劉廣闊,吳發(fā)興,于皓同,王凱茸,張銳錚,張 琪*,許信剛*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 國家動(dòng)物血清庫,山東青島 266114)

偽狂犬病(Pseudorabies,PR)又稱為奧葉基氏病(Aujeszky disease,AD),是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的具有傳染性的病毒性疾病。自該病毒報(bào)道以來[1],距今已有210年的歷史。雖然豬是此病毒的唯一自然宿主,但其在人與其他哺乳動(dòng)物中仍具有廣泛的宿主,如山羊感染PRV后常以死亡告終[2],給養(yǎng)羊場(chǎng)(戶)造成很大損失。

近年已有血清學(xué)技術(shù)及分子生物學(xué)方法用于偽狂犬病的診斷,但大部分血清學(xué)方法無法用于羊偽狂犬病的診斷,而病毒分離和分子生物學(xué)方法中的PCR、qPCR技術(shù)所需要的試驗(yàn)條件在中小型養(yǎng)殖場(chǎng)難以達(dá)成。因此,開發(fā)羊偽狂犬病診斷的血清學(xué)方法非常必要。近年采用的血清學(xué)檢測(cè)方法中[3-9],間接ELISA方法因操作簡(jiǎn)單,所依賴的試驗(yàn)條件較低,并且具有較高的特異性和敏感性,在病原及抗體檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。本研究在克隆表達(dá)羊PRV gE蛋白的基礎(chǔ)上,獲得重組蛋白包被酶標(biāo)板,建立檢測(cè)羊源PRV抗體的間接ELISA檢測(cè)方法(gE indirect ELISA,gE-iELISA),國內(nèi)部分羊場(chǎng)用gE基因缺失疫苗對(duì)羊群進(jìn)行免疫,該方法可以區(qū)分野毒感染和免疫接種動(dòng)物,gE-iELISA方法填補(bǔ)了羊偽狂犬病血清學(xué)檢測(cè)方法的空白,為規(guī)?；驁?chǎng)提供了一種可供選擇的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 羊偽狂犬病病毒(SDPD-14)由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國家動(dòng)物血清庫(以下簡(jiǎn)稱血清庫)鑒定、分離與保存。pET-32a(+)載體購于博邁德基因技術(shù)有限公司,DH5α感受態(tài)細(xì)胞、BL21(DE3)細(xì)胞購于天根生物科技有限公司。

1.1.2 血清樣品 羊偽狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、羊偽狂犬病病毒抗體陰性血清、羊口瘡病毒陽性血清、羊痘病毒陽性血清由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國家動(dòng)物血清庫鑒定并保存;羊口蹄疫A型及O型病毒抗體陽性血清為北京金諾百泰生物技術(shù)有限公司試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品,檢測(cè)中使用的376份山羊臨床血清樣品采自云南、陜西、山東部分地區(qū)山羊場(chǎng)。

1.1.3 主要試劑 DNA/RNA提取試劑盒,西安天隆科技有限公司產(chǎn)品;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)?？焖傩√嵩噭┖?、T4 DNA連接酶,天根生物科技有限公司產(chǎn)品;PrimeSTAR?HS、BamHⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶,Takara公司產(chǎn)品;TMB顯色液,北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;Ni-NTA His Bind Resin鎳柱,七海復(fù)泰生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 NP968核酸提取儀、基因擴(kuò)增熱循環(huán)儀,西安天隆科技有限公司產(chǎn)品;OSE-470P TGel藍(lán)光凝膠成像儀,北京天根生物科技有限公司產(chǎn)品;精騏恒溫振蕩器,捷美電子有限公司產(chǎn)品;Flash Max 850型光吸收酶標(biāo)儀,閃譜生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考此前本實(shí)驗(yàn)室對(duì)SDPD-14株的測(cè)序結(jié)果(KY398797.1),用Primer 5.0進(jìn)行特異性引物的設(shè)計(jì)(表1)。

表1 gE基因引物序列

1.2.2 羊PRVgE基因擴(kuò)增與重組表達(dá)載體構(gòu)建 用DNA/RNA提取試劑盒與NP968核酸提取儀提取PRV SDPD-14株的基因組,以得到的DNA為模板,用1.2.1中的特異性引物進(jìn)行g(shù)E基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為:PrimeSTAR HS 10 μL,gE-F/gE-R各1 μL,DNA模板2 μL,用RNase-free ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 5 min;95℃ 30 s,58℃ 45 s,72℃ 1 min,30次循環(huán);72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)電泳判定是否得到目的條帶。膠回收目的片段后,經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切并與相同酶雙酶切的pET-32a(+)載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定,將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-32a-gE。

1.2.3 重組gE蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 取1.2.2中的pET-32a-gE重組質(zhì)粒10 μL轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,通過菌液PCR篩選出陽性表達(dá)菌株,表達(dá)前先將菌株活化,按照1∶100的比例轉(zhuǎn)接于含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中,置于搖床37℃、220 r/min培養(yǎng)120 min測(cè)定其OD600nm值,當(dāng)OD600nm值為0.6～0.8時(shí),加入不同濃度的IPTG(使IPTG的最終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)對(duì)表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo),37℃繼續(xù)培養(yǎng)8 h。離心收集菌體沉淀,處理后經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳以確定最佳誘導(dǎo)濃度。以最佳誘導(dǎo)濃度在37℃下對(duì)菌液進(jìn)行誘導(dǎo),在2～8 h內(nèi)每間隔1 h離心后收集沉淀。通過SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.2.4 重組gE蛋白的表達(dá)形式的確定及純化 參照1.2.3結(jié)果,大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,誘導(dǎo)結(jié)束后離心并收集沉淀。將沉淀重懸后進(jìn)行超聲破碎,分別將離心得到的上清液、超聲裂解后的上清液與沉淀各取30 μL,用2×蛋白上樣緩沖液進(jìn)行制樣,通過SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果確定目的蛋白所在區(qū)間以明確重組gE蛋白的表達(dá)形式。用鎳柱對(duì)重組gE蛋白進(jìn)行純化,用不同濃度尿素透析復(fù)性重組蛋白,用BCA蛋白定量方法測(cè)定重組蛋白濃度。

1.2.5 重組gE蛋白的Western blot分析 將1.2.4中復(fù)性得到的重組gE蛋白制樣后進(jìn)行SDS-PAGE,將目標(biāo)區(qū)域切下,在半干轉(zhuǎn)膜儀上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將膜取下后用5%脫脂奶粉液封閉2 h,隨后將其置1∶200稀釋的羊偽狂犬病毒陽性血清中在4℃孵育12 h,次日洗膜后用1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記兔抗山羊IgG在室溫下孵育1.5 h,洗膜后滴加ECL發(fā)光液至膜上,棄去多余液體后進(jìn)行曝光。

1.2.6 gE-iELISA檢測(cè)方法的建立、優(yōu)化與應(yīng)用

1.2.6.1 抗原包被量、一抗及酶標(biāo)二抗稀釋度的確定 用三因素正交試驗(yàn)確定最優(yōu)條件,分別用1、2、4、8 μg/mL的gE蛋白包被酶標(biāo)板;羊偽狂犬病毒陽性及陰性血清分別采用為1∶50、1∶100、1∶200稀釋度;HRP標(biāo)記兔抗山羊IgG的稀釋比例分別為1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000,進(jìn)行間接ELISA,操作步驟參照文獻(xiàn)[10],根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算P/N,將P/N最大組合確定為抗原包被量、血清和酶標(biāo)抗體的最佳工作條件。

1.2.6.2 其他試驗(yàn)條件的優(yōu)化 在1.2.6.1中確定的最佳工作條件下,37℃分別以60、90、120 min的孵育時(shí)間對(duì)脫脂奶粉封閉時(shí)間、一抗及二抗孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化;以15、30、45 min進(jìn)行TMB顯色時(shí)間的優(yōu)化,將P/N最大組確定為最適封閉時(shí)間、孵育時(shí)間和顯色時(shí)間。

1.2.6.4 特異性試驗(yàn) 在1.2.6.1及1.2.6.2中確定的最適條件下,對(duì)羊痘病毒陽性血清、羊口蹄疫病毒A型及O型陽性血清、羊口瘡病毒陽性血清進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)以羊偽狂犬病病毒陽性血清為陽性對(duì)照,用實(shí)驗(yàn)室保存的SPF山羊陰性血清作為對(duì)照,評(píng)價(jià)建立方法的特異性。

1.2.6.5 靈敏性試驗(yàn) 對(duì)羊偽狂犬病病毒陽性血清分別進(jìn)行1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096的稀釋,同時(shí)設(shè)置陰、陽性對(duì)照,用本研究建立的方法進(jìn)行靈敏性試驗(yàn)。

1.2.6.6 重復(fù)性試驗(yàn) 用同批次表達(dá)純化復(fù)性的重組gE蛋白包被酶標(biāo)板,對(duì)3組不同的羊偽狂犬病病毒陰、陽性血清重復(fù)檢測(cè)3次,根據(jù)結(jié)果評(píng)價(jià)批內(nèi)重復(fù)性;用3組不同批次純化復(fù)性重組gE蛋白包被酶標(biāo)板,分別對(duì)3組不同的羊偽狂犬病毒陰、陽性血清重復(fù)檢測(cè)3次,根據(jù)結(jié)果評(píng)價(jià)批間重復(fù)性。

1.2.6.7 臨床樣本檢測(cè) 以本研究建立的gE-iELISA方法,對(duì)血清庫保存的云南、陜西、山東部分地區(qū)羊場(chǎng)的376份山羊血清進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算羊偽狂犬病病毒的陽性率,并對(duì)此檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用效果做出評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 gE基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒構(gòu)建

以PRV SDPD-14株的DNA為模板,通過PCR擴(kuò)增gE基因,得到639 bp的基因片段(圖1),其大小與預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果一致。對(duì)構(gòu)建得到的pET-32a-gE重組質(zhì)粒使用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后,得到639 bp的目的條帶與約5 000 bp的載體條帶(圖2),結(jié)果與預(yù)期一致,說明重組表達(dá)載體pET-32a-gE構(gòu)建成功。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.gE基因擴(kuò)增產(chǎn)物;2.陰性對(duì)照

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1.重組載體pET-32a-gE經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.誘導(dǎo)的pET-32a空載體;2～6.37℃下0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L的IPTG終濃度條件下誘導(dǎo)8 h的重組pET-32a-gE;7.重組pET-32a-gE未誘導(dǎo)

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.誘導(dǎo)pET-32a空載體;2-8.pET-32a-gE在BL21中誘導(dǎo)2、3、4、5、6、7、8 h的表達(dá)產(chǎn)物

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.菌液上清;2.菌體超聲裂解液上清;3.菌體超聲裂解沉淀;4.純化gE蛋白

2.2 重組gE蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

以不同濃度的IPTG誘導(dǎo)重組菌株表達(dá)目的蛋白。結(jié)果顯示,當(dāng)IPTG終濃度為0.6 mmol/L時(shí),目的蛋白達(dá)到最高產(chǎn)量(圖3);37℃、0.6 mmol/L的IPTG終濃度下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),并在不同的時(shí)間收集菌體,結(jié)果顯示該目的蛋白于8 h時(shí)達(dá)到最高的表達(dá)量(圖4)。

2.3 重組gE蛋白的表達(dá)及純化

在上述最適條件下誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,收集菌體處理后進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果顯示,重組gE蛋白主要在超聲裂解后沉淀中以包涵體形式大量存在,用鎳柱純化得到目的蛋白大小為42 ku(圖5)。

2.4 重組gE蛋白的Western blot鑒定

用羊PRV陽性血清作為一抗對(duì)純化后的重組gE蛋白進(jìn)行Western blot分析,發(fā)現(xiàn)在42 ku處出現(xiàn)一條清晰的特異性條帶。表明重組gE蛋白可以被羊PRV陽性血清特異性識(shí)別,即具有良好的反應(yīng)原性(圖6)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.重組gE蛋白;2.陰性對(duì)照

2.5 最佳工作條件確定

經(jīng)過三因素正交試驗(yàn)可知,當(dāng)重組gE蛋白的抗原包被濃度為1 μg/mL,血清以1∶100比例稀釋,酶標(biāo)二抗以1∶10 000比例稀釋時(shí)P/N最高,將其確定為最佳工作條件(表2)。

表2 抗原包被濃度、血清及酶標(biāo)抗體稀釋比例的確定

2.6 其他優(yōu)化條件結(jié)果

在確定的最佳工作條件下進(jìn)行試驗(yàn),在37℃下進(jìn)行其他條件的優(yōu)化,結(jié)果顯示封閉效果最優(yōu)為5%脫脂奶粉封閉60 min,樣品最佳孵育時(shí)間為60 min,HRP標(biāo)記兔抗山羊酶標(biāo)抗體最適孵育時(shí)間為60 min,TMB最佳顯色時(shí)間為30 min。

2.7 陰陽性臨界值的確定

2.8 特異性試驗(yàn)結(jié)果

用確定的最適條件,對(duì)羊痘病毒、羊口蹄疫A型及O型病毒、羊口瘡病毒陽性血清進(jìn)行檢測(cè),并以羊偽狂犬病毒抗體陽性血清為陽性對(duì)照,羊偽狂犬病毒抗體陰性血清為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示,陰陽性對(duì)照成立,其余血清OD450 nm值均小于0.284,為PRV抗體陰性,證明所建立的PRV gE-iELISA方法具有良好的特異性。

2.9 靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)羊偽狂犬病毒陽性血清分別以1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048、1∶4 096比例稀釋,同時(shí)設(shè)置陰陽性對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,在陰陽性對(duì)照成立的前提下,當(dāng)羊偽狂犬病毒陽性血清稀釋至1∶2 048時(shí),OD450 nm值為0.293,仍大于臨界值,表明建立的方法具有較好的靈敏性。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

用確定的最適條件,分別進(jìn)行批內(nèi)試驗(yàn)(變異系數(shù)為2.45%～5.00%)和批間試驗(yàn)(變異系數(shù)為2.55%～7.41%),變異系數(shù)均不超過10%,表明此方法重復(fù)性良好。

2.11 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

用本試驗(yàn)建立的方法,對(duì)采自云南、陜西、山東部分地區(qū)羊場(chǎng)的376份山羊血清樣本進(jìn)行檢測(cè),其中40份血清呈羊偽狂犬病毒陽性,陽性率為10.6%。

3 討論

2011年新出現(xiàn)的PRV變異株[11],使PR在Bartha-K61株弱毒疫苗免疫過的動(dòng)物中重新暴發(fā)[12],PRV變異株對(duì)易感動(dòng)物和人類的毒力比經(jīng)典株更強(qiáng)[13],本研究建立的gE-iELISA方法對(duì)于目前缺乏相應(yīng)檢測(cè)手段的小型羊場(chǎng)有重要意義。偽狂犬病毒gE蛋白的主要抗原區(qū)集中在52-238位氨基酸[14]。本研究以此為依據(jù),設(shè)計(jì)構(gòu)建原核表達(dá)重組載體的引物,對(duì)gE蛋白的主要抗原區(qū)域進(jìn)行表達(dá),以保證其在用于包被抗原時(shí)具有較高的準(zhǔn)確性。用鎳柱對(duì)表達(dá)的重組gE蛋白進(jìn)行純化,并進(jìn)行Western blot試驗(yàn),結(jié)果表明重組gE蛋白具有良好的反應(yīng)原性,可以作為診斷抗原用于酶標(biāo)板的包被。

此前已在病死山羊的腦組織及肺臟組織中分離到偽狂犬病毒[15],雖然接種了偽狂犬病病毒活疫苗(Bartha-K61),但疫苗的安全性無法得到保障,有關(guān)于注射疫苗后導(dǎo)致羊死亡的報(bào)道[18],說明該病在羊群中的防控仍以病毒的及時(shí)檢出為主。人也可感染偽狂犬病病毒,可引起神經(jīng)癥狀,如眼內(nèi)炎和腦炎,人類對(duì)本病的感染多是由于體表存在傷口。

本研究建立的gE-iELISA方法對(duì)云南、陜西、山東部分羊場(chǎng)收集到的376份山羊血清檢測(cè),PRV陽性率為10.6%,此數(shù)值比2008年青海省的4.65%有所升高[16],說明偽狂犬病病毒在羊群中的感染率呈上升趨勢(shì),應(yīng)予以足夠重視。