劉 壯,何茹月,胡圣偉

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆石河子 832003)

DNA分子擴增與基因測序已成為遺傳學(xué)和分子診斷領(lǐng)域的重要手段[1]。分子診斷應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測和分子標(biāo)記檢測[2],比酶或抗體檢測靈敏度高、靈活性強,通過PCR擴增用微量DNA即可達(dá)到試驗?zāi)康?而樣品基因組DNA的獲取和純化則決定檢測結(jié)果的完整度和準(zhǔn)確性。目前,基因組樣本DNA提取方法主要包括苯酚-氯仿抽提法[3]、試劑盒法[4]、煮沸法[5]、磁珠法[6]等。以大鼠和小鼠的鼠尾及腳趾為試驗材料[7],用苯酚-氯仿抽提法萃取得到鼠尾組織的基因組DNA,但此方法耗時較長且有毒性,長時間威脅人體健康。用試劑盒提取法從所有毛絨干樣本中獲得了高質(zhì)量的DNA[8],但此法成本偏高[9]。煮沸法可以避免耗時和成本高的缺點,但在一定程度上影響DNA純度、濃度和完整度。磁珠法利用磁珠粒子表面化學(xué)物質(zhì)的差異性捕獲和純化核酸,可大批量進行樣本檢測,但依賴大型儀器設(shè)備,受試驗區(qū)域的影響[10]。因此,基于已有的核酸提取方法,開發(fā)一種簡易快速基因組DNA提取方法很重要。

Whatman No.1纖維素濾紙價格低廉、便攜且易于修飾,可以在堿性溶液中幾秒內(nèi)吸附帶負(fù)電荷的DNA,經(jīng)過簡單的洗滌就可直接釋放到擴增反應(yīng)液中[11]。用Whatman No.1濾紙片在30 s內(nèi)可從擬南芥葉片和豬肺中提取并純化出DNA[12]。用常規(guī)定性濾紙作為核酸吸附的載體提取出中藥DNA[13],而對于下游的核酸擴增驗證則與傳統(tǒng)核酸提取法一致。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,基因編輯在生物學(xué)研究中越來越重要[14]。目前對于基因編輯小鼠后代的基因型快速檢測的方法仍存在耗時長、高成本等限制[15]。因此,基于基因編輯型小鼠穩(wěn)定遺傳理論和WhatmanNo.1纖維素濾紙的吸附特性,尋求一種對子代小鼠高效、穩(wěn)定、低創(chuàng)傷的DNA提取方法,為大量基因編輯小鼠后代基因分型提供可行方案。

本文用Whatman No.1纖維素濾紙制備出特定結(jié)構(gòu)的試紙條,以基因野生型和編輯型C57BL/6J小鼠為試驗材料建立紙基法。對比試劑盒提取法和煮沸法,用PCR擴增和測序分析以驗證基因分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。此研究為快速檢測和基因分型提供了重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6只5～6周齡GDF11基因敲除雜合型(GDF 11+/-;2雄4雌)和9只雄性野生型(GDF 11+/+)C57BL/6J小鼠。飼養(yǎng)條件滿足光照/黑暗12 h交替,自由攝食飲水。所有小鼠由石河子大學(xué)動物基因工程實驗室飼養(yǎng)與繁殖,試驗均在石河子大學(xué)動物護理委員會批準(zhǔn)的方案下進行。

1.1.2 主要試劑與儀器 Tris-HCL、氯化鈉(NaCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸鈉(SDS),北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;天根血液基因組提取試劑盒(TIANmp Blood DNA Kit)、Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒、2X SanTaqFast PCR Mix、蛋白酶K,上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品。DNA Marker 2 000,上海天根生化科技有限公司和北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;Whatman No.1濾紙,上海金畔生物科技公司產(chǎn)品。Mastercycler pro梯度PCR儀、高速離心機,Eppendorf公司產(chǎn)品;瓊脂糖凝膠核酸電泳儀,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;凝膠成像儀,Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 紙基法的構(gòu)建 基于文獻[12],改進Whatman No.1纖維素濾紙結(jié)構(gòu)。將Whatman No.1纖維素濾紙裁剪成55 mm×2 mm的長方形紙條,用鑷子夾取紙條一側(cè),將紙條的52 mm浸入液體石蠟中(手柄區(qū)),未浸蠟區(qū)域形成一個6 mm×2 mm的長方形(結(jié)合區(qū)),制備標(biāo)準(zhǔn)試紙條(圖1)。

圖1 紙基法流程圖

通過斷尾采血法收集3只野生型小鼠a、b、c的血液各50 μL,加入200 μL A液(10 mmol/L Tris pH 8.0;15 mmol/L NaCl;10 mmol/L EDTA pH8.0;0.4% SDS;200 μg/mL蛋白酶K)中,放入2顆直徑5 mm的無菌鋼珠,充分劇烈搖晃30 s形成血液裂解液。將試紙條DNA結(jié)合區(qū)反復(fù)浸入血液裂解液3次后放入B液(10 mmol/L Tris pH 8.0;0.1% Tween 20)中洗滌5次,隨后將吸附有小鼠核酸DNA的試紙條放入PCR反應(yīng)體系混合液中,靜置3 s,隨后進行PCR擴增反應(yīng)。用天根血液基因組提取試劑盒,按說明書從上述3只野生型小鼠全血中提取總 DNA,作為紙基法的對照。根據(jù)C57BL/6J小鼠特有的GDF11(GenBank登錄號:NC-000076.7)和MSTN(GenBank登錄號:NC-000067.7)核苷酸序列設(shè)計得到3種引物Gdf11-PMT、Gdf11-KI和MSTN(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2測試3只野生型小鼠的基因型,以驗證該引物的特異性;用以上3種引物,驗證紙基法的穩(wěn)定性和特異性。。

表1 引物序列信息

1.2.2 基因敲除小鼠的繁殖 用F0代1雄(GDF 11+/-)和2雌(GDF 11+/-)的配種模式,對C57BL/6J小鼠進行配種,自然受孕21日后,將F1代小鼠飼養(yǎng)至斷奶4周后,隨機抽取10只F1代小鼠編號為1～10號作為小鼠基因型鑒定的材料來源。

1.2.3 3種DNA提取方法的比較應(yīng)用 試劑盒提取法:將隨機選取的基因敲除型小鼠后代中的10只小鼠,剪取0.2～0.5 cm尾尖組織,剪碎后放于2 mL離心管內(nèi)。用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒說明書提取得到小鼠基因組DNA。

煮沸法:取上述10只小鼠的0.2～0.5 cm尾尖組織,加入200 μL DNA抽提緩沖液(50 mmol/L Tris·HCl pH8.0;10 mmol/L EDTA;0.1% SDS;100 mmol/L NaCl)和10 μL 20 mg/mL 蛋白酶K,混合均勻后在55℃恒溫水浴鍋中消化20 min,100℃煮沸10 min,靜置20 min得到含有小鼠基因組DNA的裂解液。

紙基法:取上述10只小鼠的樣本,根據(jù)1.2.1的方法得到PCR擴增反應(yīng)的模板。

1.2.4 PCR擴增和電泳檢測 根據(jù)NCBI上已公布的C57BL/6J小鼠序列信息和GDF11基因編輯型小鼠構(gòu)建方案(圖2)得到基因型鑒定標(biāo)準(zhǔn),基因片段只有一條大小491 bp或404 bp片段,基因型為純合子(GDF 11-/-)或野生型(GDF 11+/+);基因片段一條大小491 bp,另一條大小404 bp,基因型為(GDF 11+/-)。設(shè)計鑒定基因敲除型小鼠的引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2(表1)。

圖2 基因編輯型小鼠構(gòu)建方案圖

PCR擴增體系:ddH2O 9 μL,5×PCR Mix 10 μL,DNA模板0.5 μL,上、下游引物(10 mmol/L)0.5 μL。PCR擴增條件為:95℃ 3 min;95℃ 20 s,60℃ 20 s,72℃ 40 s,循環(huán)35次;終延伸72℃ 2 min;4℃保溫。PCR擴增反應(yīng)結(jié)束后,使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對5 μL反應(yīng)體系進行電泳,利用凝膠成像儀分析電泳結(jié)果。

1.2.5 測序結(jié)果驗證 用上述10個樣本的瓊脂糖電泳結(jié)果,根據(jù)每個樣本擴增出的大小不同的DNA片段預(yù)測基因敲除型小鼠后代的基因型,隨機選取2個樣本的PCR擴增產(chǎn)物,由上海生工生物工程股份有限公司進行測序分析,驗證依據(jù)電泳條帶大小判斷基因敲除型小鼠后代基因型結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 試紙條檢測方法的構(gòu)建

用試劑盒法作為對照,用紙基法提取a、b、c野生型小鼠血液中的基因組DNA作為模板﹐用Gdf11-PMT、Gdf11-KI和MSTN 3種引物進行特異性PCR進行擴增(圖3)。PCR結(jié)果顯示,用引物Gdf11-PMT穩(wěn)定克隆出315 bp符合預(yù)期的DNA片段(圖3A);用引物Gdf11-KI穩(wěn)定克隆出567 bp符合預(yù)期的DNA片段(圖3B);用引物MSTN穩(wěn)定克隆出671 bp符合預(yù)期的DNA片段(圖3C)。基于紙基法,驗證用于編輯型小鼠基因分型的特異性引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2的PCR擴增,結(jié)果顯示a、b、c樣本未被Gdf11-KO1引物特異性誘導(dǎo)擴增,由Gdf11-KO2引物擴增出404 bp左右的條帶,說明紙基法為PCR擴增提供了基因組DNA模板(圖3D)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;NC.陰性對照;1～3.用紙基法和引物Gdf11-PMT(A)、Gdf11-KI(B)、MSTN(C)、Gdf11-KO1(D)對3個樣本的PCR擴增結(jié)果;4～6.用試劑盒提取法和引物Gdf11-PMT(A)、Gdf11-KI(B)、MSTN(C)、Gdf11-KO1(D)對3個樣本的PCR擴增結(jié)果

2.2 3種DNA提取方法的比較應(yīng)用

通過試劑盒提取法得到1～10號10只基因敲除型小鼠后代基因組DNA,用引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2分別對小鼠的基因組DNA進行PCR擴增鑒定基因型(圖4A),根據(jù)克隆片段的有無和大小表明1、4、6、9號為野生型小鼠,2、3、5、7、8號為基因敲除雜合型小鼠,而10號小鼠為基因敲除純合型小鼠。通過煮沸法得到1～10號10只基因敲除型小鼠后代基因組DNA,利用引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2分別對小鼠的基因組DNA進行PCR擴增進行基因型鑒定(圖4B),根據(jù)PCR結(jié)果說明1、4、6、9號小鼠為野生型小鼠,3、7、8號為基因敲除雜合子小鼠。

A.試劑盒提取法;B.煮沸法;C.紙基法。M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;NC.陰性對照;1～10.用引物Gdf11-KO1分別對1、2、3、4、5、6、7、8、9、10號小鼠的基因組DNA PCR擴增結(jié)果,11～20:用引物Gdf11-KO2分別對1、2、3、4、5、6、7、8、9、10號小鼠的基因組DNA PCR擴增結(jié)果

通過紙基法得到1～10號10只基因敲除型小鼠后代基因組DNA,利用引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2分別對小鼠的基因組DNA進行PCR擴增進行基因型鑒定(圖4C),根據(jù)PCR結(jié)果說明1、4、6、9號為野生型小鼠,2、3、5、7、8號小鼠為基因敲除雜合子小鼠,而10號小鼠為基因敲除純合子小鼠。與試劑盒提取法鑒定結(jié)果一致,與利用煮沸法鑒定結(jié)果存在差異。

2.3 測序驗證結(jié)果

根據(jù)以上3種DNA提取方法的比較應(yīng)用,隨機選取10號小鼠和6號小鼠基因組DNA的PCR擴增產(chǎn)物測序分析,結(jié)果顯示10號小鼠為基因敲除純合子小鼠(GDF 11-/-)(圖5A),6號小鼠為野生型小鼠(GDF 11+/+)(圖5B),試劑盒提取法與紙基法對于基因分型的檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致。

圖5 測序峰圖結(jié)果展示

3 討論

DNA提取是用現(xiàn)代生物技術(shù)解析分子檢測和基因分型的關(guān)鍵。用酚/氯仿法提取DNA時[16],用PCR對綿羊血液布魯氏菌的檢測下限僅為1×106CFU/mL,其影響因素主要是無法有效去除血液中的血紅蛋白等PCR抑制劑。有研究通過Whatman FTA卡片存儲基因組DNA,用低鹽溶液的洗脫后,穩(wěn)定了PCR擴增反應(yīng)[17]。

用紙基法進行HPV DNA的提取極大簡化了臨床宮頸脫落細(xì)胞樣本中HPV DNA的提取步驟[18]。用全自動紙基微流控裝置,通過堿裂解法以及Fusion 5紙片成功提取到血液DNA。本研究用Whatman No.1纖維素試紙條進行小鼠全血內(nèi)基因組DNA的提取,用4種特異性引物,PCR擴增反應(yīng)驗證了該方法的穩(wěn)定性和特異性。對于紙基法中DNA結(jié)合量和洗滌質(zhì)量后期可以通過改變試紙中DNA結(jié)合區(qū)域的大小和洗滌液的體積來微調(diào)提取系統(tǒng),從而達(dá)到核酸定量轉(zhuǎn)移的目的。

根據(jù)基因編輯生物在實驗室中廣泛應(yīng)用的現(xiàn)狀,對于該生物后代基因分型檢測也成為實驗室常備的檢測手段[19]。本文用3種DNA提取法對隨機的10只基因編輯小鼠進行基因分型檢測,紙基法與煮沸法和試劑盒提取法對基因組DNA提取具有更多優(yōu)勢。紙基法和試劑盒提取法鑒定結(jié)果基本完全一致,評判出4只野生型小鼠、5只基因敲除雜合型小鼠和1只基因敲除純合型小鼠。試劑盒提取法保障了動物組織DNA提取的準(zhǔn)確性,滿足分子基因檢測的需求,但其檢測成本大以及試驗條件都阻礙了該方法的大規(guī)模應(yīng)用。煮沸法鑒定結(jié)果存在偏差的原因可能由于煮沸法獲得的DNA不純,存在污染物和抑制劑,提取的DNA質(zhì)量較差,影響PCR擴增反應(yīng)的進行,導(dǎo)致基因型判定出現(xiàn)誤差。測序結(jié)果輔助驗證了紙基法對PCR分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。總之,紙基法表明了該基因組DNA提取系統(tǒng)可以輕松地將基因組DNA從污染物和抑制劑中分離和洗脫出來,為大規(guī)模的對基因編輯小鼠后代進行基因型分類提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

本文用Whatman No.1纖維素濾紙制備得到的試紙條,進行基因組DNA的提取和PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳驗證了該紙基法的穩(wěn)定性和特異性。橫向比較紙基法、試劑盒提取法和煮沸法3種DNA提取法,最后對隨機選取的樣本DNA進行測序分析,驗證了紙基法對與基因敲除小鼠后代基因型測定的準(zhǔn)確性。以上研究表明了一種簡易快速基因組DNA提取方法的建立為分子鑒定和基因分型提供了一種更為快速、便捷、準(zhǔn)確、有效的檢測方法。