馬海云,張玉清,郭潞莎,包世俊

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

馬麝(Moschuschrysogaster,alpine musk deer)亦稱香樟、高山麝,是我國(guó)特有的麝科、麝屬、麝種動(dòng)物,也是我國(guó)一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物,被列入世界自然保護(hù)聯(lián)盟(International Union for Conservation of Nature,IUCN) “瀕?！币吧鷦?dòng)物[1-2]。麝香是雄麝香腺囊的分泌物,是香水工業(yè)中最古老的原料之一,亦是我國(guó)名貴的中藥材,對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)有興奮作用,被用作許多中藥名方如麝香保心丸、六神丸、云南白藥等[3]。迄今為止,很難找到合適的天然或合成物質(zhì)來(lái)替代傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的麝香,因此麝香有極高的經(jīng)濟(jì)與藥用價(jià)值。馬麝在我國(guó)青海、寧夏、甘肅、四川、云南等地均有分布,其主要棲息在裸巖山地的灌木叢和草叢等地,是典型的灌木叢、森林邊緣動(dòng)物[2],由于過(guò)度獵捕和棲息地的破壞,我國(guó)馬麝種群數(shù)量急劇減少。為了保護(hù)我國(guó)獨(dú)特的麝資源,20世紀(jì)90年代初,甘肅興隆山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)建立了第1家馬麝養(yǎng)殖場(chǎng),目前保護(hù)區(qū)馬麝是我國(guó)數(shù)量最大的種群。但多種傳染性疾病的流行嚴(yán)重影響馬麝養(yǎng)殖和繁育。

馬麝病毒性出血癥是急性和高度致死性傳染病,以馬麝心、肝、脾、肺、腎、小腸、腦等組織和器官充血、出血和壞死為特征。通常1歲內(nèi)最常發(fā)病,6月齡左右病死率較高,大多數(shù)病例死于無(wú)癥狀,一些病程稍長(zhǎng)的表現(xiàn)為抑郁,停止進(jìn)食和飲水,并伴有角弓反張等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[4-6]。采集病料研究確定馬麝出血癥的病原為一種杯狀病毒[7],與兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic diease virus,RHDV)的核酸序列高度相似,尤其與RHDV中國(guó)分離株HB株的相似性高達(dá)98.7%,且能夠感染并致死家兔,因此,該病毒曾被命名為馬麝出血癥病毒[8]。為提高對(duì)馬麝出血癥的防控能力,需研制可用于馬麝出血癥有效預(yù)防的疫苗,本文用家兔擴(kuò)增馬麝出血癥病毒的基礎(chǔ)上,收集致死兔肝臟,制備病毒的肝臟組織勻漿上清,并經(jīng)甲醛滅活后用白油佐劑配制馬麝出血癥的組織滅活疫苗,進(jìn)而評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果和保護(hù)效果,為馬麝出血癥的疫苗防控提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 馬麝出血癥病毒(McHDV)毒株由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病學(xué)實(shí)驗(yàn)室從我國(guó)興隆山馬麝繁育基地病死馬麝體內(nèi)分離保存;人“O”型紅細(xì)胞來(lái)源于血站;健康非免疫新西蘭白兔購(gòu)于甘肅省蘭州市某個(gè)體養(yǎng)殖戶。

1.1.2 主要試劑 兔瘟-巴氏桿菌二聯(lián)苗;白油佐劑;甲醛溶液(40%)Biosharp; NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4、葡萄糖、檸檬酸鈉、檸檬酸等化學(xué)試劑,上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司產(chǎn)品;PBS緩沖液:NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、KH2PO41.84 g、Na2HPO40.2 g,蒸餾水定容至100 mL,用pH檢測(cè)儀測(cè)定pH為7.4,取10 mL 10×PBS緩沖液于90 mL蒸餾水中,配制成1×PBS緩沖液,調(diào)用pH至7.2。1% 紅細(xì)胞懸液:吸取1 mL抗凝血于2 mL離心管,1 500 r/min離心10 min,棄去血漿,紅細(xì)胞沉淀中加入1×PBS緩沖液(紅細(xì)胞體積的2倍),輕晃,洗滌紅細(xì)胞(上下輕晃,直至紅細(xì)胞均勻),1 500 r/min離心10 min,棄上清,反復(fù)洗滌多次,直至上清清亮無(wú)色,按照紅細(xì)胞體積1∶100的比例加入1×PBS,配制1%紅細(xì)胞懸液,并置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要儀器 高壓鍋(LDZX-50KBS),上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn);超凈工作臺(tái)(ZHJH-1112),上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn);電子天平,梅特勒-托利多儀器上海有限公司產(chǎn)品;離心機(jī),上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司產(chǎn)品;微型振蕩器(MM-1),臺(tái)州市艾測(cè)儀器有限公司產(chǎn)品;恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制備 ①病料的處理。取實(shí)驗(yàn)室凍存的病料,加10倍體積1×PBS緩沖液制備組織勻漿,反復(fù)凍融3次,10 000 r/min離心10 min,取上清除菌后皮下注射2只健康非免疫新西蘭大白兔,1 mL/只,觀察并記錄試驗(yàn)兔的臨床癥狀和病理變化。無(wú)菌采取死亡兔的肝臟組織,除去脂肪和結(jié)締組織,稱量后充分研磨,與1×PBS緩沖液按1∶10的比例混合后勻漿,反復(fù)凍融3次后10 000 r/min離心15 min,取上清,用0.22 μm除菌過(guò)濾過(guò)濾除菌后分裝備用。②毒種檢驗(yàn)(血凝試驗(yàn))。應(yīng)用血凝試驗(yàn)測(cè)定病毒懸液的效價(jià),試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組,并于96孔V型板上進(jìn)行:1～12孔先加入25 μL 1×PBS緩沖液;取25 μL病毒懸液加入第1孔后倍比稀釋到11孔,從11孔吸棄25 μL,12孔為空白對(duì)照;每孔加入1%紅細(xì)胞懸液25 μL,置4℃ 45 min后判定結(jié)果。③滅活疫苗的制備。將毒種檢驗(yàn)測(cè)定的血凝效價(jià)為8 Log2的病毒懸液作為候選毒株,向處理分裝過(guò)后的病料懸液中加入40%甲醛(使其終濃度為0.4%),置37℃振搖滅活48 h,可4℃保存(未加佐劑組織滅活苗),滅活振搖后的組織懸液與白油佐劑按照1∶1的比例混合均勻后,置于乳化機(jī)乳化30 s,重復(fù)3～4次使之充分乳化。

1.2.2 疫苗檢驗(yàn) ①無(wú)菌檢驗(yàn)。取制得的疫苗,分別在血液瓊脂培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基上劃線,37℃培養(yǎng)48 h,若無(wú)雜菌生成,則該疫苗合格,按照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》附錄進(jìn)行。②滅活苗物理性狀檢驗(yàn)。將滅活疫苗3 000 r/min離心10 min,觀察其分層情況。取少量滅活疫苗滴于蒸餾水表面,觀察疫苗的擴(kuò)散情況。③安全性檢驗(yàn)。取健康非免疫新西蘭大白兔4只,每只皮下接種制得的疫苗4 mL,連續(xù)觀察14 d,分析疫苗的安全性。④免疫效力檢測(cè)——血清抗體水平檢測(cè)。取12只健康非免疫兔,隨機(jī)分為4組,每組3只,試驗(yàn)組分別皮下注射1 mL未加佐劑組織滅活苗、白油佐劑組織滅活苗,對(duì)照組皮下注射1 mL PBS緩沖液,商品苗對(duì)照組皮下注射1 mL商品苗。免疫后0、7、14 d于兔子耳緣靜脈采血,采集的血液放于37℃溫箱30 min后,3 000 r/min離心10 min,上清液即為分離的血清。對(duì)所分離的血清進(jìn)行處理,將所有血清置于56℃水浴鍋中30 min滅活。血凝抑制試驗(yàn),在96孔V型板上1～11孔加入25 μL PBS緩沖液,第12孔加入50 μL PBS緩沖液,將待檢血清加入第1孔開(kāi)始倍比稀釋到11孔棄去,1～11孔加入4單位病毒(4單位病毒的配制:以血凝試驗(yàn)的結(jié)果為依據(jù),抗原的血凝效價(jià)為8 Log2,因此1個(gè)HAU為8 Log2,4個(gè)HAU為6 Log2,即4單位抗原的稀釋倍數(shù)為1∶64),置于微型振蕩器上搖勻,振蕩3 min,37℃溫箱放置30 min,向每孔加入25 μL 1%紅細(xì)胞懸液,振蕩混勻,4℃放置45 min,待PBS對(duì)照孔的紅細(xì)胞完全沉積后觀察并判定結(jié)果。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陽(yáng)性血清、陰性血清和空白對(duì)照。⑤攻毒保護(hù)試驗(yàn)。對(duì)免疫14 d后的各組兔子皮下注射強(qiáng)毒(含1 000 LD50)1 mL,觀察其7 d的狀況,記錄各組兔子的發(fā)病和死亡情況,計(jì)算保護(hù)率。

2 結(jié)果

2.1 滅活疫苗物理性狀及安全性試驗(yàn)結(jié)果

制備的滅活疫苗經(jīng)離心,未出現(xiàn)分層現(xiàn)象,證明乳化充分。經(jīng)血瓊脂培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基培養(yǎng)后,無(wú)雜菌生長(zhǎng)。制備的滅活疫苗物理性狀成乳白色,將疫苗滴于蒸餾水上呈圓形油滴狀,無(wú)分散現(xiàn)象。健康非免疫新西蘭大白兔頸部皮下注射制備的疫苗,觀察14 d,無(wú)不良反應(yīng)和異常表現(xiàn),表明制備的滅活疫苗具有良好的安全性。

2.2 血凝抑制試驗(yàn)與攻毒保護(hù)結(jié)果

第7天未加佐劑組織滅活疫苗組的效價(jià)分別為6 Log2、7 Log2、7 Log2,白油佐劑滅活疫苗組的效價(jià)分別為11 Log2、7 Log2、8 Log2,商品苗組的效價(jià)分別為8 Log2、7 Log2、7 Log2,對(duì)照組均無(wú)效價(jià)。第14 天未加佐劑組織滅活疫苗組的效價(jià)分別為8 Log2、7 Log2、7 Log2,白油佐劑滅活疫苗組的效價(jià)分別為11 Log2、9 Log2、9 Log2,商品苗組的效價(jià)分別為8 Log2、7 Log2、8 Log2,對(duì)照組均無(wú)效價(jià)(表1)。第7天未加佐劑的組織滅活疫苗組全部存活,白油佐劑滅活疫苗組死亡1只,商品苗組全部存活,對(duì)照組全部死亡(表2)。

表1 免疫兔血清第7天、第14天抗體效價(jià)變化

表2 不同免疫劑量對(duì)馬麝病毒的免疫保護(hù)結(jié)果

對(duì)照組在預(yù)計(jì)時(shí)間內(nèi)全部死亡,死前精神沉郁,飲食欲廢絕,死后出現(xiàn)角弓反張現(xiàn)象。剖檢病死兔可見(jiàn)全身出現(xiàn)敗血性變化(圖1),病理剖檢可見(jiàn)“紅氣管”,氣管存在點(diǎn)狀出血、心臟淤血、肺臟出現(xiàn)淤血和大小不等的出血斑點(diǎn)、肝臟質(zhì)脆和淤血、腎臟腫大和淤血很明顯等病理特征,根據(jù)臨床癥狀及剖檢病變特征確定死因是馬麝出血性病毒感染所致。

A～B.對(duì)照組兔心臟,心臟內(nèi)有明顯淤血; C～D.對(duì)照組兔肺臟,明顯充血、淤血;E.對(duì)照組兔氣管,可見(jiàn)點(diǎn)狀出血,切開(kāi)氣管時(shí)有淤血;F.對(duì)照組兔腎臟,存在明顯淤血,相較于正常腎臟較黑;G.對(duì)照組兔肝臟,質(zhì)脆,明顯淤血

3 討論

關(guān)于麝屬動(dòng)物的研究主要是通過(guò)樣線法、樣方法、糞堆計(jì)數(shù)法及重復(fù)法,對(duì)麝類種群空間分布、種群數(shù)量與密度、棲息地的保護(hù)、生存環(huán)境的選擇及適應(yīng)性分析等進(jìn)行調(diào)查、研究和分析,根據(jù)利害因素優(yōu)化馬麝的生存環(huán)境,減少干擾因素[9-13]。馬麝疾病的治療研究較少,李斐然等[14]對(duì)林麝胃腸道(胃腸潰瘍、瘤胃遲緩、便秘)和泌尿道(尿道炎、膀胱結(jié)石)相關(guān)疾病的診治進(jìn)行了探索和完善,為馬麝疾病診治和相關(guān)疫苗的研發(fā)提供一定的參考。馬麝病毒性出血癥發(fā)病急、致死率高,對(duì)馬麝種群的繁育和生存造成嚴(yán)重威脅[4]。本文主要研究馬麝病毒性出血癥滅活疫苗的制備,分為未加佐劑滅活組織疫苗和白油佐劑滅活組織疫苗,陽(yáng)性對(duì)照組為商品疫苗組,陰性對(duì)照組皮下注射1 mL PBS緩沖液。結(jié)果證明疫苗無(wú)菌檢驗(yàn)、物理性狀檢驗(yàn)以及安全性檢驗(yàn)符合要求。試驗(yàn)過(guò)程中分別對(duì)試驗(yàn)兔測(cè)定7 d、14 d的HI,結(jié)果顯示,相較于商品疫苗組,白油佐劑組在7 d、14 d均具有較高的效價(jià),表明該疫苗可以在短時(shí)間產(chǎn)生較高效價(jià),并且維持時(shí)間較長(zhǎng)。未加佐劑組產(chǎn)生效價(jià)時(shí)間較慢,效價(jià)較低,但仍存在免疫效果。攻毒后對(duì)照組在預(yù)計(jì)時(shí)間內(nèi)死亡,而試驗(yàn)組兔存活,白油佐劑組死亡1只。在動(dòng)物攻毒試驗(yàn)中,未加佐劑組保護(hù)率為100%,白油佐劑組保護(hù)率為66.7%,商品疫苗組保護(hù)率為100%?？赡芘c試驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異、身體狀況、免疫耐受及周圍環(huán)境對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的影響等因素有關(guān),本試驗(yàn)中不同劑量免疫家兔時(shí),每組僅用了3只兔子,未達(dá)到小動(dòng)物試驗(yàn)基本樣本數(shù),沒(méi)有進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn),白油佐劑組死亡1只,造成白油佐劑組保護(hù)率降到66.7%。本試驗(yàn)的攻毒保護(hù)結(jié)果說(shuō)明疫苗切實(shí)可行,能夠起到免疫保護(hù)的作用。本試驗(yàn)證明所制備疫苗有潛力應(yīng)用于疫苗生產(chǎn),降低生產(chǎn)成本。同時(shí)也有利于預(yù)防馬麝病毒性出血癥的發(fā)生和提高馬麝的存活率,從而對(duì)馬麝起到一定的保護(hù)作用,并為這一瀕危物種的繁殖提供有力保障。