菌提供葉酸和鉬輔因子，協(xié)助厭氧氨氧化細(xì)菌完成碳固定過程[33]。因此，超聲波輻照污泥有助于厭氧氨氧化共生菌的增加，從而維持良好的生態(tài)平衡，促進(jìn)功能菌的快速增殖。而Proteobacteria、Bacteroidetes 在受到超聲波的輻照后出現(xiàn)大幅的下降。Proteobacteria已被證實(shí)在無機(jī)廢水中能通過降解可溶性微生物產(chǎn)物（如死細(xì)胞等）與浮霉菌門共存，并具有反硝化能力[34]?？梢姷蛷?qiáng)度超聲波加快了異養(yǎng)細(xì)菌在無機(jī)環(huán)境中的淘汰速度。

圖9 低強(qiáng)度超聲波對污泥厭氧氨氧化顆粒污泥的菌落結(jié)構(gòu)影響

為了進(jìn)一步評估超聲波輻照對微生物的影響機(jī)制，對反應(yīng)器微生物群落的屬水平進(jìn)行了分析。在圖9(b)可以看到RC與RU之間的優(yōu)勢菌屬有著顯著的變化。在兩個反應(yīng)器中Candidatus Brocadia為核心物種，其為目前已發(fā)現(xiàn)的6個厭氧氨氧化菌屬中的一個。RU的Candidatus Brocadia相對豐度高達(dá)74.45%，比RC提高了22.03%。同時在RU（0.123%）中發(fā)現(xiàn)了另一種厭氧氨氧化菌Candidatus Kuenenia，該菌屬的相對豐度仍高于RC（0.03%）。說明低強(qiáng)度超聲波輻照有利于厭氧氨氧化菌的富集。在超聲輻照后超聲組RU中Caulobacteraceae、Aquamicrobium、Rheinheimera、Burkholderiales、Thermomona、Comamona、Xanthomonadaceae、Aquimonas都出現(xiàn)了明顯的下降，同時它們均屬于變形菌門，且與反應(yīng)器中的反硝化功能相關(guān)[35-39]。在超聲波的影響下，RU中的反硝化菌相對豐度明顯低于RC。反硝化菌的消亡有助于減少其對厭氧氨氧化細(xì)菌的底物（亞硝態(tài)氮）競爭。兩個反應(yīng)器微生物特性的差異揭示了超聲波處理對厭氧氨氧化工藝的影響。由于微生物不同生理特征，導(dǎo)致其對超聲波的耐受程度不同。在經(jīng)過低強(qiáng)度超聲波長期間歇式處理后，厭氧氨氧化共生菌得到富集，進(jìn)而維持良好的生態(tài)平衡。此外，一些與厭氧氨氧化菌存在競爭關(guān)系的微生物被加速淘汰，使厭氧氨氧化菌可利用的底物和生存空間更加充足，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)厭氧氨氧化菌快速富集。

3 結(jié)論

（1）低強(qiáng)度超聲波可提高Anammox-EGSB 反應(yīng)器在高負(fù)荷條件下的脫氮性能。在進(jìn)水條件下RU的總氮去除率提高了11.40%，并有效提高了反應(yīng)器的抗氮負(fù)荷沖擊能力。

（2）經(jīng)超聲波周期性輻照后，厭氧氨氧化顆粒污泥的粒徑主要控制在1.0～1.5mm，傳質(zhì)效率改善，厭氧氨氧化顆粒污泥活性提升。同時有助于顆粒內(nèi)部的氣體釋放，減少污泥漂浮，提高反應(yīng)器穩(wěn)定性。

（3）長期低強(qiáng)度超聲波處理提高了厭氧氨氧化菌的生長速率，縮短了倍增時間。超聲波對厭氧氨氧化菌Candidatus Brocadia有顯著的促進(jìn)作用，相比對照組RC提升了22.03%。同時嚴(yán)重抑制了反硝化細(xì)菌，削弱其他細(xì)菌對底物和生存空間的侵占，有助于厭氧氨氧化菌的富集。