林彥星,翁巧玉,阮周曦,吳 江,黃超華,金 業(yè),陳 鵬,張彩虹,楊俊興,曹琛福,史衛(wèi)軍,劉建利,花群義*

(1.深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,廣東深圳 518045;2.湖南普簡生物科技有限公司,湖南長沙 410013;3.深圳市心月生物科技有限公司,廣東深圳 518000)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)感染引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。不同日齡的家豬、野豬都能感染。ASF被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)列為必須通報(bào)的動(dòng)物傳染病[2]。我國《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》、《進(jìn)境動(dòng)物檢疫疫病名錄》都?xì)w為一類動(dòng)物疫病[3-4]。2018年8月,我國遼寧省沈陽市發(fā)現(xiàn)國內(nèi)首例非洲豬瘟,病毒基因序列分析與俄羅斯和東歐流行的格魯吉亞毒株(Georgia 2007)屬于同一進(jìn)化分支,為基因Ⅱ型[5-6]。ASFV粒子呈20面體,有囊膜,基因組為單分子線性雙鏈DNA,基因組長度約為170 kb～194 kb(不同毒株間有差異),包含151～167個(gè)開放閱讀框,編碼多種結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白[8]。由于ASFV結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,基因組編碼的100多種蛋白中有一半蛋白功能未知,且感染后宿主免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確,使非洲豬瘟疫苗研制困難重重。由于ASFV感染第1周就能產(chǎn)生抗體,且持續(xù)時(shí)間長,尤其是對亞急性和慢性病例[2,7]?？贵w檢測對非洲豬瘟疫情監(jiān)測和防控具有重要意義。ASFV B646L基因編碼的p72蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白。p72蛋白主要在病毒感染晚期表達(dá),位于病毒衣殼的表面,是該病毒的保守蛋白,具有良好的免疫原性,穩(wěn)定性強(qiáng),可作為ASFV血清學(xué)檢測的主要診斷抗原[8-12]。本研究通過基因工程技術(shù)表達(dá)p72重組蛋白作為包被抗原,以HRP標(biāo)記的p72特異性單克隆抗體作為酶標(biāo)單抗,建立了非洲豬瘟阻斷ELISA抗體檢測方法,可用于大量樣品抗體的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、單克隆抗體及血清 ASFV-P72原核表達(dá)菌株(pGEX-ASFV-P72)和p72特異性單克隆細(xì)胞株(5C11株)由深圳海關(guān)動(dòng)植檢中心制備和保存。非洲豬瘟病毒陽性血清,中國獸藥監(jiān)察所產(chǎn)品;豬流行性腹瀉病毒(PEDV)陽性血清、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)陽性血清、豬瘟病毒(CSFV)陽性血清、偽狂犬病病毒(PRV)陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)陽性血清和大腸埃希氏菌BL21(DE3)陽性豬血清由深圳海關(guān)動(dòng)植檢中心保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡SPF級Balb/c雌鼠,購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 主要試劑 辣根過氧化物酶(HRP)、牛血清白蛋白(BSA),sigma公司產(chǎn)品;LB液體培養(yǎng)基、TMB顯色液,生工生物工程(上海)有限公司產(chǎn)品;protein Marker(10～180 ku),北京全式金生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品;蛋白濃度測定試劑盒(pierce BCA protein assay kit)、PierceTM無蛋白封閉液(protein-free blocking buffer),Thermo公司產(chǎn)品;蛋白純化試劑盒(Ni-NTA fast start kit),QIAGEN公司產(chǎn)品;非洲豬瘟阻斷ELISA抗體檢測試劑盒,ID.Vet公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 超聲波勻質(zhì)器(UP400S),德國Heilscher公司產(chǎn)品;臺(tái)式高速離心機(jī)(Centrifuge 5415 R),德國Eppendorf公司;Power Pac HC電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)印槽,美國Bio-rad公司產(chǎn)品。洗板機(jī)(ELx50),美國Bio-Tek公司產(chǎn)品;酶標(biāo)儀(W-100),微思行(北京)科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 ASFV P72重組抗原表達(dá)與純化 將pGEX-ASFV-P72表達(dá)菌株劃線接種LB培養(yǎng)基平板,挑取單菌落接種于含氨芐青霉素(Amp+)的液體LB培養(yǎng)基中,37℃振搖培養(yǎng)過夜,菌液PCR鑒定后,按照1∶100的比例接入新配制的Amp+LB培養(yǎng)基,待細(xì)菌生長到對數(shù)期時(shí)(約3 h),加入終濃度為1 mmol/L IPTG,37℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h,離心收集菌體沉淀,加入細(xì)菌裂解液重懸沉淀,于冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎,12 000 r/min離心30 min,取上清液SDS-PAGE分析,用Ni-NTA Fast Start Kit進(jìn)行純化,Western blot法分析純化重組蛋白的抗原性。

1.2.2 單克隆抗體的純化和HRP標(biāo)記 將本實(shí)驗(yàn)室保存的雜交瘤細(xì)胞株5C11株復(fù)蘇擴(kuò)大培養(yǎng)后,腹腔注射經(jīng)降植烷致敏的6～8周齡健康Balb/c小鼠,接種約1周后收集小鼠腹水,采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化單克隆抗體[13],SDS-PAGE電泳測定純度。采用過碘酸鈉法對單克隆抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記,用間接ELISA方法檢測HRP標(biāo)記單抗5C11-IgG-HRP的效價(jià)。

1.2.3 阻斷ELISA反應(yīng)條件的確定 以p72重組蛋白作為包被抗原,采用方陣法確定阻斷ELISA反應(yīng)條件。將p72重組蛋白用碳酸鹽緩沖液(0.05 mol/L, pH9.6)按1∶500、1∶1 500、1∶2 500、1∶3 500、1∶4 500進(jìn)行稀釋,包被96孔板后4℃過夜;用洗滌液PBST(含0.5 mL/L Tween-20、0.01 mol/L, pH7.4 的PBS)洗板3次,然后用3% BSA、5%脫脂奶粉和無蛋白封閉液,37℃封閉2 h;洗板3次后,分別加入1∶2、1∶5、1∶10、1∶20稀釋的ASFV陽性血清,100 μL/孔,37℃濕盒孵育1 h;洗板3次,加入1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000稀釋的酶標(biāo)單抗5C11-IgG-HRP,37℃作用45 min;洗板5次后加TMB底物液,室溫作用10 min左右,加入終止液,酶標(biāo)儀測定OD450nm值。通過一系列試驗(yàn)確定p72重組蛋白最佳包被濃度和酶標(biāo)單抗5C11-IgG-HRP最佳工作濃度,以及封閉液的選擇,血清稀釋比例等。

PI=

1.2.5 特異性試驗(yàn) 用制備的3批非洲豬瘟阻斷ELISA抗體檢測試劑盒對CSFV陽性血清、PRV陽性血清、PRRSV陽性血清、PEDV陽性血清、TGEV陽性血清、大腸埃希氏菌BL21(DE3)陽性豬血清、ASFV陽性血清和ASFV陰性血清進(jìn)行檢測。根據(jù)阻斷率臨界值判斷該方法的特異性。

1.2.6 敏感性試驗(yàn) 用制備的阻斷ELISA抗體檢測試劑盒分別對不同稀釋度(1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560)的ASFV強(qiáng)陽性血清、陽性血清和弱陽性血清進(jìn)行檢測,每份樣品做3個(gè)平行樣,評估所建立方法的敏感性。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 對制備的試劑盒進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)。檢測樣品為5份已知的ASFV陽性血清和5份陰性血清,每份樣品進(jìn)行5次重復(fù)檢測,對測得的OD450 nm值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性。

1.2.8 符合率試驗(yàn) 應(yīng)用本試驗(yàn)建立的阻斷ELISA方法與商品化非洲豬瘟阻斷ELISA抗體檢測試劑盒分別對2019年廣東省動(dòng)物疫病監(jiān)測計(jì)劃項(xiàng)目送檢的174份血清樣品進(jìn)行檢測,計(jì)算兩者的符合率。

2 結(jié)果

2.1 p72重組蛋白制備與純化

pGEX-ASFV-p72表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),4 000 r/min 4℃離心20 min收集菌體,加入細(xì)菌裂解液重懸并超聲破碎,離心后上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖1),p72重組蛋白在約71 ku位置上出現(xiàn)特異性條帶,而空質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)菌在上述位置未出現(xiàn)條帶,結(jié)果與預(yù)期一致。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA Fast Start Kit試劑盒純化,Western blot分析,結(jié)果顯示該重組蛋白能與ASFV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖2)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.空載體蛋白;2.純化的重組蛋白

2.2 單克隆抗體腹水的制備、純化

用辛酸-硫酸銨沉淀法純化單克隆抗體,進(jìn)行蛋白濃度測定,結(jié)果蛋白濃度約為9.8 mg/mL。經(jīng)SDS-PAGE電泳,純化單抗出現(xiàn)兩條特異性條帶,其中重鏈約55 ku,輕鏈約25 ku,純度為95%(圖3)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.腹水;2.純化的單抗

2.3 酶標(biāo)單抗5C11-IgG-HRP效價(jià)測定

用過碘酸鈉法對單抗5C11-IgG進(jìn)行HRP標(biāo)記,用間接ELISA方法檢測酶標(biāo)單抗5C11-IgG-HRP效價(jià)。當(dāng)陽性血清OD450nm值/陰性血清OD450nm值>2.1時(shí),判定為陽性,其所對應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)作為該酶標(biāo)單抗的抗體效價(jià),結(jié)果酶標(biāo)單抗的效價(jià)為1∶10 000(表1),滿足后續(xù)試驗(yàn)需要。

表1 酶標(biāo)單抗效價(jià)測定結(jié)果

2.4 阻斷ELISA最佳反應(yīng)條件

經(jīng)方陣法進(jìn)行阻斷ELISA,確定抗原包被濃度為0.625 μg/mL,4℃包被過夜;3% BSA 37℃封閉2 h;加入1∶10稀釋的待檢血清,100 μL/孔,置37℃孵育1 h,洗板后加入1∶6 000稀釋的酶標(biāo)抗體后置37℃孵育45 min,加入底物液后置室溫避光顯色10 min,最后加入終止液,測定OD450nm值,計(jì)算樣品的阻斷率。在此條件下,陽性血清阻斷率相對較高,阻斷效果最好。

2.5 臨界值的確定

2.6 特異性試驗(yàn)

用制備的3批阻斷ELISA抗體檢測試劑盒對CSFV、PRV、PRRSV、PEDV、TGEV、大腸埃希氏菌BL21(DE3)、ASFV等抗體陽性血清和ASFV抗體陰性血清進(jìn)行檢測,除了ASFV抗體陽性血清的阻斷率高于50.12%,判為抗體陽性。與其他對照血清和陰性血清無交叉反應(yīng),阻斷率均小于50%,表明該方法特異性良好(表2)。

表2 特異性檢測結(jié)果

2.6 敏感性試驗(yàn)

用制備的阻斷ELISA抗體檢測試劑盒分別對不同稀釋度的ASFV強(qiáng)陽性血清、陽性血清和弱陽性血清進(jìn)行檢測,分析檢出陽性的最低稀釋度。結(jié)果表明,ASFV強(qiáng)陽性血清的最低稀釋度為1∶640,陽性血清的最低稀釋度為1∶40,弱陽性血清的最低稀釋度為1∶10(圖4)。

圖4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

用制備的試劑盒對5份ASFV陰性血清和5份陽性血清進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn),每份樣品做5次重復(fù)檢測(圖5)。5份陰性血清的檢測結(jié)果均為陰性,5份陽性血清的檢測結(jié)果均為抗體陽性,對測得的批內(nèi)和批間OD450 nm值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,批內(nèi)CV為0.91%～3.41%,批間CV為1.31%～4.97%,CV均小于5%,具有良好的可重復(fù)性(表3)。

表3 批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

圖5 重復(fù)性試驗(yàn)

2.8 符合率試驗(yàn)

用本研究建立的非洲豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測方法與進(jìn)口的非洲豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒(ID.Vet)同時(shí)對174份血清樣品進(jìn)行比對檢測(表4),兩種方法的陽性符合率為100%,陰性符合率為96.45%,總符合率為96.55%。

表4 符合性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

疫苗免疫接種是預(yù)防和控制動(dòng)物傳染病最直接有效的措施,目前尚無商業(yè)化的ASF疫苗,感染低毒或中等毒力ASFV能產(chǎn)生抗體,可通過抗體存在與否作為診斷參考依據(jù)。最常用的血清學(xué)試驗(yàn)是ELISA,可檢出感染低、中等毒力ASFV豬體內(nèi)的抗體。除了基于p72蛋白建立的ELISA抗體檢測方法,同樣具有較高免疫原性的p30、p54蛋白也常作為檢測抗原[14-17]。阻斷ELISA是一種基于抗原和抗體之間的競爭性結(jié)合反應(yīng),包被抗原和酶標(biāo)抗體的使用對于阻斷ELISA的準(zhǔn)確性和靈敏度至關(guān)重要。本試驗(yàn)用原核表達(dá)的ASFV p72重組蛋白作為固定在96孔板上的包被抗原。反應(yīng)孔加入待檢血清后,如待檢血清中存在p72蛋白特異性抗體,就會(huì)與包被抗原發(fā)生反應(yīng),從而阻止下一步加入的HRP標(biāo)記的特異性單克隆抗體與包被抗原結(jié)合,加入底物顯色后通過酶標(biāo)儀測定OD450 nm值、計(jì)算阻斷率值來判定試驗(yàn)結(jié)果。阻斷ELISA與間接ELISA相同點(diǎn)都是將抗原包被于96孔板上檢測抗體,不同的是阻斷ELISA中酶標(biāo)抗體是與包被抗原結(jié)合,而間接ELISA中酶標(biāo)抗體是二抗,與待檢抗體結(jié)合。通常情況下,間接ELISA的敏感性高于阻斷ELISA,但阻斷ELISA的特異性更強(qiáng),能有效減少非特異性反應(yīng)和假陽性結(jié)果。

本研究所建立的阻斷ELISA檢測方法經(jīng)過優(yōu)化,確定阻斷率臨界值為50.12%,試驗(yàn)過程中所有已知ASFV抗體陽性血清的阻斷率均高于50.12%,其他對照血清和陰性血清的阻斷率均小于50.12%。試驗(yàn)結(jié)果顯示本方法對ASFV強(qiáng)陽性血清的最低稀釋度為1∶640,陽性血清的最低稀釋度為1∶40,弱陽性血清的最低稀釋度為1∶10。批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于5%,方法穩(wěn)定,具有良好的重復(fù)性?？傮w而言,本方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高以及適合大量樣品快速檢測等優(yōu)點(diǎn),為非洲豬瘟病毒抗體的監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查提供一種技術(shù)手段。