鄧可輝,王修武,郭智軒,韓淑杰,孫守湖,賀東生*

(1.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室肇慶分中心,廣東肇慶 526238;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510640)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)可引起豬高病死率,為烈性接觸性傳染病,其病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),也稱為豬藍(lán)耳病病毒。PRRSV為單股正鏈RNA病毒,自2018年歸屬于動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)、β-動(dòng)脈炎病毒屬(Betaarterivirus)[1]。PRRSV基因組全長約15000 nt,包含10個(gè)開放閱讀框(open reading frames,ORFs),分別為ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b,ORF3～ORF7及ORF5a。PRRSV全基因組編碼11種非結(jié)構(gòu)蛋白、6種結(jié)構(gòu)蛋白[2],其中GP5蛋白具有很高變異性,同時(shí)GP3和GP4重疊區(qū)域缺失在PRRSV-1中較為常見。

根據(jù)國際病毒分類委員會(huì)(International committee on taxonomy of viruses,ICTV)對(duì)動(dòng)脈炎病毒科最新的歸納總結(jié),顯示PRRSV已經(jīng)被定義為兩種不同的病原,分別以Lelystad virus(LV)為代表的PRRSV-1(Betaarterivirussuid1)和以VR-2332為代表的PRRSV-2(Betaarterivirussuid2)[3],這兩種病原引起的疾病癥狀相似,但抗原性差異較大,全基因組核苷酸同源性約60%,且致病性差異較大。國內(nèi)首株P(guān)RRSV-1在2006年分離,隨后相繼分離出多株P(guān)RRSV-1毒株[4],目前在我國流行的大多為PRRSV-2,對(duì)PRRSV-1的深入研究較少。

本研究從2022年廣東省某規(guī)?；i場流產(chǎn)母豬病料中檢測到PRRSV-1,并分離1株P(guān)RRSV-1毒株,命名為GD2022株,對(duì)其全基因組測序、遺傳進(jìn)化及重組分析,進(jìn)一步了解PRRSV-1毒株在我國的流行和變異情況,豐富了我國PRRSV-1的研究資料,為PRRSV-1的深入研究及防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和病毒 2022年12月,華南地區(qū)某2 000頭母豬場疑似PRRSV感染,母豬出現(xiàn)繁殖障礙問題持續(xù)4個(gè)月,發(fā)病豬場曾接種過PRRSV-2滅活苗,但無PRRSV-2弱毒苗的接種史,母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙癥狀,發(fā)病率約40%,保育豬出現(xiàn)被毛粗亂和呼吸道癥狀,整體病死和淘汰約50%。無菌采集發(fā)病豬肺臟、淋巴結(jié)、血清進(jìn)行疫病檢測,置-80℃冰箱備用。PRRSV-1毒株GDEU2018由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)傳染病室保存。

1.1.2 細(xì)胞和主要試劑 豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)和Marc-145細(xì)胞由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病教研室保存;HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit (Dye Plus)酶、高保真酶、5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit、HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)、DH5α感受態(tài)、DNA純化試劑盒,南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品;質(zhì)粒小量提取試劑盒,廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司產(chǎn)品;RNAfast200總RNA極速抽提試劑盒,上海飛捷生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;PRRSV N蛋白單抗,千尋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 高速冷凍離心機(jī),Eppendorf公司產(chǎn)品;倒置顯微鏡,奧林巴斯(中國)有限公司產(chǎn)品;倒置熒光顯微鏡、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱,Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng),上海天能科技有限公司產(chǎn)品;PCR儀,Bio-Rad公司產(chǎn)品;透射電子顯微鏡,HITACHI公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料處理 收集的病料(肺臟或血清)加入無菌PBS緩沖液稀釋,低溫充分研磨,在-80℃反復(fù)凍融3次,4℃、14 000 r/min離心10 min,取上清液用0.22 μm針頭過濾器濾菌,置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank所收錄的PRRSV-1和PRRSV-2代表毒株基因序列(參考毒株:VR2332,GenBank登錄號(hào):U87392;LV,GenBank登錄號(hào):M96262)設(shè)計(jì)2對(duì)檢測引物。根據(jù)GenBank中收錄的國內(nèi)PRRSV-1全基因序列,比對(duì)后選擇相對(duì)保守區(qū)域進(jìn)行全基因片段擴(kuò)增引物設(shè)計(jì),共設(shè)計(jì)10對(duì)擴(kuò)增PRRSV全基因引物(參考毒株:GZ11-G1,GenBank登錄號(hào):KF001144.1),引物序列均由北京擎科生物科技有限公司廣州分公司合成(純化方式:OPC)(表1),表1中1～10為全基因引物,11為PRRSV-1鑒定引物,12為PRRSV-2鑒定引物。

表1 引物序列信息

1.2.3 病料檢測 參照商品化核酸提取試劑盒說明書對(duì)處理好的樣品進(jìn)行病毒核酸提取,用表1鑒定引物進(jìn)行RT-PCR,所得產(chǎn)物通過1%瓊脂糖核酸電泳進(jìn)行鑒定。檢測陽性的核酸,用HiScript Ⅲ cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,置于-20℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 病原分離 取陽性樣品按照病料與培養(yǎng)基1∶10分別接種于PAMs和Marc-145細(xì)胞,同時(shí)設(shè)2組陰性對(duì)照組,在體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、37℃溫箱中孵育2 h。棄上清更換維持液,體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、37℃溫箱中培養(yǎng)5～7 d后收毒,反復(fù)凍融3次,盲傳3～5代,期間若有典型細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE)出現(xiàn),拍照記錄結(jié)果,并進(jìn)行RT-PCR檢測。

1.2.5 分離株間接免疫熒光鑒定 將第10代含病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液上清接種PAMs,同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照,當(dāng)CPE達(dá)到80%以上時(shí)用4%多聚甲醛室溫固定15 min,然后加入0.3%曲拉通室溫作用30 min,再用50 mL/L BSA室溫封閉1 h,與稀釋1 000倍的PRRSV N蛋白單克隆抗體4℃作用10 h,用稀釋1 000倍的山羊抗鼠IgG在37℃避光作用1 h,最后加入DAPI遮光作用5 min,用倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.6 分離株病毒滴度測定 用鋪滿單層PAMs的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行病毒滴度測定。將在PAMs上傳代的第10代病毒,用含5% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基10倍倍比稀釋,取10-1～10-10病毒液分別接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。每個(gè)稀釋度接種8孔,每孔100 μL。同時(shí)設(shè)8孔陰性對(duì)照,每孔再補(bǔ)加100 μL維持培養(yǎng)基。置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng),每日觀察細(xì)胞病變(CPE),連續(xù)觀察4～5 d,記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)。采用Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.2.7 病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 將接毒后的PAMs培養(yǎng)72 h后,反復(fù)凍融3次,4℃條件下14 000 r/min離心10 min,去掉細(xì)胞碎片。取病毒懸液,滴在碳膜銅網(wǎng)放置5 min,用濾紙吸去多余液體,將2%磷鎢酸滴在碳支持膜銅網(wǎng)放置2 min,用濾紙吸去多余液體,室溫干燥。透射電子顯微鏡下觀察,采集圖像分析。

1.2.8 全基因組擴(kuò)增及測序 取陽性病料cDNA,根據(jù)表1的引物,用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增以獲得病毒的基因組各片段,PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 3 min;95℃ 15 s,60℃ 15 s,72℃延伸2 min 10 s,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。所得PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖核酸電泳進(jìn)行鑒定。參照諾唯贊膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,將PCR產(chǎn)物連接pCE2 TA/Blunt-Zero載體,并把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單個(gè)菌落置于1 mL含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),菌液PCR鑒定陽性的陽性菌送至北京擎科生物科技有限公司廣州分公司進(jìn)行序列測定。

1.2.9 分離株的全基因組序列分析 用生物學(xué)軟件對(duì)分段克隆的10條相互重疊的基因片段進(jìn)行全基因序列拼接,得到分離株的全基因序列。用DNAstar軟件中的MegAlign7.1(Clustal W)對(duì)PRRSV分離株的全基因組序列和國內(nèi)外58株參考毒株全基因組序列進(jìn)行核苷酸序列和編碼氨基酸序列的同源性比對(duì)分析。用MEGA7.0軟件(Clustal W Method分析,Neighbor-Joining Method,Bootstrap method值為1000)進(jìn)行全基因組以及ORF5基因遺傳進(jìn)化分析并繪制系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹。用RDP4.0軟件對(duì)分離株GD2022株和58株參考株進(jìn)行全基因組序列重組分析。

2 結(jié)果

2.1 病原的分離結(jié)果

第5代病毒接種PAMs,48 h后開始出現(xiàn)CPE,上清液RT-PCR檢測為PRRSV1陽性;第8代病毒接種PAMs,48 h內(nèi)可見細(xì)胞皺縮,細(xì)胞破碎等典型CPE(圖1A);正常PAMs狀態(tài)良好(圖1B);接種Marc-145組無CPE現(xiàn)象,且RT-PCR檢測為陰性。疑似從PRRSV陽性樣品中成功分離1株病毒,命名為GD2022株。

A.接毒后的PAMs; B.正常的PAMs

2.2 分離毒株的RT-PCR鑒定結(jié)果

對(duì)第10代病毒分別用豬細(xì)小病毒、豬日本腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、2型豬繁殖與呼吸綜合征病毒、1型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的引物進(jìn)行RT-PCR鑒定。結(jié)果顯示檢測的第10代病毒中只有1型豬繁殖與呼吸綜合征病毒為陽性,其目的條帶大小與預(yù)期條帶大小一致,而豬細(xì)小病毒、豬日本腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、2型豬繁殖與呼吸綜合征病毒5種常見會(huì)引起繁殖障礙的病毒均為陰性(圖2)。該結(jié)果初步表明,分離的病毒為PRRSV-1。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000; 1.陽性對(duì)照; 2.GD2022第10代病毒; 3.PRRSV-2; 4.CSFV; 5.PRV; 6.JEV; 7.PPV; 8.陰性對(duì)照

2.3 分離株間接免疫熒光鑒定

將第10代病毒樣品接種PAMs,36 h后可見明顯CPE,IFA試驗(yàn)結(jié)果顯示,接毒組可檢測到針對(duì)PRRSV N蛋白的特異性熒光(圖3A),而對(duì)照組則無特異性熒光(圖3C),表明所分離病毒為PRRSV。

A～B.PRRSV-1毒株接種PAMs;C～D.陰性對(duì)照

2.4 分離株病毒滴度測定

經(jīng)TCID50測定,GD2022株在PAMs上第10代的病毒含量為106.75TCID50/mL。

2.5 病毒形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)觀察

病毒樣品經(jīng)負(fù)染在透射電子顯微鏡下可見圓形或橢圓型的病毒粒子,直徑約40～80 nm(圖4)。

圖4 病毒粒子透射電鏡觀察

2.6 全基因序列擴(kuò)增結(jié)果

以陽性病料的cDNA為模板,用表1的特異性引物擴(kuò)增病毒基因組的重疊片段,并連接pCE2 TA/Blunt-Zero載體,結(jié)果分段擴(kuò)增該毒株的基因組片段成功構(gòu)建重組質(zhì)粒,各片段重組質(zhì)粒通過通用引物驗(yàn)證,各片段大小與預(yù)期相符(圖5)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000; 1～10.片段1～10

2.7 全基因組測序結(jié)果

各片段測序結(jié)果通過生物學(xué)軟件拼接校正后,得到GD2022株基因組全長為15058個(gè)核苷酸(不含polyA尾)5′UTR長222 nt,3′UTR長114 nt,與公布的PRRSV-1序列長度相似,全基因序列已上傳GenBank,登錄號(hào)為OQ606399。

2.8 全基因組同源性分析

用MegAlign7.1和MEGA7.0軟件對(duì)GD2022和58株國內(nèi)外PRRSV參考毒株進(jìn)行核苷酸序列同源性分析,結(jié)果分離株GD2022與PRRSV-1毒株同源性為77.4%～87.0%,與PRRSV-1代表毒株(LV株)同源性最高為87.0%,與PRRSV-2代表毒株(VR2332株)同源性僅為59.7%。

2.9 全基因組遺傳進(jìn)化分析

GD2022株全基因序列與國內(nèi)外55株P(guān)RRSV參考毒株全基因組進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。PRRSV被定義為兩種不同的病原,LV為代表的PRRSV-1(歐洲型)和以VR-2332為代表的PRRSV-2(美洲型),PRRSV-2單獨(dú)成一分支。遺傳進(jìn)化樹結(jié)果顯示,GD2022株處于PRRSV-1大分支中的一小分支,且與PRRSV-1疫苗毒遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)(圖6)。圖6中“●”為GD2022株,“▲”為PRRSV-1疫苗毒株。基于ORF5基因進(jìn)行的遺傳進(jìn)化分析,結(jié)果顯示分離株與報(bào)道的PRRSV-1毒株均屬1亞型,但在遺傳進(jìn)化樹中單獨(dú)成一分支(圖7),圖7中“●”為GD2022株。

圖6 PRRSV全長基因組序列的遺傳進(jìn)化分析

圖7 基于ORF5基因的遺傳進(jìn)化分析

2.10 編碼蛋白的缺失與突變結(jié)果分析

將GD2022毒株GP3、GP4和GP5編碼蛋白的氨基酸序列與國內(nèi)毒株和經(jīng)典毒株(LV株)進(jìn)行比較分析。GD2022毒株在ORF3和ORF4重疊區(qū)域有3個(gè)核苷酸(nt)缺失,導(dǎo)致GP3和GP4蛋白分別在第245和第65aa位點(diǎn)缺失了1個(gè)氨基酸(圖8A和圖8B);ORF5基因編碼的GP5蛋白氨基酸序列與LV株比較,在GP5蛋白中和抗原表位有1處發(fā)生突變,即第33氨基酸位點(diǎn)(D→A),在高變區(qū)有2處發(fā)生突變,第56氨基酸位點(diǎn)(D→A)和第63氨基酸位點(diǎn)(G→D)(圖8C)。

圖8 GP3、GP4、GP5結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列比對(duì)

2.11 重組分析

在默認(rèn)參數(shù)下用RDP4軟件7種檢測方法(RDP、GENCONV、MaxChi、Chimaera、BootScan、3Seq、SiScan)進(jìn)行重組分析,結(jié)果顯示GD2022株無重組事件發(fā)生,推測GD2022株不存在重組現(xiàn)象。通過一系列驗(yàn)證GD2022株為1株P(guān)RRSV新毒株。

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。早在20世紀(jì)80年代美國首次報(bào)道PRRSV,20世紀(jì)90年代傳進(jìn)我國,在我國豬群中長期流行并發(fā)生廣泛變異[6-7]。隨后國內(nèi)多地豬群都相繼感染該病毒[8]。相比PRRSV-2,我國首株P(guān)RRSV-1報(bào)道較晚,2006年首次分離鑒定,隨后國內(nèi)多地報(bào)道PRRSV-1毒株的出現(xiàn)[9],表明PRRSV-1和PRRSV-2在我國豬群中同時(shí)存在[10]。由于PRRSV免疫交叉保護(hù)弱和容易發(fā)生重組[11],我國對(duì)PRRSV-1的流行情況、遺傳變異等相關(guān)研究較少,需關(guān)注和監(jiān)測PRRSV-1在國內(nèi)的流行情況[12]。

針對(duì)廣東某規(guī)模化豬場繁殖障礙母豬進(jìn)行了采樣檢測,對(duì)引起繁殖障礙的常見病原進(jìn)行檢測(包括豬細(xì)小病毒、豬日本腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、2型豬繁殖與呼吸綜合征病毒),結(jié)果均為陰性,綜合各種臨床表現(xiàn),懷疑豬群感染了PRRSV-1。經(jīng)過檢測確診豬群為PRRSV-1感染,并用PAMs對(duì)陽性病料進(jìn)行病原的分離,最后成功分離1株P(guān)RRSV-1,命名為GD2022株。為了更好了解PRRSV-1在我國流行的動(dòng)態(tài)和遺傳進(jìn)化信息,對(duì)GD2022株進(jìn)行了全基因測序及序列分析。通過基因克隆、測序、拼接,得到GD2022毒株的全基因組序列,全長為15058個(gè)核苷酸(不含polyA尾)5′UTR長222 nt,3′UTR長114 nt,全基因序列已上傳至GenBank(登錄號(hào):OQ606399),豐富了國內(nèi)PRRSV-1的全基因序列的數(shù)據(jù)庫。通過序列分析比較,發(fā)現(xiàn)該毒株GP3和GP4編碼蛋白重疊區(qū)分別在第245 aa位和第65 aa位缺失了1個(gè)氨基酸,GP5蛋白高變區(qū)有兩處發(fā)生了突變,為第56 aa位(D→A)和第63 aa位(G→D),這種缺失和變異的出現(xiàn)與國內(nèi)的其他PRRSV-1參考毒株有所區(qū)別,顯示了PRRSV-1的持續(xù)變異性,但所發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)突變對(duì)PRRSV的毒力、致病性等影響目前尚不清楚,需進(jìn)一步研究。

本研究所分離毒株GD2022株基因組同源性分析結(jié)果、系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹結(jié)果和中和抗原表位的突變等均顯示其與國外疫苗毒株存在顯著差異,國內(nèi)尚未見商品化的PRRSV-1疫苗,即使采用國外疫苗進(jìn)行免疫,根據(jù)上述變異結(jié)果推測其對(duì)豬群所提供的的保護(hù)作用可能也不夠,因此,該毒株的成功分離為后期PRRSV致病機(jī)制研究、診斷制劑和新型疫苗的研發(fā)打下了基礎(chǔ)。