馮玉樹(shù),李貴琴,李冰慧,李勤凡,王 妍

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)為無(wú)莢膜、無(wú)芽孢、有鞭毛和有菌毛的革蘭氏陰性桿菌,廣泛分布于自然界、動(dòng)物腸道、糞便[1]。是一種重要的條件致病菌,可感染人[2]、牛[3]、犬[4]、雞[5]等,能夠引起食物中毒、尿路感染、腹瀉、肺炎、敗血癥等多種疾病。近年來(lái)奇異變形桿菌引起的人畜疾病屢見(jiàn)不鮮,對(duì)牛養(yǎng)殖業(yè)造成的損失也日益突出。由奇異變形桿菌引發(fā)的犢牛腹瀉病案例逐年增多[6-7],主要癥狀為腹瀉、脫水、敗血癥等、嚴(yán)重者死亡,同時(shí)感染的動(dòng)物也可成為人類(lèi)變形桿菌感染的潛在來(lái)源。為避免抗生素不合理使用導(dǎo)致的菌株耐藥性增強(qiáng),迫切需要探究合理的用藥方案來(lái)控制此類(lèi)疾病的發(fā)生。近年來(lái)針對(duì)變形桿菌的中藥抑菌研究頗多[8-9],但均是對(duì)單味藥進(jìn)行研究,中藥聯(lián)合抑菌方面的研究較少。為尋找合理的中獸藥抗菌方案,本試驗(yàn)選擇20味先前報(bào)道有抑菌作用的中藥,探究對(duì)奇異變形桿菌的抑菌作用,篩選抑菌效果較好的中藥,分析其不同組合的聯(lián)合抑菌效果,以期為感染奇異變形桿菌的動(dòng)物臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和培養(yǎng)基 菌種由寧夏某牛場(chǎng)犢牛腹瀉樣本分離到并經(jīng)鑒定為奇異變形桿菌,由本實(shí)驗(yàn)室保藏。M-H肉湯培養(yǎng)基,海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;瓊脂粉、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 中藥材 薄荷、厚樸、艾葉、香附、黃連、連翹、桂枝、金銀花、青蒿、半枝蓮、丁香、知母、黃芩、穿心蓮、訶子、肉豆蔻、蘆薈、石榴皮、五倍子、魚(yú)腥草,購(gòu)于陜西華仁堂大藥房。

1.1.3 主要儀器 高壓蒸汽滅菌鍋LS35HG,江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品;恒溫?fù)u床100B,上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品;恒溫培養(yǎng)箱MJP150,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA,上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品;循環(huán)水多用真空泵SHB-B,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取物的制備 取20 g中藥打磨成粉,加入10倍體積去離子水,浸泡過(guò)夜,大火煮沸之后文火煮1 h,減壓過(guò)濾,回收濾液,殘?jiān)尤?倍體積去離子水煮沸之后文火煮30 min,減壓過(guò)濾,合并2次濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至20 mL(中藥濃度1 g/mL)。

1.2.2 中藥提取物對(duì)奇異變形桿菌的MIC和MBC測(cè)定 采用微量二倍稀釋法進(jìn)行測(cè)定。將MH培養(yǎng)基加入96孔板,對(duì)藥液進(jìn)行稀釋,加入同體積載菌量為1×106CFU/mL的奇異變形桿菌菌液。平行對(duì)照3個(gè),并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照,37℃培養(yǎng)24 h。每孔避光加入10 μL濃度為0.2 mg/mL的碘硝基四唑紫指示劑,繼續(xù)培養(yǎng)30 min,眼觀無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度即為MIC值。將上述澄清透明液體各孔吸出0.1 mL,均勻涂抹于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,37℃培養(yǎng)24 h,未長(zhǎng)菌的平板上所涂原液濃度為藥物的MBC,試驗(yàn)重復(fù)3次。當(dāng)MIC<7.80 mg/mL為高度敏感;7.80 mg/mL≤MIC≤250 mg/mL為中度敏感;MIC>250 mg/mL為不敏感。

1.2.3 棋盤(pán)法聯(lián)合抑菌試驗(yàn) 選取1.2.2中抑菌效果好的中藥提取物,采用棋盤(pán)稀釋法檢測(cè)兩兩聯(lián)合用藥對(duì)奇異變形桿菌的抑制效果。菌液濃度為1×106CFU/mL,各藥物終濃度梯度為4、2、1、1/2、1/4、1/8 MIC,并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照,37℃培養(yǎng)24 h。每孔避光加入10 μL濃度為0.2 mg/mL的碘硝基四唑紫指示劑,繼續(xù)培養(yǎng)30 min,觀察各孔細(xì)菌生長(zhǎng)情況。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

計(jì)算聯(lián)合抑菌指數(shù)(FIC):FIC指數(shù)= MICA藥聯(lián)用/MICA藥單用+ MICB藥聯(lián)用/MICB藥單用,FIC指數(shù)<0.5為協(xié)同作用,FIC指數(shù)0.5～1.0 為相加作用,FIC指數(shù)1.0～2.0為無(wú)關(guān)作用,FIC指數(shù)>2.0為拮抗作用。

1.2.4 時(shí)間殺菌曲線的測(cè)定及繪制 選取1.2.3中的中藥組合進(jìn)行聯(lián)合效果確證試驗(yàn),設(shè)計(jì)不同藥物組合測(cè)定其對(duì)奇異變形桿菌的時(shí)間-殺菌曲線。將配制好的濃度為2×105CFU/mL菌懸液分別加于同體積藥液中,使菌懸液終濃度為1×105CFU/mL?；靹蚝蠓湃?7℃搖床內(nèi)培養(yǎng),并設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照。分別于0、2、4、6、8、12、24 h吸取培養(yǎng)液,用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行10倍梯度稀釋,選取合適稀釋度菌懸液,50 μL涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),所有試驗(yàn)重復(fù)3次。取平均數(shù)的對(duì)數(shù)繪制出時(shí)間殺菌曲線,根據(jù)菌落計(jì)數(shù)判斷抑菌效應(yīng)。培養(yǎng)24 h后,聯(lián)合用藥的與單用藥效果最好的相比,如果降低≥2 Log10CFU/mL則認(rèn)為協(xié)同作用;降低1～2 Log10CFU/mL,則認(rèn)為相加作用;降低<1 Log10CFU/mL則認(rèn)為無(wú)關(guān)作用;增加≥2 Log10CFU/mL,則認(rèn)為拮抗作用[10]。

2 結(jié)果

2.1 中藥提取物對(duì)奇異變形桿菌的體外抑菌效果

不同中藥提取物的抑菌活性差異較大(表1),根據(jù)MIC值可以判定訶子、薄荷、黃連、艾葉、知母、金銀花、五倍子7種中藥提取物有較好抑菌效果。其中訶子水提物對(duì)奇異變形桿菌的抑制效果為高度敏感,其余6種中藥為中度敏感。選取這7味藥進(jìn)行聯(lián)合抑菌試驗(yàn),進(jìn)一步篩選表現(xiàn)協(xié)同作用的中藥組合。

表1 20味中藥對(duì)奇異變形桿菌的抑菌效果

2.2 中藥提取物對(duì)奇異變形桿菌的體外聯(lián)合抑菌活性

選取對(duì)奇異變形桿菌高敏的訶子與中度敏感的6種藥物兩兩組合,對(duì)奇異變形桿菌的體外抑菌活性如圖1。其中訶子和薄荷組合FIC值為0.31,表現(xiàn)為協(xié)同作用;訶子和黃連、訶子和金銀花、訶子和艾葉、訶子和五倍子的FIC值分別為0.56、0.56、0.75、0.56,表現(xiàn)為相加作用;訶子和知母的FIC值為1.13,表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用。

2.3 訶子、薄荷單用和聯(lián)用對(duì)奇異變形桿菌殺菌效果

將培養(yǎng)基中加有不同中藥提取物的奇異變形桿菌培養(yǎng)24 h,分別于0、2、4、6、8、12、24 h吸出部分菌液計(jì)算濃度、繪制曲線(圖2),培養(yǎng)24 h時(shí),各單獨(dú)給藥組的細(xì)菌載量相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照組減少1.9～12.2 Log10CFU/mL,表示7種藥物都對(duì)奇異變形桿菌的生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用。其中訶子和知母聯(lián)用組效果較好單藥訶子組菌落數(shù)升高約1.8 Log10CFU/mL,表現(xiàn)無(wú)關(guān)作用(圖2A);訶子和薄荷聯(lián)用組比效果較好單藥薄荷組菌落數(shù)降低約4 Log10CFU/mL,表現(xiàn)為協(xié)同作用(圖2B)。其余4組訶子和艾葉聯(lián)用組、訶子和金銀花聯(lián)用組、訶子和黃連聯(lián)用組、訶子和五倍子聯(lián)用組比最強(qiáng)單藥組菌落數(shù)減少約1～2 Log10CFU/mL,表現(xiàn)為相加作用(圖2C～F)。其中五倍子和訶子聯(lián)用組于接種后8 h時(shí),菌落數(shù)降為0,表示兩藥聯(lián)用能發(fā)揮很好的殺菌作用(圖2F)。

圖2 不同中藥提取物組合的對(duì)奇異變形桿菌的時(shí)間-殺菌曲線

3 討論

隨著奇異變形桿菌性腹瀉發(fā)生率的持續(xù)增高[6-7],病原菌的耐藥性增強(qiáng)和抗生素殘留問(wèn)題日益嚴(yán)重,使得“減抗、替抗”成為主流新藥研發(fā)方向。而大多數(shù)中藥有效提取物對(duì)細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等病原都有廣泛的抑制作用,使其逐步應(yīng)用于臨床感染性疾病的治療。

為尋找抑制奇異變形桿菌生長(zhǎng)的高效中藥,本試驗(yàn)選取了20味中藥,通過(guò)體外抑菌試驗(yàn),從中篩選出訶子、薄荷、黃連、艾葉、知母、金銀花、五倍子7味藥對(duì)奇異變形桿菌的抑制作用較強(qiáng),體外抑菌能力明顯優(yōu)于其他中藥。其中訶子的抑菌效果最好,MIC值達(dá)到3.9 mg/mL,與訶子對(duì)大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌的抑菌效果8.51～8.61 mg/mL有差異[11],可能為不同產(chǎn)地和批次的中藥材所含有效抑菌物質(zhì)量不同,或者藥物對(duì)不同菌株的抑菌能力不同有關(guān)。

本試驗(yàn)對(duì)這7味中藥提取物進(jìn)行聯(lián)合抑菌試驗(yàn)分析,通過(guò)棋盤(pán)法和繪制時(shí)間-殺菌曲線兩種方法,證明了訶子和薄荷提取物的聯(lián)合抑菌效果表現(xiàn)為協(xié)同作用;訶子和黃連、訶子和金銀花、訶子和艾葉、訶子和五倍子表現(xiàn)為相加作用;訶子和知母表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用。其中訶子和五倍子組合在8 h內(nèi)完全殺菌,在幾種聯(lián)用組合中效果最好。訶子與石榴皮、訶子與抗生素聯(lián)用都有協(xié)同效果[12-13],訶子與薄荷聯(lián)用具有互相增強(qiáng)的作用,可以適當(dāng)減少用量節(jié)約成本。訶子提取物的主要抑菌成分為多酚類(lèi)、三萜類(lèi)、訶子酸等[14];薄荷提取物的主要抑菌成分為黃酮、萜類(lèi)等[15]。但具體是哪種物質(zhì)之間的相互作用使藥物對(duì)奇異變形桿菌生長(zhǎng)的抑制作用增強(qiáng)還需進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)用牛源腹瀉樣本中分離鑒定的奇異變形桿菌進(jìn)行中藥抑菌試驗(yàn),從中選出效果較好的中藥,進(jìn)行組合測(cè)定體外聯(lián)合抑菌效果,為訶子、薄荷、五倍子等聯(lián)合用藥的進(jìn)一步研究提供了資料。