桑田，王億平

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，安徽合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽合肥 230031

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是一種漸進(jìn)性疾病，其特點(diǎn)是由于各種原因造成的腎臟結(jié)構(gòu)和功能的改變[1]。全世界約有10%的成年人受到某種形式的CKD 的影響，每年造成120 萬人死亡和2800 萬人的生命損失[2-3]。然而，CKD的致病基因和分子機(jī)制尚未完全闡明。識別與該病相關(guān)的新的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)基因?qū)τ诎l(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點(diǎn)具有重要意義，有助于深入理解CKD 的病理、生理過程，且對提升CKD 的早期診斷和治療具有顯著意義。自噬是一種關(guān)鍵的穩(wěn)態(tài)機(jī)制，可清除各種受損或不需要的細(xì)胞內(nèi)成分，以在應(yīng)激條件下保護(hù)腎細(xì)胞。另外，自噬缺乏會增加腎臟損傷的易感性，導(dǎo)致腎功能下降、線粒體受損蓄積、嚴(yán)重腎纖維化和早期腎衰竭[4-5]。據(jù)報(bào)道，雙酚A（bisphenol A，BPA）可通過升高的自噬相關(guān)基因5（autophagyrelated gene 5，Atg5）、自噬相關(guān)基因7（autophagyrelated gene 7，Atg7）、微管相關(guān)蛋白1A/1B 輕鏈3B（Map1lc3b/ Lc3b）和Beclin-1 基因水平調(diào)節(jié)自噬過程，加劇慢性腎損傷[6]。因此，需進(jìn)一步研究來明確自噬相關(guān)基因在CKD 進(jìn)展中的作用，挖掘潛在的治療中藥，對CKD 的診斷與治療具有重要意義。

本研究旨在通過從基因表達(dá)總表（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫下載的整合基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)來探索自噬相關(guān)基因在腎纖維化中的作用。利用支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）模型確定關(guān)鍵自噬關(guān)鍵基因，對關(guān)鍵基因預(yù)測可能的治療中藥。本研究為研究CKD 的分子機(jī)制和探索治療性中藥提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)搜集

通過人類自噬數(shù)據(jù)庫獲得參與自噬的基因。利用GEO 數(shù)據(jù)庫獲得包含8 名健康對照者和54 例CKD患者的腎組織樣本的GSE66494 數(shù)據(jù)集，基于平臺注釋文件將數(shù)據(jù)集中的探針標(biāo)識轉(zhuǎn)換為基因名，進(jìn)行批次矯正后用于后續(xù)篩選差異表達(dá)基因。

1.2 差異表達(dá)分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析

使用R 包“l(fā)imma”分析232 個(gè)自噬相關(guān)基因在健康對照者和CKD 患者之間的差異表達(dá)水平，在|log2FC|>2 和校正后的P<0.05 的標(biāo)準(zhǔn)下，得到不同的自噬相關(guān)差異表達(dá)基因（differentially expressed autophagy-related genes，DEARGs），并利用ggplot2和pheatmap 包進(jìn)行可視化處理。通過使用用于檢索相互作用基因的搜索工具（STRING 11.0）研究DEARGs 的功能相互作用。然后通過Cytoscape 3.9.1構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction networks，PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.3 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

為進(jìn)一步研究自噬相關(guān)基因DEG 的富集途徑和功能，將基因?qū)隓AVID 6.8，并通過使用R 中的“ggplot2”包進(jìn)一步可視化富集結(jié)果。

1.4 機(jī)器學(xué)習(xí)篩選關(guān)鍵基因

利用基于e1071 包的支持向量機(jī)-遞歸特征消除（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）算法從重要DEG 中篩選特征基因，同時(shí)根據(jù)關(guān)鍵基因在正常樣本和CKD 患者樣本中的表達(dá)情況。利用受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線）評估關(guān)鍵基因診斷CKD 的有效性，并使用pROC 包繪制關(guān)鍵基因的ROC 曲線。

1.5 基于Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫的中藥篩選

利用Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫作為分析工具，將篩選得到的關(guān)鍵基因輸入該數(shù)據(jù)庫進(jìn)行進(jìn)一步分析。通過設(shè)置統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性閾值P<0.05，對基因與相應(yīng)中藥之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行映射，以識別具有潛在治療效果的中藥。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)分析和蛋白質(zhì)相互作用分析

從GEO 數(shù)據(jù)庫提取232 個(gè)自噬相關(guān)基因進(jìn)行差異分析，得到67 個(gè)DEARGs，見圖1A。然后使用STRING 11.0 研究67 個(gè)DEARGs 的功能相互作用，通過Cytoscape 3.9.0 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，如圖1B。

圖1 DEG 的篩選及PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

2.2 GO 生物功能富集分析與KEGG 途徑富集化分析

為進(jìn)一步探索67 個(gè)DEARGs 的富集途徑和功能，將基因?qū)隓AVID 6.8，并使用R 中的“ggplot2”包進(jìn)一步可視化富集結(jié)果。這些基因主要參與大自噬、位于自噬體、主要表現(xiàn)為泛素?樣蛋白連接酶結(jié)合，見圖2A。KEGG 分析表明139 個(gè)DEARGs 主要參與巨自噬、自噬調(diào)節(jié)、細(xì)胞對外部刺激的反應(yīng)等，見圖2B。

圖2 GO 生物功能富集分析與KEGG 途徑富集化分析結(jié)果

2.3 SVM 篩選關(guān)鍵基因

為進(jìn)一步縮小自噬相關(guān)基因的范圍，使用SVMRFE 算法對67 個(gè)CKD 的DEARGs 進(jìn)行進(jìn)一步篩選，見圖3A，得到2 個(gè)自噬關(guān)鍵基因ATF6、GNAI3。繪制ROC 曲線對關(guān)鍵基因的診斷效能進(jìn)行評估，ROC曲線顯示ATF6、GNAI3在曲線下面積（area under the curve，AUC）均接近1，即篩選出的2 個(gè)關(guān)鍵基因?qū)^(qū)分CKD 患者與健康對照者具有較高的診斷效能，見圖3B、圖3D。

圖3 機(jī)器學(xué)習(xí)篩選核心基因

2.4 中藥預(yù)測結(jié)果

將2 個(gè)關(guān)鍵基因定位到Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)P<0.05 為條件篩選治療CKD 的潛在中藥，獲得姜黃、澤瀉、丹參、地黃、五味子等多味中藥，見表1。

表1 關(guān)鍵基因相關(guān)中藥預(yù)測

3 討論

各種慢性進(jìn)展性腎病的最終表現(xiàn)均為腎纖維化，腎纖維化是導(dǎo)致CKD 發(fā)展到終末期腎臟疾病（end-stage kidney disease，ESRD）的主要病理基礎(chǔ)，而自噬在纖維化相關(guān)的CKD 的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[7]。因此，探索和發(fā)現(xiàn)自噬參與腎纖維化的潛在機(jī)制對于發(fā)現(xiàn)CKD 的潛在治療靶點(diǎn)極為重要。

本研究獲得67 個(gè)差異表達(dá)的自噬相關(guān)基因，并用于GO 功能和KEGG 通路分析，綜合DEARGs 的富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因主要與巨自噬密切相關(guān)。在應(yīng)激條件下，巨自噬作為一種生存機(jī)制發(fā)揮重要作用，主要負(fù)責(zé)大分子、細(xì)胞膜和細(xì)胞器的更新，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[8]。這一過程通過循環(huán)利用受損和有毒的細(xì)胞組分，轉(zhuǎn)化為細(xì)胞的構(gòu)建模塊，從而支持細(xì)胞抵御應(yīng)激反應(yīng)并維持能量平衡[9]。此外，巨噬細(xì)胞在調(diào)控炎癥反應(yīng)和纖維化過程中扮演著關(guān)鍵角色[10]。因此，自噬相關(guān)基因可能在腎纖維化的進(jìn)程中起重要作用。

SVM 模型的進(jìn)一步構(gòu)建鑒定出2 個(gè)自噬關(guān)鍵基因ATF6和GNAI3。ATF6（激活轉(zhuǎn)錄因子6）是一種重要的傳感器，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)時(shí)被激活。研究發(fā)現(xiàn)miR-185-5p可通過下調(diào)ATF6改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)并抑制上皮去分化，進(jìn)而改善腎纖維化[11]。其亞型ATF6α下調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體α 促進(jìn)脂毒性誘導(dǎo)的腎小管間質(zhì)纖維化[12]。因此ATF6可能成為防治CKD 的有效靶點(diǎn)。GNAI3（G 蛋白亞基αI3）是一種蛋白質(zhì)編碼基因。與GNAI3相關(guān)的疾病包括耳髁綜合征1和耳髁綜合征[13-14]。有研究表明GNAI3可作為胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子和治療非酒精性脂肪性肝病的潛在新靶點(diǎn)，還被鑒定為川崎病和結(jié)腸炎相關(guān)腫瘤的關(guān)鍵調(diào)控基因[15-18]。然而，GNAI3在CKD 中的作用尚未報(bào)道，需要對該基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。同時(shí)，本研究繪制數(shù)據(jù)集的ATF6、GNAI3的ROC 曲線結(jié)果顯示，ATF6和GNAI3的ROC AUC 接近1，表明這2 個(gè)標(biāo)志物在區(qū)分CKD 患者和非患者方面顯示出高度的診斷效能。但由于樣本量的限制，關(guān)鍵基因的診斷價(jià)值可能需要進(jìn)一步檢驗(yàn)。

近年來中醫(yī)藥在CKD 防治中受到了更多的關(guān)注，在CKD 的發(fā)展至ESRD 的過程中，中醫(yī)藥在緩解臨床表現(xiàn)、減緩疾病進(jìn)展速度及延后腎臟替代療法啟動(dòng)時(shí)間等方面展現(xiàn)出顯著的療效優(yōu)勢。本文以自噬關(guān)鍵基因篩選治療CKD 的潛在中藥，得到丹參、澤瀉、地黃、姜黃和五味子等多味中藥。研究發(fā)現(xiàn)姜黃中的姜黃素具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤等作用，并可通過腺苷酸激活蛋白激酶信號通路促進(jìn)自噬從而減輕大鼠糖尿病腎病的腎臟纖維化[19]。地黃的主要活性成分地黃多糖通過緩解CKD 大鼠冠脈鈣化，抑制冠脈血管平滑肌細(xì)胞中TRPC1/6 蛋白的表達(dá)并促進(jìn)自噬[20]。在單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的大鼠腎臟病理模型中，丹參的主要活性成分丹酚酸B 通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)來發(fā)揮作用。具體而言，丹酚酸B 可通過上調(diào)LC3-Ⅱ和Beclin1 的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的表達(dá)，從而激活自噬過程，并對抗腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展[21]。另外，澤瀉在此模型中展現(xiàn)出對腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的顯著抑制作用，減輕腎間質(zhì)纖維化，并觀察到腎小管上皮細(xì)胞中C3 蛋白表達(dá)的下調(diào)，這表明澤瀉可能通過影響C3 途徑來抑制間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的過程[22]。五味子中的有效成分五味子乙素可能通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白LC3 對缺氧/復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞的凋亡有一定的保護(hù)作用[23]。木通中的有效成分馬兜鈴酸在低劑量引起的腎損傷過程中可能發(fā)生自噬，且自噬減輕腎臟損傷；馬兜鈴酸高劑量引起的腎損傷過程中可能發(fā)生過度自噬，且自噬加重腎臟損傷，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)p53 蛋白表達(dá)相關(guān)[24]。

總之，本研究通過生物信息學(xué)的方法，為CKD與自噬之間聯(lián)系的進(jìn)一步研究提供新的見解和潛在靶點(diǎn)。篩選的關(guān)鍵基因及中藥可為后續(xù)深入理解CKD 的分子機(jī)制和開發(fā)治療藥物奠定理論基礎(chǔ)。本研究存在一定的不足，如關(guān)鍵基因ATF6、GNAI3的表達(dá)水平，可能需要進(jìn)一步的定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和免疫印跡或免疫組織化學(xué)驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。