陳翔鴻,曹 琪,諶 磊,鄧文芳,袁 意,孔丹妮,宋文博,2*,湯細(xì)彪*

(武漢科前生物股份有限公司,湖北武漢 430070;華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖北武漢 430070)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,PCV主要有豬圓環(huán)病毒1型(Porcine circovirus,PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)和豬圓環(huán)病毒4型(Porcine circovirus,PCV4)[1-2]。PCV1是一種細(xì)胞培養(yǎng)污染物,與疾病沒(méi)有關(guān)聯(lián)。PCV2是豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)的主要病原[3]。PCV3可能與豬皮炎腎病綜合征、母豬繁殖障礙 、心肌炎及多系統(tǒng)炎癥有關(guān)[4]。PCV4在我國(guó)湖南省幾頭患有嚴(yán)重呼吸道及腸道癥狀的豬中發(fā)現(xiàn),并命名為PCV4[2]。PCV2包含2個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框ORF1和ORF2,分別編碼復(fù)制酶(Rep)和衣殼(Cap)蛋白,Cap蛋白是該病毒可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)PCV2的中和抗體的一種重要的免疫原性蛋白[5]。與ORF1基因相比,ORF2基因表現(xiàn)出更多的遺傳變異,通常可作為系統(tǒng)發(fā)育和流行病學(xué)標(biāo)記。基于PCV2的ORF2中不同核苷酸位點(diǎn)比例將PCV2分為8個(gè)基因型,即PCV2a、b、c、d、e、f、g、h[6]。PCV3的基因組結(jié)構(gòu)與PCV1和PCV2類(lèi)似,ORF2 是變異最大的區(qū)域,編碼唯一的結(jié)構(gòu)蛋白(Cap蛋白),與病毒的感染和免疫有較強(qiáng)的相關(guān)性。PCV3 Cap蛋白的氨基酸數(shù)為214個(gè),比PCV2少19～29個(gè),與PCV1和 PCV2的基因組核苷酸同源性?xún)H為37%左右[7]?；贑ap蛋白氨基酸序列上第24位和第27位特異性氨基酸位點(diǎn)的差異,將PCV3分為PCV3a、PCV3b、PCV3c共3個(gè)基因型[8]。2012-2018年我國(guó)東南地區(qū)PCV2陽(yáng)性率為41.9%(272/649),PCV2d檢出率為67.6%(184/272),其次為PCV2b、PCV2a、PCV2c和PCV2e[9]。2015-2018年豫南地區(qū)PCV2陽(yáng)性率為27.39%(43/157),PCV2d占76.92%(10/13)[10]。2017-2018年華中地區(qū)PCV2感染率為68.53%(1091/1592),PCV2d占86.84%(33/38)[11]。2018-2020年我國(guó)不同省份PCV2的陽(yáng)性率為53%(3619/6872),PCV2d占79%(49/62個(gè)樣本)[12]。巴西在1967年從病料中檢出了PCV3病毒,提示 PCV3多年來(lái)一直存在于豬群中[13]。2016年對(duì)安徽、重慶、福建、河南等 11 個(gè)省市的臨床樣品進(jìn)行 PCV3檢測(cè),結(jié)果豬場(chǎng)陽(yáng)性率為 68.6%(24/35),個(gè)體陽(yáng)性率為 34.7%(77/222)[14]。2018-2021年我國(guó)PCV3總陽(yáng)性率為20.78%(2177/10478),190條PCV3全基因序列中,PCV3a占41.05%(78/190),PCV3b占20.53%(39/190),PCV3c占38.42(73/190)[15]。

PCV2可在淋巴系統(tǒng)內(nèi)增殖引起機(jī)體免疫抑制,誘發(fā)其他病原繼發(fā)感染[16]。感染PCV2的豬可能會(huì)增加PRRSV的致病性[17]。PCV2和PCV3混合感染可導(dǎo)致母豬持續(xù)返情、屢配不孕進(jìn)而引起繁殖障礙[18]。防控PCV2和PCV3感染最經(jīng)濟(jì)有效的方式是免疫接種,PCV3暫時(shí)無(wú)成熟的疫苗,而近年來(lái)PCV2疫苗的免疫效果不佳,這可能與PCV2基因型間存在重組、PCV2與PCV3及其他疾病的混合感染有關(guān)。 本文評(píng)估了PCV2、PCV3在豬群中的合并感染情況,在大多數(shù)感染樣本中觀(guān)察到2～3種病毒病原體的混合感染。基于Cap基因分析了PCV2和PCV3的遺傳變異,揭示了2020-2021年我國(guó)部分地區(qū)PCV2和PCV3的分子流行趨勢(shì)及混合感染情況,為科學(xué)防控該病及疫苗研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 由武漢科前生物動(dòng)物疫病診斷中心實(shí)驗(yàn)室提供,1447個(gè)疑似豬圓環(huán)病毒感染的臨床樣本來(lái)自2020-2021年我國(guó)13個(gè)省(直轄市、自治區(qū))的491個(gè)規(guī)?；i場(chǎng),包括肺臟、精液、血液及胎兒胎衣等。

1.1.2 主要試劑 病毒核酸提取試劑盒,南京中科拜爾醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品;瓊脂糖凝膠、DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒,北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品;2×Phanta?Flash Master Mix(Dye Plus)、2×Animal Detection U+Probe Master Mix,南京諾維贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品;DH5α、pMD19-T載體和DNA Marker DL 1 000,大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 低溫冰箱,海爾集團(tuán)產(chǎn)品;組織研磨儀,上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)和Mastercyclerep 384梯度PCR儀,Eppendorf公司產(chǎn)品;DYY-8C電泳儀,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;立式高壓蒸汽滅菌鍋,上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品;生物安全柜,北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng),美國(guó)ProteinSimple公司產(chǎn)品;熒光定量PCR儀器,Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 在PCV2和PCV3毒株中鑒定了病毒ORF2基因的保守區(qū)域,設(shè)計(jì)驗(yàn)證了一組雙重?zé)晒舛刻结樢?并設(shè)計(jì)了PCV2和PCV3的ORF2基因測(cè)序引物,引物和探針由艾科瑞生物科技有限公司合成(表1)。

表1 檢測(cè)引物和ORF2基因擴(kuò)增引物

1.2.2 病毒DNA的提取 按照病毒核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟,提取病毒DNA,置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 樣品的熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè) 試劑配制體系和反應(yīng)條件如下:Mix 10μL、DNA模板2 μL、PCV2和PCV3上、下游引物及探針各0.5 μL,加ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)條件為:37℃ 2 min;95℃ 30 s,95℃ 10 s,60℃退火采集熒光30 s,共45個(gè)循環(huán)。

1.2.4 ORF2基因片段的擴(kuò)增、克隆與鑒定 隨機(jī)選取45家和47家豬場(chǎng)Ct值≤30的PCV2和PCV3陽(yáng)性樣品,提取病毒DNA進(jìn)行ORF2基因的PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為25 μL:2×Phanta?Flash Master Mix (Dye Plus) 12.5 μL,ddH2O 6.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板4 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 40 s,72 ℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物,回收目的片段。將回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化,選單個(gè)菌落接種于含100 mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中,37℃、300 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h,提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)PCR鑒定送往北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.5 序列的比對(duì)與分析 根據(jù)測(cè)序結(jié)果用MegAlign軟件對(duì)獲得的PCV2及PCV3的ORF2基因序列(表2)和GenBank中已公布的16條國(guó)內(nèi)外有代表性的PCV2及PCV3的ORF2基因序列(表3)進(jìn)行核苷酸及氨基酸同源性分析,并對(duì)Cap蛋白氨基酸進(jìn)行多序列比對(duì),用MEGA6軟件繪制分子遺傳進(jìn)化樹(shù)。

表2 50株P(guān)CV2和PCV3 ORF2序列信息

表3 PCV2和PCV3參考毒株序列信息

2 結(jié)果

2.1 樣品的qPCR檢測(cè)結(jié)果

PCV2和PCV3在1447份樣品中陽(yáng)性率分別為29.16%和18.93%,在規(guī)?；i場(chǎng)陽(yáng)性率分別為47.05%和15.68%。用qPCR方法分別進(jìn)行MhP、PRRSV、PR的病原檢測(cè),從而了解其混合感染情況(圖1和表4)。在規(guī)?；i場(chǎng)中,PCV2和PCV3單一感染率分別為16.88%和7.79%,而PCV2和PCV3混合感染高達(dá)23.81%,PCV2與PCV3分別與PRRSV混合感染率分別為28.13%和23.37%,PCV2和PCV3、PCV2和PRRSV以及PCV3和PRRSV的混合感染率均高于PCV2和PCV3的單一感染,且存在與PRV、Mh等病原體2～4種不同程度的混合感染情況,表明2020-2021年我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)中PCV2和PCV3混合感染率較高,且存在PCV2和PCV3多種病原體混合感染的復(fù)雜情況。

圖1 不同病原體混合感染情況

2.2 ORF2基因PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果

用測(cè)序引物PCV2-F1/R1和PCV3-F2/R2對(duì)部分陽(yáng)性樣本質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定,分別獲得大小約為958 bp和645 bp的目的條帶(圖2),與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3 ORF2基因核苷酸與氨基酸同源性比對(duì)結(jié)果

用MegAlign軟件對(duì)測(cè)序獲取的PCV2和PCV3的ORF2基因核苷酸序列與各自對(duì)應(yīng)的16個(gè)參考毒株的ORF2核苷酸和Cap蛋白氨基酸進(jìn)行同源性比對(duì),發(fā)現(xiàn)50個(gè)PCV2序列與參考毒株序列的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為75.6%～100%和83.1%～99.1%。50個(gè)PCV3序列與參考毒株序列的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為95.9%～100%和96.3%～100%(表5)。

表5 PCV2和PCV3測(cè)序毒株ORF2的核苷酸與氨基酸同源性

2.4 ORF2基因分子遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

對(duì)測(cè)序得到的PCV2和PCV3的ORF2基因核苷酸序列進(jìn)行分子遺傳進(jìn)化分析(圖3～圖4),得出PCV2d占80%(40/50),PCV2a占4%(2/50),PCV2b占16%(8/50),未檢測(cè)到PCV2c和PCV2e。PCV3a、PCV3b和PCV3c分別占28%(14/50)、22%(11/50)和50%(25/50),表明2020-2021年我國(guó)部分地區(qū)PCV2的主要流行基因型是PCV2d,其次為PCV2a和PCV2b。PCV3在我國(guó)部分地區(qū)的主要流行基因型為PCV3c,而PCV3a和PCV3b流行率也依然較高。

▲、■、◆、●、◇、△、○、□標(biāo)記為PCV2a～PCV2h基因型參考序列

▲ PCV3a;■ PCV3b;● PCV3c

2.5 ORF2基因表達(dá)的Cap蛋白氨基酸多序列比對(duì)分析結(jié)果

以PCV2毒株CN/BDH/2010,GenBank(no.HM038017.1)為參考序列,對(duì)部分PCV2毒株的ORF2基因編碼的Cap蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析(圖5),圖5中方框位置為蛋白表位。I53、K59、R63、N68、L89、T90、T121、N134、R/G169、D210、I215是PCV2d的特異性突變位點(diǎn),可根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果區(qū)分PCV2d和PCV2b,能為PCV2的分子分析提供理論基礎(chǔ)。Cap蛋白氨基酸主要變異位點(diǎn)為53-91、121-136、169-215氨基酸位點(diǎn),此外還存在一些分散的突變位點(diǎn),如R8Y、V30L、T121S,R169S/A、D210E/A等。以PCV3毒株US/MO2015,GenBank(no.KX778720.1)為參考序列,對(duì)部分PCV3毒株ORF2基因編碼的Cap蛋白氨基酸序列進(jìn)行變異位點(diǎn)比較,圖6中方框位置為蛋白表位,可以看出PCV3的Cap蛋白氨基酸共有8個(gè)突變位點(diǎn),其中A24V、R27K、S77T是全球范圍PCV3公認(rèn)的Cap蛋白氨基酸突變位點(diǎn)。根據(jù)Cap蛋白A24V和R2K兩個(gè)突變位點(diǎn),可將50個(gè)PCV3毒株劃分為PCV3a(A24和R27)、PCV3b(A24和K27)和PCV3c(V24和K37),氨基酸高頻突變主要位于24、27、104和150位點(diǎn)。

圖5 PCV2 Cap蛋白氨基酸多序列比對(duì)

圖6 PCV3 Cap蛋白氨基酸多序列比對(duì)

3 討論

本研究結(jié)果顯示,2020-2021年我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)PCV2的樣本陽(yáng)性率29.16%,PCV3的樣本陽(yáng)性率為18.93%。PCV2和PCV3、PCV2和PRRSV以及PCV3和PRRSV的混合感染率均高于PCV2和PCV3的單一感染,且存在與PRV、Mh等病原體的混合感染,表明2020-2021年我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)中PCV2和PCV3混合感染率仍然較高,且存在PCV2和PCV3與多種病原體混合感染的復(fù)雜情況。本文分別隨機(jī)選取50份檢測(cè)到的PCV2和PCV3陽(yáng)性樣品,對(duì)其ORF2基因全序列分析,發(fā)現(xiàn)PCV2d陽(yáng)性率為80%,與前期研究中2012-2018年?yáng)|南地區(qū)(67.6%)、豫南地區(qū)(76.92%)、華中地區(qū)(86.84%)和2018-2020年多省份地區(qū)(79%)接近,進(jìn)一步證實(shí)了PCV2d基因型毒株已成為PCV2優(yōu)勢(shì)流行毒株。PCV3c陽(yáng)性率為50%,占比最高,其次為PCV3a和PCV3b。PCV3a為中部地區(qū)湖北、山西、安徽等省份的主要流行基因型,與之前的研究華中地區(qū)2013-2021年P(guān)CV3c占比50%(4/8)[15]相符。而PCV3b感染的省份中也覆蓋了PCV3a和PCV3c的感染分布區(qū)域,預(yù)示著PCV3的變異情況在我國(guó)規(guī)模化豬場(chǎng)中普遍存在,且PCV3優(yōu)勢(shì)基型已從PCV3a向PCV3c轉(zhuǎn)變。

本研究分析的樣本數(shù)量雖然相對(duì)較少,但樣本來(lái)源于我國(guó)養(yǎng)豬規(guī)模比較集約化的13個(gè)省份,其分子病原學(xué)的檢測(cè)結(jié)果仍可作為我國(guó)部分地區(qū)當(dāng)前PCV2和PCV3流行的參考依據(jù)。在非洲豬瘟防控常態(tài)化的形勢(shì)下,加強(qiáng)PCV2疫苗免疫的同時(shí),加強(qiáng)對(duì)疑似PCV感染豬進(jìn)行分子病原學(xué)檢測(cè)及血清學(xué)監(jiān)測(cè)是當(dāng)下PCV防控和預(yù)警的有效手段。

對(duì)PCV2和PCV3的ORF2編碼的Cap蛋白氨基酸序列進(jìn)行變異位點(diǎn)分析,發(fā)現(xiàn)PCV2的Cap蛋白氨基酸序列在53-91、121-136、169-215氨基酸位點(diǎn)幾個(gè)區(qū)域有較高的變異,同時(shí)存在一些分散的突變位點(diǎn),如R8Y、V30L、T121S、R169S/A、D210E/A等,與前期研究報(bào)道吻合[19],表明Cap蛋白中的氨基酸突變可能與PCV2基因型多樣性的發(fā)生有關(guān)。PCV3的Cap蛋白氨基酸序列比對(duì)分析顯示多個(gè)毒株的氨基酸序列存在相似的突變現(xiàn)象,氨基酸高頻突變位于24、27、77和150位點(diǎn),與近期研究結(jié)果一致[20]。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)PCV3的Cap蛋白氨基酸突變位點(diǎn)突變較少,且較為集中,主要位于1-30區(qū)域,而PCV2的Cap蛋白氨基酸突變位點(diǎn)多而分散。根據(jù)兩者的Cap蛋白氨基酸變異位點(diǎn)的特點(diǎn),推斷PCV2基因型間的重組和突變的概率可能更大而快,PCV3則較小而慢。從氨基酸同源性上比較,推斷二者存在交叉免疫保護(hù)的概率較小或二者間的交叉保護(hù)力很低。不同毒株序列的氨基酸突變位點(diǎn)與毒力差異的相關(guān)性,PCV2與PCV3不同基因亞型之間是否存在基因重組有待進(jìn)一步研究。

有研究表明,桿狀病毒表達(dá)的基于PCV2d的Cap蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生出比傳統(tǒng)病毒疫苗更高的體液免疫和細(xì)胞免疫水平。這種亞單位疫苗可以有效減少自然感染PCV2d的豬的病毒血癥[21]。目前預(yù)防PCV2病毒感染大多用PCV2b Cap蛋白疫苗,根據(jù)以往及2020-2021年我國(guó)部分地區(qū)PCV2和PCV3的分子流行病學(xué)研究結(jié)果,開(kāi)發(fā)出特異性更好的PCV2d高效亞單位疫苗迫在眉睫,而PCV2d亞單位疫苗的研究思路也可以為PCV3疫苗的研發(fā)提供啟示和指導(dǎo)。