段 鈺,湯洪寧,項(xiàng)繼忠,吳 飛,馬光旭,杜愛芳,楊 怡*

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,浙江省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310058;2.湖州咩咩羊牧業(yè)有限公司,浙江湖州 313023)

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchuscontortus)寄生于反芻動物皺胃,靠吸食血液為生,可引起宿主貧血、發(fā)育不良,感染嚴(yán)重時(shí)死亡,給畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重影響。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲繁殖能力強(qiáng),感染宿主體內(nèi)可攜帶上萬條蟲,一條雌性成蟲每天可產(chǎn)卵5 000～15 000個(gè)[1]。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在自由生活階段和具有感染性的L3期生存能力強(qiáng),在適宜環(huán)境中能迅速增多,增加了感染率[2]。為了解捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染分布情況,國內(nèi)外進(jìn)行了大量流行病學(xué)調(diào)查。如英國的感染率高達(dá)66%[3],澳大利亞為37.18%[4],瑞典為25%[5],西非部分地區(qū)達(dá)到85%[6],中非盧旺達(dá)地區(qū)為75.7%[7],非洲東北部埃塞俄比亞部分地區(qū)達(dá)到68.75%[8]。我國捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病在東北、西北、內(nèi)蒙古等地多發(fā)。吉林省西北地區(qū)的感染率為34.99%[9],內(nèi)蒙古烏審旗地區(qū)為44.5%[10],赤峰市為82.5%[11],通遼市為80.4%[12],甘肅南部地區(qū)的平均感染率為14.30%[13],其他地區(qū)如福建總體感染率為67.9%[14],湖南岳陽為63.33%[15],貴州雷山為18.18%[16]。

羊感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲后可能導(dǎo)致死亡,因此快速、準(zhǔn)確診斷捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病對實(shí)際生產(chǎn)意義重大。近年來該病的臨床診斷主要依靠糞便蟲卵檢測和死尸臨床剖檢。糞便蟲卵檢測法操作簡單,但蟲卵數(shù)量較少時(shí)易造成漏檢;線蟲混合感染時(shí),因蟲卵形態(tài)較相似,不能確診。臨床剖檢則只能針對死尸,通過挑取皺胃內(nèi)的成蟲進(jìn)行確診。分子診斷技術(shù)檢測速度相對較快、靈敏性高,聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等技術(shù)已廣泛應(yīng)用于寄生蟲檢測中。LAMP相對于其他核酸分子檢測技術(shù),具有試驗(yàn)裝置簡單、耗時(shí)短、結(jié)果判定簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)。LAMP利用Bst(Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶的鏈置換活性在等溫條件下擴(kuò)增DNA,與PCR中使用的聚合酶相比,BstDNA聚合酶對糞便樣品中常見的抑制因子具有更好的耐受性,可以從粗獷樣品中成功擴(kuò)增DNA,最大限度減少DNA的提取步驟[17]。而橫向流動試紙條(lateral flow dipstick,LFD)可以通過對LAMP產(chǎn)物進(jìn)行生物素和熒光素標(biāo)記,與試紙條上包被生物素抗體的檢測線結(jié)合,使結(jié)果可視化,判讀更為方便,更具有特異性。

本研究針對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ(mitochondrial cytochrome oxidase subunit Ⅰ,mt-COⅠ)基因的保守區(qū)段設(shè)計(jì)1組引物和1條探針,將LAMP技術(shù)與LFD技術(shù)有機(jī)結(jié)合并優(yōu)化,建立了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的 LAMP-LFD檢測方法,旨在為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的快速鑒別診斷提供新選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲株及樣品 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵及成蟲由浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院寄生蟲研究室保存;夏伯特線蟲成蟲、奧斯特線蟲成蟲、毛首線蟲成蟲由四川省畜牧科學(xué)研究院惠贈。50份湖羊糞便樣品采自湖州咩咩羊牧業(yè)有限公司。

1.1.2 主要試劑 血液/細(xì)胞/組織DNA基因組提取試劑盒(DP304),天根生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品;Fluorescent Dye(FD)、10×LAMP buffer、BstⅡ DNA聚合酶、100 mmol/L MgSO4,NEB(北京)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;甜菜堿,Sigma(美國)公司產(chǎn)品;10 mmol/L dNTP Mix,生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 水浴鍋,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品;NanoDrop超微量分光光度計(jì),賽默飛世爾(美國)公司產(chǎn)品;恒溫金屬浴干式恒溫器,大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司產(chǎn)品;核酸電泳儀,北京六一科技有限公司產(chǎn)品;凝膠成像儀,杭州亞旭科技有限公司產(chǎn)品;T100TMThermalCycler、CFX96TMReal-Time System,Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 用北京天根公司生產(chǎn)的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)提取捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、夏伯特線蟲、奧斯特線蟲、毛首線蟲基因組DNA,按說明書操作。提取完成測定DNA濃度,保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與篩選 從GenBank中獲得捻轉(zhuǎn)血矛線蟲mt-COⅠ基因序列(登錄號:LS997568),針對其保守片段,根據(jù)LAMP引物的設(shè)計(jì)原則,用Primer ExplorerV5設(shè)計(jì)1組引物,每組包括2條外引物F3和B3,2條內(nèi)引物FIP和BIP。其中,BIP的5′端用生物素標(biāo)記。同時(shí)設(shè)計(jì)合成一條5′端標(biāo)記6-FAM的特異性探針。引物和探針均由上海生工股份有限公司合成(表1)。

表1 mt-COⅠ引物和探針

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化

1.2.3.1 最佳反應(yīng)溫度的確定 按下列體系加樣:2.5 μL 10×LAMP buffer,2.5 μL dNTP Mix(10 mmol/L),1.0 μLBstⅡ DNA聚合酶(8 U),0.75 μL MgSO4(100 mmol/L),2.0 μL 甜菜堿(5 mol/L),FIP/BIP(10 μmol/L)各4.0 μL,F3/B3(10 μmol/L)各0.5 μL,1.0 μL DNA模板,0.5 μL FD,ddH2O補(bǔ)至25 μL。將以上混合物分別于61、62、63、64、65、66℃反應(yīng)1 h,通過CFX96TMreal-time system實(shí)時(shí)熒光曲線出峰時(shí)間和峰值高度判定結(jié)果。

1.2.3.2 最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 保持體系中其他成分不變,設(shè)置多組陰性對照,判斷陰性組中非特異性擴(kuò)增的出峰時(shí)間點(diǎn),以此確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.3.3 Mg2+最佳反應(yīng)濃度的確定 保持體系中其他成分不變,分別加入MgSO4使其終濃度為2、4、6、8、10 mmol/L,同時(shí)設(shè)置陰性對照。最佳溫度下反應(yīng)1 h,通過CFX96TMreal-time system判定結(jié)果。

1.2.3.4 dNTP最佳反應(yīng)濃度的確定 保持體系中其他成分不變,分別加入dNTP使其終濃度為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L。通過CFX96TMReal-Time System判定結(jié)果。

1.2.4 LAMP-LFD檢測方法的建立 基于優(yōu)化后的LAMP體系,將LAMP產(chǎn)物與20 pmoL帶有FAM標(biāo)簽的探針于原條件下雜交5 min,取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物加入190 μL PBS溶液進(jìn)行LFD檢測。同時(shí)設(shè)置實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物分別通過CFX96TMreal-time system和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 LAMP、LAMP-LFD方法的特異性試驗(yàn) 分別以夏伯特線蟲、奧斯特線蟲、毛首線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲DNA為模板,進(jìn)行LAMP-LFD檢測,同時(shí)設(shè)置實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物分別通過CFX96TMreal-time system和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 LAMP、LAMP-LFD靈敏度試驗(yàn) 將捻轉(zhuǎn)血矛線蟲基因組DNA分別稀釋成10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL,進(jìn)行LAMP-LFD檢測,同時(shí)設(shè)置實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物分別通過CFX96TMReal-Time System和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.7 臨床樣品的檢測 將采集的50份臨床樣品提取DNA,分別進(jìn)行LAMP-LFD試紙條檢測和糞便蟲卵鏡檢,使用SPSS Statistics v.23.0分析比對兩種方法的檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 LAMP體系的優(yōu)化

當(dāng)反應(yīng)溫度為63℃時(shí)擴(kuò)增曲線出峰較早,且峰值最高(圖1A),因此本LAMP反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)溫度為63℃。設(shè)置多組陰性對照,經(jīng)過多次重復(fù)LAMP擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)陰性組中非特異性擴(kuò)增的出峰時(shí)間點(diǎn)為110 cycles即55 min(圖1B),因此本LAMP反應(yīng)體系的陽性判斷時(shí)間點(diǎn)為55 min內(nèi)。對Mg2+、dNTP的反應(yīng)濃度進(jìn)行優(yōu)化(圖1C和圖1D),Mg2+最佳反應(yīng)濃度為4 mmol/L,dNTP最佳反應(yīng)濃度為1.0 mmol/L。

A.最佳反應(yīng)溫度,1～6.63℃、61℃、62℃、64℃、65℃、66℃;7～12.陰性對照;B.最佳反應(yīng)時(shí)間,1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲;2～5.陰性對照;C.Mg2+最佳反應(yīng)濃度,1～5.4、6、8、10、2 mmol/L;6.陰性對照;D.dNTP最佳反應(yīng)濃度,1～5.1.0、1.2、0.8、0.6、0.4 mmol/L;6.陰性對照

優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系為:2.5 μL 10×LAMP buffer,2.5 μL dNTP Mix(10 mmol/L),1.0 μLBstⅡ DNA聚合酶(8 U),0.5 μL MgSO4(100 mmol/L),2.0 μL甜菜堿(5 mol/L),FIP/BIP(10 μmol/L)各4.0 μL,F3/B3(10 μmol/L)各0.5 μL,1.0 μL DNA模板,ddH2O補(bǔ)至25 μL。LAMP反應(yīng)的最佳溫度為63℃,最佳反應(yīng)時(shí)間為55 min。

2.2 LAMP-LFD方法的建立

陽性模板的LAMP-LFD檢測結(jié)果為質(zhì)控線和檢測線均顯色,陰性對照僅出現(xiàn)一條藍(lán)色質(zhì)控線(圖2C),與實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測結(jié)果(圖2A)以及瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(圖2B)相符合,表明LAMP-LFD檢測方法可行。

A.LAMP擴(kuò)增曲線;B.LAMP產(chǎn)物電泳圖;C.LAMP-LFD檢測結(jié)果;M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 100;1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲;2.陰性對照

A.LAMP擴(kuò)增曲線;B.LAMP產(chǎn)物電泳圖;C.LAMP-LFD檢測結(jié)果;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 100;1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲;2.綿羊夏伯特線蟲;3.環(huán)紋奧斯特線蟲;4.毛首線蟲;5.陰性對照

A.LAMP擴(kuò)增曲線;B.LAMP產(chǎn)物電泳圖;C.LAMP-LFD檢測結(jié)果;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 100;1～7.10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg;8.陰性對照

2.3 LAMP、LAMP-LFD方法的特異性試驗(yàn)

在同一條件下,分別以夏伯特線蟲、奧斯特線蟲、毛首線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲DNA為模板,進(jìn)行LAMP以及LAMP-LFD檢測(圖3),除捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的DNA為模板檢出陽性外,其他均為陰性。

2.4 LAMP、LAMP-LFD靈敏度試驗(yàn)

結(jié)果顯示,建立的LAMP方法,實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線最低可以檢測到100 fg(圖4A),2%瓊脂糖凝膠電泳最低檢測量為1 pg(圖4B),LAMP-LFD能檢到捻轉(zhuǎn)血矛線蟲DNA的最低量為100 fg(圖4C)。

2.5 臨床樣本的檢測

對50份糞便樣品進(jìn)行顯微鏡檢測陽性率為24%(12/50),LAMP-LFD檢測陽性率為20%(10/50),與糞便蟲卵檢測法的符合率為96%(48/50),Kappa值為0.884(P=0.001),說明兩種方法檢測結(jié)果一致性較高。

3 討論

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的檢測方法有病原學(xué)檢測、免疫學(xué)及分子生物學(xué)方法等。病原學(xué)檢測方法如常見的糞便蟲卵鏡檢及凝集素?zé)晒鈽?biāo)記技術(shù)[18],既耗時(shí)又不準(zhǔn)確,不適合臨床檢測大量糞便樣本。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的免疫學(xué)診斷方法以抗體檢測為主。通過研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的排泄分泌蛋白ES24,建立了血清IgG ELISA檢測方法[19];用捻轉(zhuǎn)血矛線蟲復(fù)合診斷抗原制備的膠體金試紙條使用較方便[20]。這些方法無法區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染。分子學(xué)診斷技術(shù)近年來得到廣泛的應(yīng)用,如 PCR 技術(shù)可有效解決相似寄生蟲蟲卵的鑒別問題[21],RT-qPCR推動了寄生線蟲發(fā)育各個(gè)階段診斷方法的發(fā)展且能對蟲卵進(jìn)行定量[22],但這兩種方法需要昂貴的設(shè)備,常用于實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。

相比于PCR和qPCR技術(shù),LAMP技術(shù)所需試驗(yàn)裝置簡單、操作更為便捷,已被廣泛用于檢測病毒、細(xì)菌和寄生蟲[23]。犬貓剛地弓形蟲的LAMP-LFD檢測方法,靈敏度達(dá)到1 fg[24]。針對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲核糖體DNA的ITS-2序列建立了LAMP方法,產(chǎn)物分別用凝膠電泳法和SYBR Green Ⅰ染料目測法檢測,靈敏度為1 pg[25]。ITS-2因其在種間高度特異,常被用作診斷靶標(biāo)來檢測目標(biāo)物種,其他基因如28S rRNA、COⅠ和COⅡ等也常用于鑒別反芻動物胃腸道內(nèi)線蟲[26-28]。有研究基于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲mt-COⅠ 基因建立了一種 SYBR Green qPCR 方法,用于檢測和定量捻轉(zhuǎn)血矛線蟲,具有高度的特異性和敏感性[29],能夠區(qū)分出捻轉(zhuǎn)血矛線蟲和柏氏血矛線蟲。本研究基于mt-COⅠ基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物,建立捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的LAMP-LFD檢測,靈敏度達(dá)到100 fg,相較于傳統(tǒng)PCR法高出103倍[30],相較于楊新等建立的LAMP法高出10倍[25]。

LAMP反應(yīng)產(chǎn)物檢測方法有多種,包括熒光曲線法、瓊脂糖電泳法、染料顯色法、LFD法等。本研究同時(shí)用幾種方法對LAMP產(chǎn)物進(jìn)行檢測,瓊脂糖電泳法需要用到電泳儀、凝膠成像儀,耗費(fèi)時(shí)間長,在臨床應(yīng)用中推廣意義不大;染料法如SYBR Green Ⅰ染料、羥基萘酚藍(lán)(HNB)染料、鈣黃綠素染料,在微量擴(kuò)增時(shí)肉眼難以辨別輕微的顏色變化。本研究將LAMP與LFD試紙條相結(jié)合,結(jié)果判讀更方便、準(zhǔn)確。相比前兩種檢測方法,LFD特異性更高,靈敏度也更高。

本研究以mt-COⅠ基因保守區(qū)段為靶標(biāo)設(shè)計(jì)引物及探針,建立了一種捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的LAMP-LFD檢測方法。經(jīng)檢驗(yàn),本研究建立的LAMP-LFD方法對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲基因組DNA的最低檢測限為100 fg,與奧斯特線蟲、夏伯特線蟲、毛首線蟲基因組DNA不發(fā)生交叉反應(yīng)。LAMP-LFD方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便、結(jié)果可視化的優(yōu)點(diǎn),有望為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的臨床防控提供新的技術(shù)支撐。